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    生脈飲對阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用研究?

    2022-09-21 00:39:38崔海峰馮淑怡石曉路孫明杰孫麗華
    關(guān)鍵詞:生脈阿霉素存活率

    崔海峰,彭 博,馮淑怡,黃 穎,石曉路,武 乾,孫明杰,孫麗華△

    (1.北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點實驗室,北京 100700;2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心,北京 100700;3.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京 100700)

    阿霉素(adriamycin,ADM)為蒽環(huán)類抗生素,因抗瘤譜廣、療效確切,廣泛用于腫瘤的化學(xué)治療。但ADM與心肌組織有高親和性,體內(nèi)累積劑量達(dá)到500~550 mg/m2時,充血性心力衰竭、擴(kuò)張型心肌病甚至死亡的發(fā)生風(fēng)險都顯著提高[1]。因此,預(yù)防和減輕阿霉素心肌毒性一直是臨床應(yīng)用首要考慮的問題,也是近年來業(yè)界關(guān)注的熱點問題之一。生脈飲是傳統(tǒng)經(jīng)典方劑生脈散的不同劑型,由紅參、麥冬、五味子組成,能夠改善心肌供血,緩解心衰癥狀,增加化療藥物的抗腫瘤作用[2],但其是否能夠在體外保護(hù)阿霉素引起的心肌細(xì)胞損傷至今鮮有報道?;诖耍狙芯客ㄟ^ADM損傷心肌細(xì)胞的體外模型,評價生脈飲對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,為生脈飲減輕ADM心肌毒性提供實驗依據(jù)。

    1 材料

    1.1 藥物

    生脈飲由釣魚臺醫(yī)藥集團(tuán)吉林天強(qiáng)制藥股份有限公司提供,國藥準(zhǔn)字Z22022398,規(guī)格10 mL/支。

    1.2 細(xì)胞株

    H9c2大鼠胚胎心肌細(xì)胞為本室傳代保存細(xì)胞株。

    1.3 主要試劑及儀器

    Hyclone DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher公司,貨號SH30243.01);Gibco胎牛血清(美國Invitrogen公司,貨號2094468CP);細(xì)胞計數(shù)試劑(日本東仁化學(xué)品公司,cell counting kit-8,CCK-8,貨號PL702);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒(貨號20191127)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號20191127);Bio Tek Synergy1型多功能酶標(biāo)儀,美國Bio-tek公司。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

    按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行[3,4],配置含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素,100 U/mL鏈霉素,DMEM完全培養(yǎng)基。將H9c2細(xì)胞從液氮中取出,迅速放入37 ℃水浴鍋中,輕輕搖動凍存管使細(xì)胞懸液盡快融解并吸取細(xì)胞懸液,加入10倍培養(yǎng)基稀釋,離心后去上清,重懸細(xì)胞沉淀于新鮮DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d換液1次,細(xì)胞融合達(dá)80%以上時應(yīng)用0.25%胰酶常規(guī)消化傳代。

    2.2 CCK-8檢測生脈飲對H9c2細(xì)胞活性的作用

    取對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞,按照8×103個/孔細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中,接種體積100 μL,24 h細(xì)胞貼壁后加入不同濃度生脈飲含藥培養(yǎng)液(0.39~1600 μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,每孔加入10 μL CCK-8,培養(yǎng)2 h后酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度(optical density,OD)值,以空白孔OD值調(diào)0,對照組平均吸光值為100%,其余各組均與之比較。細(xì)胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%。

    2.3 CCK-8篩選阿霉素?fù)p傷最適濃度

    取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板,設(shè)對照組、不同濃度ADM組,24 h貼壁后加入不同濃度ADM(1.5625~100 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,每孔加入10 μL CCK-8,孵育2 h后酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值,細(xì)胞存活率計算方法同2.2,確定H9C2損傷模型最適ADM濃度。

    2.4 CCK-8檢測生脈飲對ADM損傷H9c2細(xì)胞保護(hù)作用

    細(xì)胞接種于96孔板,設(shè)對照組、ADM組及ADM +生脈飲各劑量組,24 h細(xì)胞貼壁后,根據(jù)分組情況加入ADM和不同濃度生脈飲,繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入CCK-8,孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測,方法同前。

    2.5 試劑盒檢測損傷后H9c2細(xì)胞內(nèi)SOD,MDA變化

    2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 方法同前,取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi),孵育24 h后根據(jù)分組情況加入1 μmol/L ADM和不同濃度生脈飲,繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。

    2.5.2 細(xì)胞裂解及SOD、MDA檢測 造模結(jié)束后將各培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞消化離心后,PBS洗1遍離心后棄上清,每組加入200 μL RIPA裂解液,冰上裂解20 min,離心后取上清測定蛋白濃度。按照文獻(xiàn)及SOD試劑盒說明書采用WST-1法進(jìn)行后續(xù)操作,酶標(biāo)儀450 nm檢測各組SOD活性[5]。應(yīng)用TBA法按照MDA試劑盒說明進(jìn)行后續(xù)操作,酶標(biāo)儀532 nm檢測各組MDA含量。

    2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

    3 結(jié)果

    3.1 生脈飲對心肌H9c2細(xì)胞增殖的影響

    圖1示,生脈飲(0.39~1600 μg/mL)對H9c2細(xì)胞未呈現(xiàn)明顯的毒性作用;生脈飲(25、200、1600 μg/mL)與H9c2細(xì)胞共培養(yǎng)72 h,能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖,增加細(xì)胞存活率,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明生脈飲毒性低,在一定劑量范圍內(nèi)作用時間延長且能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。

    注:A.生脈飲作用H9c2細(xì)胞24 h;B.生脈飲作用H9c2細(xì)胞48 h;C.生脈飲作用H9c2細(xì)胞72 h;與對照組比較:*P<0.05圖1 生脈飲(0.39~1600 μg/mL)對H9c2細(xì)胞增殖的影響

    3.2 ADM損傷心肌H9c2細(xì)胞濃度篩選

    圖2示,ADM(1.5625~100 μmol/L)作用H9c2細(xì)胞24 h、48 h、72 h均能夠明顯抑制細(xì)胞增殖。作用72 h時隨著ADM劑量增加,細(xì)胞存活率逐漸降低并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

    注:A.ADM損傷H9c2細(xì)胞24 h;B.ADM損傷H9c2細(xì)胞48 h;C.ADM損傷H9c2細(xì)胞72 h;與對照組比較:**P<0.01;阿霉素(adriamycin,ADM)圖2 ADM(1.5625~100 μmol/L)對H9c2細(xì)胞的毒性作用

    3.3 生脈飲對ADM損傷H9c2細(xì)胞的影響

    根據(jù)3.2結(jié)果,以ADM 1 μmol/L作為H9c2損傷模型,圖3A示,ADM (1 μmol/L)作用H9c2細(xì)胞24 h,細(xì)胞存活率降低,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);生脈飲400 μg/mL組細(xì)胞存活率高于ADM組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著ADM作用時間延長,細(xì)胞存活率降低,作用48 h、72 h,ADM組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而生脈飲各劑量組與ADM組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B,C),表明生脈飲400 μg/mL對ADM損傷H9c2細(xì)胞24 h有一定的保護(hù)作用,隨著ADM作用時間延長對細(xì)胞損傷加重,生脈飲不能改善ADM對細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

    注:A.ADM損傷H9c2細(xì)胞24 h;B.ADM損傷H9c2細(xì)胞48 h;C.ADM損傷H9c2細(xì)胞72 h;與對照組比較:**P<0.01;與ADM組比較#P<0.05;阿霉素(adriamycin,ADM)圖3 生脈飲對ADM(1μmol/L )損傷H9c2細(xì)胞的影響

    3.4 生脈飲對ADM誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷SOD的影響

    圖4A示,ADM(1 μmol/L )損傷H9c2細(xì)胞24 h,各組組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。圖4B示,ADM(1 μmol/L )損傷48 h,生脈飲100、200 μg/mL組細(xì)胞內(nèi)SOD活力高于ADM組(P<0.05);圖4C示,ADM(1 μmol/L )損傷72 h,ADM組細(xì)胞內(nèi)SOD活力較對照組明顯降低(P<0.01);與ADM組比較,生脈飲50、200 μg/mL組細(xì)胞內(nèi)SOD活力增加(P<0.01)。以上結(jié)果表明,ADM能夠降低細(xì)胞內(nèi)SOD活力,生脈飲保護(hù)心肌細(xì)胞作用可能與增加SOD活力相關(guān)。

    注:A.ADM損傷H9c2細(xì)胞24 h;B.ADM損傷H9c2細(xì)胞48 h;C.ADM損傷H9c2細(xì)胞72 h;與對照組比較:**P<0.01;與ADM組比較:#P<0.05,##P<0.01;阿霉素(adriamycin,ADM),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)圖4 生脈飲對ADM誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷SOD的影響

    3.5 生脈飲對ADM誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷MDA的影響

    圖5示,ADM(1 μmol/L )損傷H9c2細(xì)胞24 h、48 h、72 h,ADM組MDA含量較對照組均顯著升高(P<0.01),生脈飲各劑量組MDA含量較ADM組均顯著降低(P<0.01)。以上結(jié)果提示,ADM能夠增加胞內(nèi)MAD含量,生脈飲能夠降低ADM損傷引起的MDA含量增加。

    注:A.ADM損傷H9c2細(xì)胞24 h;B.ADM損傷H9c2細(xì)胞48 h;C.ADM損傷H9c2細(xì)胞72 h;與對照組比較:**P<0.01;與ADM組比較:##P<0.01;阿霉素(adriamycin,ADM),丙二醛(malondialdehyde,MDA)圖5 生脈飲對ADM誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷MDA的影響

    4 討論

    ADM是腫瘤化療方案中最常應(yīng)用的抗腫瘤藥物之一,但其濃度依賴性的心臟毒性呈現(xiàn)進(jìn)展性和不可逆性,是臨床應(yīng)用前必須考慮的因素。目前,右丙亞胺是唯一批準(zhǔn)用于臨床預(yù)防ADM致心臟毒性的藥物,因價格較高應(yīng)用受到限制。中醫(yī)藥在預(yù)防腫瘤發(fā)生、抗耐藥、防止復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等方面具有明顯優(yōu)勢,從中醫(yī)藥中尋找降低ADM心肌毒性的輔助藥物一直受到廣大科研工作者的關(guān)注,是腫瘤研究的熱點問題之一。生脈飲由紅參、麥冬、五味子組成,三藥合用一補一清一斂,共同發(fā)揮益氣生津、斂陰止汗的作用,是治療氣陰兩虛的常用方劑。生脈注射液聯(lián)合5氟尿嘧啶能夠提高機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答,增加化療藥物的抗腫瘤作用[6]。加味生脈飲能夠改善HER-2陽性乳腺癌術(shù)后患者赫賽汀靶向治療的臨床癥狀,抑制左心射血分?jǐn)?shù)下降,保護(hù)心肌,提高患者對赫賽汀所致心臟毒性的耐受力,預(yù)防心臟毒性事件發(fā)生[7]。謝有鑫等[8]研究發(fā)現(xiàn),左心射血分?jǐn)?shù)降低性心力衰竭采用生脈注射液和丹參川芎嗪注射液聯(lián)合治療,能明顯改善患者心臟功能,降低腦尿鈉肽和紅細(xì)胞分布寬度水平。生脈注射液聯(lián)合米力農(nóng)注射液,可顯著改善慢性心力衰竭患者的心腎功能,提高心功能分級[9]。另有報道,ADM可誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species,ROS)過度累積,促凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白X(B-cell lymphoma-2-Associated X,Bax)表達(dá)量顯著上升,抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)顯著下降,心肌凋亡指數(shù)顯著升高,心肌病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)損傷導(dǎo)致心功能顯著下降。生脈飲可部分逆轉(zhuǎn)ADM引起的上述變化,對ADM引起的心肌損傷具有保護(hù)作用,其可能機(jī)制在于降低ADM誘導(dǎo)的心肌過度氧化和凋亡[10]。

    基于此,本課題以心肌H9c2細(xì)胞為研究對象,建立ADM損傷心肌細(xì)胞模型,體外觀察生脈飲對ADM致H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn),生脈飲(0.39~1600 μg/mL)對H9c2細(xì)胞未呈現(xiàn)明顯的毒性作用;一定的劑量生脈飲(25,200,1600 μg/mL)作用一定時間(72 h),能夠促進(jìn)H9c2細(xì)胞增殖,說明生脈飲自身對心肌H9c2細(xì)胞幾乎無毒性,呈現(xiàn)時間-劑量依賴性的促增殖作用。ADM毒性強(qiáng),1.5625~100 μmol/L ADM作用H9c2細(xì)胞均呈現(xiàn)明顯的毒性,并存在時間依賴關(guān)系。王皓等[11]報道,與對照組比較ADM組心肌細(xì)胞活力減弱,本研究與此報道一致。孫彬栩等[12]報道新加生脈飲能改善心肌細(xì)胞凋亡大鼠心功能情況,抑制心肌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),生脈飲400 μg/mL對ADM(1 μmol/L)損傷H9c2細(xì)胞24 h有一定的保護(hù)作用。隨著ADM作用時間延長,對細(xì)胞損傷加重,生脈飲不能改善ADM對細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。ADM心臟毒性的特點在于線粒體氧化磷酸化導(dǎo)致的劑量依存性下降,ADM和鐵相互作用產(chǎn)生的活性氧可以破壞心肌,造成肌原纖維的損失和細(xì)胞質(zhì)的液泡化,從而限制了其在臨床中的應(yīng)用。此外,ADM可引起心肌腎素、血管緊張素Ⅱ、醛固酮以及ROS 生成增高,導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡,纖維化以及心功能減退[13]。由此,本研究探討了生脈飲對ADM的損傷作用是否與氧化損傷有關(guān),以SOD、MDA變化作為氧化損傷評價指標(biāo),結(jié)果顯示生脈飲對ADM損傷的保護(hù)作用與增加SOD活力、降低MDA含量相關(guān)。

    綜上,ADM損傷H9c2心肌模型制備簡單快捷、條件可控、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好,可推廣用于心肌保護(hù)藥物的體外篩選。生脈飲對心肌細(xì)胞幾乎無毒性,生脈飲對ADM損傷的心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用,與增加SOD活力、降低MDA含量相關(guān),其損傷作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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