調(diào)督理筋針法聯(lián)合撳針對腰椎間盤突出癥大鼠Akt/GSK3β通路及痛覺過敏的影響?

鄭麗婭，賈松濤，喬兆輝，朱學(xué)亮，牟成林，沈向楠，武佐元△

(1.邢臺市人民醫(yī)院，河北 邢臺 054000；2.河北省中醫(yī)院，石家莊 050000；3.內(nèi)丘縣中醫(yī)院，河北 邢臺 054200)

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)是臨床常見的疾患之一，主要是因腰椎間盤髓核部位發(fā)生退行性改變，引起纖維環(huán)破裂、髓核從破裂處突出或脫出、相鄰脊神經(jīng)根遭受到壓迫或刺激，進而產(chǎn)生的腰部疼痛、下肢疼痛、坐骨神經(jīng)痛等一系列臨床癥狀，對患者的生活質(zhì)量造成較大影響[1，2]。LDH髓核病變常會導(dǎo)致病理性神經(jīng)痛，使機體對疼痛的敏感度增高。最近的研究顯示，突出髓核受到壓迫的神經(jīng)根、脊神經(jīng)節(jié)等引發(fā)的炎癥反應(yīng)均可引起機體痛覺過敏[3]。蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)通路與炎性細胞的分泌及遷移密切相關(guān)。資料顯示，Akt參與神經(jīng)病理疼痛形成、維持過程，GSK3β是GSK3的一個亞型，是Akt的下游效應(yīng)分子，活化的Akt使GSK3β發(fā)生磷酸化，高表達的GSK3β對機體炎癥反應(yīng)具有增加作用，因此推測活化的Akt/GSK3β通路對于LDH所致機體痛覺過敏可能有不利影響[4-6]。中醫(yī)認為LDH是由于感染風(fēng)、寒、濕等導(dǎo)致氣血運轉(zhuǎn)不暢、勞累、瘀血等，最終發(fā)展為腰痛[7]，調(diào)督理筋針法是通過調(diào)督經(jīng)脈、理筋通絡(luò)等方法使機體經(jīng)脈通暢、氣血旺盛，從而達到緩解腰疼的作用[8]。撳針療法具有固定性好、刺激強烈等優(yōu)點，對于肩周炎、LDH等經(jīng)絡(luò)病具有一定的療效[9]。本文通過建立LDH大鼠模型，研究調(diào)督理筋針法聯(lián)合撳針對LDH大鼠痛覺過敏及Akt/GSK3β通路的影響。本研究通過邢臺市人民醫(yī)院倫理委員會審查(批準(zhǔn)號LLSH2020027)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康SD雄性大鼠約3月齡，體質(zhì)量270～310 g，購自北京科興中維生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2019-0027。所有實驗大鼠于邢臺市人民醫(yī)院動物房中飼養(yǎng)，相對濕度55%，溫度25 ℃，自然光照，自由進食飲水，每周清潔一次鼠籠、保持動物房環(huán)境通風(fēng)、整潔，每天更新食物及飲用水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑及儀器

蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，批號E607218-0200)；大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、兔抗鼠Akt、GSK3β、磷酸化Akt(phosphorylated-Akt，p-Akt)、磷酸化GSK3β(phosphorylated-GSK3β，p-GSK3β)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗、羊抗鼠二抗(批號ab160017、ab30227、ab208348、ab197742、ab234570、ab00271、ab09767、ab181602、ab150077，美國Abcam公司)；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(上海碧云天公司，批號P0027、P0011)等。

37450爪觸覺測試儀、38450電子觸覺測量儀、37370足底熱刺激儀，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；RM2125RTS手動輪轉(zhuǎn)式切片機，德國Leica公司；SMZ745光學(xué)顯微鏡，日本尼康公司；XElx800酶標(biāo)儀，美國Perkin Elmer公司；1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司；GIS-500凝膠成像儀，杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LDH動物模型制備 按參考文獻[10]制備LDH大鼠模型，將100只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組20只和LDH組80只。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)將大鼠麻醉，除去背部毛發(fā)并進行皮膚消毒，在背部正中以L5棘突為中心行縱向切口，依次切開皮膚、腰背筋膜、肌肉，暴露雙側(cè)L4、L5椎板并切除L4半椎板、下關(guān)節(jié)突和L5上關(guān)節(jié)突，暴露右側(cè)L4、L5背根神經(jīng)節(jié)，于鼠尾近根部切斷尾椎并取出髓核，將髓核移植到右側(cè)L4、L5神經(jīng)節(jié)周圍，不造成機械壓迫，縫合傷口，術(shù)后3 d每只大鼠每日注射一次青霉素(4×105U)防止感染，假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)L4、L5椎板。

1.3.2 分組及治療方法 將建模成功的LDH大鼠模型按照隨機數(shù)字法分為模型組、調(diào)督理筋針法治療組(以下簡稱調(diào)督組)、撳針治療組(以下簡稱撳針組)、調(diào)督理筋針法聯(lián)合撳針治療組(以下簡稱聯(lián)合組)，每組各20只。治療組于造模后第5天開始干預(yù)。調(diào)督組以手捻針針刺腰陽關(guān)、后溪、命門、腎俞、腰部夾脊、大腸俞、八髎，每5 min行針1次，留針30 min；撳針組在對應(yīng)穴位行撳針埋針法；聯(lián)合組在調(diào)督理筋針法治療的基礎(chǔ)上運用撳針留針治療，對應(yīng)穴位針刺后行撳針留置24 h處理，持續(xù)治療2周。模型組及假手術(shù)組不做治療，每次治療前要對相應(yīng)穴位及針進行消毒，穴位定位參照《中國獸醫(yī)針灸學(xué)》[11]。

1.3.3 大鼠行為學(xué)及運動功能觀察 根據(jù)盲法原則于每天上午9∶00～11∶00觀察各組大鼠的行為變化，包括有無撕咬、煩躁、頻繁搖動尾巴、食欲下降、下肢運動障礙、后肢突然抬起等現(xiàn)象。將大鼠放至開闊場地觀察其運動功能，請專業(yè)人員對其運動功能評分：步態(tài)正常記為0分，步態(tài)輕度跛行記為1分，后肢無力呈中度跛行記為2分，后肢輕度癱瘓、明顯跛行記為3分，分值越高說明運動功能越差。

1.3.4 大鼠機械性痛覺過敏測定 將大鼠置于爪觸覺測試儀玻璃箱中，測試之前適應(yīng)30 min，將電子觸覺測量儀對準(zhǔn)大鼠的足底部，記錄大鼠縮足時電子觸覺測量針的刺激力度，記錄各組大鼠右后爪治療前24 h、治療后24 h的機械刺激縮足反射閾值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)。

1.3.5 大鼠熱痛覺過敏測定 將大鼠置于足底熱刺激儀玻璃箱中，測試之前適應(yīng)30 min，用熱輻射刺激儀照射大鼠足底部的玻璃板，記錄從照射開始到大鼠縮足所經(jīng)歷的時間，記為熱刺激縮足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)，最大值為30 s，分別記錄各組大鼠右后爪治療前24 h、治療后24 h的PWTL值。

1.3.6 取材及材料處理 痛覺實驗測定結(jié)束后24 h，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)將大鼠麻醉，經(jīng)心臟取血3～5 mL，置于特定離心管中，室溫靜置20 min，4 ℃下3500 r/pm離心10 min，取血清置于-20 ℃冰箱中保存待用。

取10只大鼠的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)：大鼠麻醉后仰臥，開胸并剪開左心耳，依次用400 mL生理鹽水灌洗、400 mL 4%多聚甲醛灌注固定，灌注結(jié)束后立即取大鼠右側(cè)L5 DRG，于4%多聚甲醛中固定，4 ℃保存待用。取10只大鼠L2-L3節(jié)段剪斷后采集脊髓，4 ℃保存待用。

1.3.7 大鼠DRG形態(tài)學(xué)觀察 取1.3.6中DRG經(jīng)低到高濃度梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后進行切片處理，得到常規(guī)病理切片，以二甲苯脫蠟、高濃度到低濃度梯度酒精處理后，使用HE試劑盒染色，具體操作步驟參照說明書進行，經(jīng)再次脫水、透明后封片于普通光學(xué)顯微鏡中觀察。

1.3.8 ELISA法測定大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平 根據(jù)ELISA試劑盒中說明書進行血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的測定。

1.3.9 大鼠脊髓Akt/GSK3β通路相關(guān)蛋白表達檢測 采用蛋白提取試劑盒提取大鼠L2-L3節(jié)段處脊髓中的總蛋白，參照BCA試劑盒說明書要求測定蛋白濃度，8%分離膠及5%濃縮膠進行電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉(5%)室溫封閉2 h后添加Akt、GSK3β、p-Akt、p-GSK3β一抗、內(nèi)參GAPDH(稀釋比均為1∶1000)4 ℃孵育過夜，用TBST緩沖液洗滌后添加羊抗鼠二抗(1∶5000)，室溫孵育2 h。采用蛋白成像凝膠儀對Akt、GSK3β、p-Akt、p-GSK3β蛋白水平進行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)及運動功能觀察

表1示，假手術(shù)組大鼠行為正常，模型組大鼠有輕微煩躁、舔舐后爪、后肢運動障礙等現(xiàn)象，調(diào)督組、撳針組、聯(lián)合組大鼠煩躁、舔舐后爪、后肢運動障礙等現(xiàn)象均得到一定的緩解。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠運動功能評分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，調(diào)督組、撳針組、聯(lián)合組大鼠運動功能評分顯著降低(P<0.05)；調(diào)督組和撳針組大鼠運動功能評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與調(diào)督組和撳針組比較，聯(lián)合組大鼠運動功能評分降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠運動功能評分比較

2.2 各組大鼠PWMT、PWTL比較

表2示，治療前24 h與假手術(shù)組比較，模型組、調(diào)督組、撳針組、聯(lián)合組大鼠PWMT、PWTL顯著降低(P<0.05)。治療后24 h與模型組比較，調(diào)督組、撳針組、聯(lián)合組大鼠PWMT、PWTL顯著升高(P<0.05)；調(diào)督組和撳針組大鼠PWMT、PWTL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與調(diào)督組和撳針組比較，聯(lián)合組大鼠PWMT、PWTL升高(P<0.05)。與治療前24 h比較，調(diào)督組、撳針組、聯(lián)合組治療后PWMT、PWTL顯著升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠PWMT、PWTL比較

2.3 各組大鼠DRG組織病理觀察

圖1示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠DRG神經(jīng)元細胞排列紊亂，呈現(xiàn)明顯水腫，核膜模糊、核仁偏移，細胞間隙較大；與模型組比較，調(diào)督組、撳針組、聯(lián)合組大鼠的DRG神經(jīng)元細胞形態(tài)均有一定的改善，其中聯(lián)合組改善效果較優(yōu)。

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

表3示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，調(diào)督組、撳針組、聯(lián)合組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)；調(diào)督組和撳針組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與調(diào)督組和撳針組比較，聯(lián)合組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

2.5 各組大鼠脊髓Akt/GSK3β通路相關(guān)蛋白表達水平比較

圖2表4示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓中p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，調(diào)督組、撳針組、聯(lián)合組大鼠脊髓中p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；調(diào)督組和撳針組大鼠脊髓中p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與調(diào)督組和撳針組比較，聯(lián)合組大鼠脊髓中p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表達水平降低(P<0.05)。

圖2 各組大鼠脊髓Akt/GSK3β通路相關(guān)蛋白印跡圖

表4 各組大鼠脊髓Akt/GSK3β通路相關(guān)蛋白表達水平比較

3 討論

LDH致腰腿神經(jīng)痛是骨科常見的疾病，近年來的發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，其中以學(xué)生、司機等長期采用坐姿的人群患病較多，LDH引起的炎癥對于坐骨神經(jīng)痛的發(fā)生具有不利影響[12，13]，因此需要建立更接近臨床的動物模型，進一步研究LDH及其引發(fā)神經(jīng)痛的作用機制。程杰[14]等通過自體髓核移植術(shù)建立LDH大鼠模型，模型組大鼠的痛閾值顯著降低，該方法可較好地誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)行為的改變，與臨床接近且對大鼠損傷較小。本研究通過將大鼠尾部髓核移植到L4-L5神經(jīng)節(jié)周圍建立大鼠LDH模型，結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，行自體髓核移植術(shù)后的LDH模型大鼠有輕微煩躁、舔舐后爪、后肢運動障礙等現(xiàn)象，運動功能評分顯著升高，PWMT、PWTL值顯著降低，DRG神經(jīng)元細胞損害嚴(yán)重，與相關(guān)研究結(jié)果類似，表明移植的髓核對大鼠神經(jīng)節(jié)造成一定的壓迫及損害，揭示LDH大鼠模型構(gòu)建成功。

LDH常會導(dǎo)致坐骨神經(jīng)痛、神經(jīng)功能紊亂等，易引發(fā)機體的痛覺過敏。資料顯示，神經(jīng)痛主要與神經(jīng)根機械性壓迫、炎癥反應(yīng)等化學(xué)性損傷密切相關(guān)[15]。Bishop[16]等研究結(jié)果顯示，LDH患者血清中TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達水平較高，經(jīng)過治療LDH患者的神經(jīng)痛得到緩解，血清中炎癥因子水平呈現(xiàn)下降趨勢。調(diào)督理筋針法通過調(diào)理督脈使機體氣血通暢，針刺腰陽關(guān)、命門、八髎、腎俞等穴位以調(diào)和督脈及理筋通絡(luò)。牟成林[17]等發(fā)現(xiàn)，調(diào)督理筋針法對于LDH引起的疼痛具有一定的療效。撳針療法是一種埋藏于皮下的新型針灸方法，對于穴位有柔和、持久穩(wěn)定的刺激，研究發(fā)現(xiàn)撳針治療具有一定的止痛效果，對于LDH所引發(fā)的神經(jīng)疼痛可能具有一定的療效[18]。本文采用調(diào)督理筋針法、撳針療法二者聯(lián)合療法處理LDH大鼠，觀察其對大鼠痛覺過敏的影響。結(jié)果顯示與模型組比較，經(jīng)過治療各組大鼠的運動功能評分顯著降低，PWMT、PWTL值顯著升高，DRG神經(jīng)元細胞狀態(tài)得到改善，大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低，其中調(diào)督理筋針法與撳針療法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，二者聯(lián)合治療效果最優(yōu)，表明調(diào)督理筋針法及撳針療法具有降低LDH大鼠血清中炎癥因子水平、緩解DRG神經(jīng)元細胞損傷及LDH大鼠痛覺過敏的作用，但其具體機制尚不清晰，二者聯(lián)用效果更佳，可能原因是撳針治療對于腰陽關(guān)、命門等穴位的刺激更加持久且穩(wěn)定，對于筋絡(luò)的疏通、督脈的調(diào)和等方面具有較好的促進作用。

研究發(fā)現(xiàn)，Akt/GSK3β通路與大鼠神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生聯(lián)系密切。GSK3β是Akt的重要反應(yīng)底物，Akt的磷酸化可導(dǎo)致GSK3β的活化，進而導(dǎo)致機體炎癥因子增加[19]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制GSK3β的活性可顯著降低機體內(nèi)炎癥因子的表達及炎癥反應(yīng)的發(fā)生[20，21]，對于LDH大鼠引起的疼痛過敏可能具有一定的緩解。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，各治療組脊髓中p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表達水平顯著降低且聯(lián)合組最低，表明調(diào)督理筋針法及撳針療法可能是通過調(diào)節(jié)Akt/GSK3β通路相關(guān)蛋白表達來發(fā)揮其降低大鼠炎癥反應(yīng)及緩解大鼠痛覺過敏的作用。

綜上所述，調(diào)督理筋針法、撳針療法對LDH大鼠所引發(fā)的痛覺過敏具有一定的緩解作用，可能通過調(diào)節(jié)Akt/GSK3β通路相關(guān)蛋白表達，降低機體內(nèi)的炎癥反應(yīng)來實現(xiàn)，但未用相關(guān)通路抑制劑進行對比仍需進一步研究。