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    波爾定對(duì)破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能的影響

    2016-08-06 11:07:14徐慧慧趙宏艷王貴黃晶郭明慧肖誠(chéng)
    中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志 2016年3期
    關(guān)鍵詞:波爾骨細(xì)胞分化

    徐慧慧 趙宏艷 王貴 黃晶 郭明慧 肖誠(chéng)

    1. 北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029 2. 中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所,北京 100029 3. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所,北京 100700

    波爾定(Boldine)是從豆豉姜中提取的一種阿樸菲類異喹啉生物堿,豆豉姜為山雞椒Litseacubeba(Lour)Pers.的根及根莖, 是治療風(fēng)濕痹癥的常用藥之一,已有研究證明其對(duì)完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠具有較好的抑制作用[1]。課題組前期研究顯示波爾定可以改善II型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠骨微結(jié)構(gòu)[2],對(duì)CIA大鼠引起的骨質(zhì)疏松具有較好的抑制作用,但具體作用機(jī)制尚未明確。

    正常的骨代謝依賴著骨吸收與骨形成的平衡,若這一過(guò)程受到破壞,骨吸收速度大于骨形成,則會(huì)引起骨量的丟失。破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)在骨吸收這一環(huán)節(jié)扮演著重要角色,其成熟過(guò)程與功能的正常與否將會(huì)直接影響體內(nèi)的骨量,從而進(jìn)一步影響骨組織的微觀結(jié)構(gòu)。所以本課題通過(guò)體外培養(yǎng)OC的方法,觀察波爾定對(duì)OC的分化功能及骨吸收功能的影響,以期探索波爾定改善骨組織微觀結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制。

    1 材料

    1.1 細(xì)胞株

    小鼠單核細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

    1.2 試劑

    高糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素,美國(guó)Gibco公司;胎牛血清(FBS),美國(guó)BioTech公司;小鼠重組核因子κB受體活化因子配基(RANKL),美國(guó)Peprotech公司;牛骨片,英國(guó)Immunodiagnostic Systems Limited公司;RIPA裂解液,美國(guó)Cell Signaling Technology公司;酒石酸鈉,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司;抗酒石酸磷酸酶(Tartrate Resistant Alkaline Phosphatase,TRAP)試劑盒、甲苯胺藍(lán)及磷酸對(duì)硝基苯酯,美國(guó)sigma公司;Trizol試劑,美國(guó)life technologies公司;CCK-8試劑盒,日本DOJINDO公司;引物合成,美國(guó)Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒,日本Takara公司。

    1.3 藥物

    波爾定由北京中醫(yī)藥大學(xué)柴興云博士提供,HPLC檢測(cè)后純度>98%。提取方法如下:總重50kg的干燥豆豉姜藥材,用10倍的95%乙醇提取2次,75%乙醇提取1次,每次2h?;厥找掖己蟮玫娇偨?,氯仿萃取后,加NH3·H2O調(diào)PH10,以正丁醇萃取后經(jīng)硅膠柱色譜分離氯仿-甲醇梯度洗脫,得到18個(gè)流分(LB1-18)。其中的LB10經(jīng)硅膠柱色譜再次分離,乙酸乙酯-甲醇洗脫得到12個(gè)流分(LB10A-L),最終將其中的LB10E經(jīng)ODS柱分離得到波爾定[3]。

    1.4 主要儀器與耗材

    細(xì)胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板,美國(guó)Corning公司;二氧化碳培養(yǎng)箱、Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描熒光酶標(biāo)儀及分光光度計(jì),美國(guó)Thermo Scientific公司;熒光定量PCR儀,美國(guó)Applied Biosystems公司。

    2 方法

    2.1 OC的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

    將RAW264.7細(xì)胞調(diào)節(jié)成2×103個(gè)/孔接種于96孔板中,待細(xì)胞完全貼壁用含50 ng/ml RANKL及10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,每2d換液一次,保持RANKL濃度不變。

    2.2 分組與處理

    按上述方法將RAW264.7細(xì)胞調(diào)節(jié)成2×103個(gè)/孔接種于預(yù)置無(wú)菌蓋玻片或牛骨片的96孔板中,待細(xì)胞完全貼壁用含50 ng/ml RANKL及10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng),同時(shí)加入不同濃度波爾定進(jìn)行干預(yù)。共設(shè)六組,對(duì)照組和濃度分別為1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L的波爾定組,每組平行做三個(gè)復(fù)孔,所有檢測(cè)指標(biāo)重復(fù)三次。

    2.3 破骨樣細(xì)胞計(jì)數(shù)

    按上述方法培養(yǎng)至第4d,按TRAP染色試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行染色,計(jì)算整張玻片破骨樣細(xì)胞(TRAP染色陽(yáng)性且細(xì)胞核多于3個(gè)的為破骨樣細(xì)胞)。

    2.4 TRAP活性檢測(cè)

    細(xì)胞培養(yǎng)至4 d,棄上清,每孔加入50 μl RIPA裂解液,冰上孵育10 min,離心后收集上清,轉(zhuǎn)移至新的96孔板中,加入50 μl TRAP 活性反應(yīng)液(100 mmol/L檸檬酸鈉,pH 5.0,50 mmol/L酒石酸鈉,5 mmol/L磷酸對(duì)硝基苯酯),37℃避光孵育1 h后,加入50 μl的0.1 mol/L NaOH終止反應(yīng),于405 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值。

    2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

    將RAW264.7細(xì)胞以2×103個(gè)/孔的濃度接種至96孔板,按上述方法誘導(dǎo)至第4d,每孔加入10 μl CCK-8反應(yīng)液,37℃避光孵育3 h,于450 nm檢測(cè)吸光度值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

    2.6 骨吸收陷窩分析

    細(xì)胞培養(yǎng)至第9天,取出骨片在 2.5%戊二醛中固定7 min。在 0.25 mol/L 氫氧化銨中以超聲清洗10 min 去除骨片上的細(xì)胞。經(jīng)系列乙醇(體積比分別為40%、75%、95%和100%乙醇)脫水,每次5 min,自然晾干后經(jīng)1%甲苯胺藍(lán)室溫染色5 min,用三蒸水沖洗后在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察,采用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)計(jì)算骨陷窩面積。

    2.7 Real time-PCR方法檢測(cè)RANK、NFATc1和c-fos mRNA表達(dá)

    圖1 不同濃度波爾定對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化影響 (×100),與對(duì)照組(Boldine 0 μmol/L)比較:*P<0.05,**P<0.01Fig.1 TRAP staining shows the effect of boldine on RANKL-induced osteoclast (×100),*P<0.05,**P<0.01 vs control group(Boldine 0 μmol/L)

    細(xì)胞誘導(dǎo)至第4d,棄上清,加入1 ml TRIzol裂解液震蕩混勻至細(xì)胞完全裂解。提取細(xì)胞總RNA,瓊脂糖電泳法檢測(cè)RANK,NFATc1和c-fos mRNA基因濃度及完整性。所用引物為Invitrogen公司合成,引物序列為:RANK (157bp) 上游引物CCATCATCTTCGGCGTTTAC,下游引物TCTTGCTGACTGGAGGTTGC;NFATc1 (197bp)上游引物TCGGCGGGAAGAAGATGGT,下游引物GACTTGGACGGGGCTGGTTA;c-fos (129bp)上游引物CTTGAAGATGAGAAGTCTGCGTT,下游引物CTCTGGGAAGCCAAGGTCAT;內(nèi)參ACTIN (189bp)上游引物AGAGGGAAATCGTGCGTGAC,下游引物CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA。其他方法均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,并進(jìn)行擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,按照2-△△ct相對(duì)定量計(jì)算公式計(jì)算出各組目的基因相對(duì)定量結(jié)果。

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    3 結(jié)果

    3.1 波爾定對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響

    RAW264.7細(xì)胞為圓形的單核細(xì)胞,體積較小。加入RANKL后,單核細(xì)胞逐漸融合匯聚,體積逐漸增大,誘導(dǎo)至4d分化為多核的OC。TRAP為OC特異性標(biāo)志酶,成熟的OC對(duì)TRAP染色呈陽(yáng)性。TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞且細(xì)胞核≥3為破骨樣細(xì)胞。

    與對(duì)照組相比,1 μmol/L和10 μmol/L波爾定對(duì)OC分化有下降趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L波爾定組OC數(shù)量明顯少于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

    3.2 波爾定對(duì)破骨細(xì)胞TRAP活性及毒性的影響

    20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L波爾定組TRAP活性明顯降低,與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。CCK-8結(jié)果顯示各濃度波爾定對(duì)OC均未產(chǎn)生毒性,說(shuō)明波爾定對(duì)OC分化的抑制作用不是藥物毒性所致。結(jié)果見(jiàn)圖2及圖3。

    圖4 不同濃度波爾定對(duì)破骨細(xì)胞所致骨陷窩吸收面積的比較(×100)Fig.4 The effect of boldine on osteoclastic bone resorption area(×100)

    圖2 不同濃度波爾定對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞TRAP活性的比較Fig.2 The effect of boldine on the TRAP activity of RANKL-induced osteoclast

    圖3 不同濃度波爾定對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞毒性的比較Fig.3 The effect of boldine on the cell viability of RANKL-induced osteoclast

    3.3 波爾定對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響

    藥物干預(yù)9d后,骨片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后,對(duì)照組、1 μmol/L和10 μmol/L波爾定組可見(jiàn)明顯骨吸收陷窩,邊界清晰,呈大小不等的圓形或臘腸形。骨吸收陷窩面積隨著波爾定濃度的提高呈減小趨勢(shì),20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L濃度波爾定組陷窩面積明顯低于對(duì)照組(P<0.05,P<0.01)。

    3.4 波爾定對(duì)破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

    與對(duì)照組相比,20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L波爾定可明顯抑制RANK基因的表達(dá)(P<0.05,P<0.01);而且,對(duì)NFATc1和c-fos基因表達(dá)的抑制作用隨著藥物濃度的增加而更加顯著(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖5。

    圖5 不同濃度波爾定對(duì)破骨細(xì)胞分化基因RANK、NFATc1和c-fos mRNA表達(dá)的比較Fig.5 The effect of Boldine on mRNA expression of RANK, NFATc1 and c-fos in osteoclasts

    4 討論

    波爾定是從豆豉姜中提取出的一種阿樸菲類異喹生物堿,有報(bào)道顯示,波爾定能夠作為一種有效的抗氧化劑達(dá)到抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病的效應(yīng),在高血壓和糖尿病大鼠模型中可通過(guò)干擾氧化應(yīng)激介導(dǎo)的信號(hào)通路起到內(nèi)皮保護(hù)作用[4]。另外有研究發(fā)現(xiàn),波爾定可誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞凋亡,降低NF-κB信號(hào)通路的激活,在腫瘤的侵潤(rùn)過(guò)程中起到重要抑制作用[5]。本課題組前期通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示波爾定可以改善CIA大鼠骨組織微觀結(jié)構(gòu),對(duì)CIA大鼠引起的骨質(zhì)疏松具有較好的抑制作用。骨質(zhì)疏松是由于骨代謝的失衡,破骨量大于成骨量所致。OC的分化或其功能的改變所導(dǎo)致的骨改建失衡是骨質(zhì)疏松的重要病理基礎(chǔ)[6]。所以本課題以O(shè)C為切入點(diǎn),以期進(jìn)一步闡明波爾定改善骨組織微觀結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制。

    OC是一類多核巨細(xì)胞主要來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞分化的單核/巨噬細(xì)胞系,在M-CSF和RANKL的存在下,可分化為破骨樣細(xì)胞[7]。目前應(yīng)用較多的是采用小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7誘導(dǎo)OC的方法進(jìn)行研究[8],該細(xì)胞株在RANKL的刺激下可誘導(dǎo)為破骨樣細(xì)胞。抗酒石酸磷酸酶(TRAP)是OC的特異性標(biāo)志酶,通過(guò)TRAP染色可以計(jì)數(shù)OC的數(shù)量,本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)20μmol/L波爾定即可抑制OC分化,更高濃度波爾定的抑制作用則更加明顯;TRAP活性檢測(cè)也得到了相同的研究結(jié)果。為進(jìn)一步檢測(cè)OC的功能,我們采用OC與牛骨片共培養(yǎng)的方法,進(jìn)一步顯示波爾定可明顯抑制OC的骨吸收功能。

    RANK是RANKL的受體,位于OC及其前體細(xì)胞的細(xì)胞膜表面上。在OC成熟過(guò)程中,RANK發(fā)揮重要作用。當(dāng)與RANKL結(jié)合后可促進(jìn)單核細(xì)胞聚集從而分化為成熟的OC[9],本研究發(fā)現(xiàn)20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的波爾定可顯著抑制RANK mRNA的表達(dá),說(shuō)明波爾定可能是通過(guò)降低RANK的表達(dá),從而阻止其與RANKL的結(jié)合,從而抑制OC前體細(xì)胞的成熟來(lái)達(dá)到抑制OC分化和功能的目的。在OC分化過(guò)程中c-fos是一種重要調(diào)控因子,通過(guò)啟動(dòng)NFATc1促進(jìn)OC的分化與骨吸收功能[10]。NFATc1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,其與c-fos在OC融合過(guò)程發(fā)揮重要作用[11],已有研究顯示NFATc1在無(wú)RANKL的條件下亦可刺激前體細(xì)胞分化成OC[12]。本研究顯示波爾定抑制了OC中NFATc1和c-fos的mRNA表達(dá)。

    綜上,波爾定可以抑制OC分化成熟相關(guān)的特異性基因RANK、NFATc1和c-fos的表達(dá),從而影響OC的分化成熟及骨吸收功能,這一研究為進(jìn)一步闡明波爾定改善骨組織微觀結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制提供了依據(jù)。

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