紅鰭東方鲀性腺發(fā)育的組織學(xué)研究

李偉緣，熊玉宇，王子維，張 琦，姜潔明，閆紅偉，劉 鷹,3，劉 奇，李美沅，王秀利

( 1.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023；2.設(shè)施漁業(yè)教育部重點實驗室，遼寧 大連 116023；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，山東 青島 266237 )

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)屬硬骨魚綱鲀形目鲀科東方鲀屬[1]，俗稱河鲀，是東方鲀屬魚類中體型最大、經(jīng)濟價值較高的商業(yè)品種，肉質(zhì)細致、味道鮮美，素有“魚中之王”的美稱[2-3]。野生群體在中國、日本、韓國沿海均有分布[4]，在中國主要分布于黃海、渤海和東海[5]。我國紅鰭東方鲀養(yǎng)殖采用陸海接力的養(yǎng)殖模式[6-7]，苗種供應(yīng)完全依靠人工促熟與繁育，每年我國的養(yǎng)殖產(chǎn)量約4000 t[8]。人工養(yǎng)殖條件下，雄魚可以2～3齡性成熟，雌魚一般晚于雄魚，約3齡性成熟。紅鰭東方鲀?yōu)榇菩郛愺w魚類，在繁殖季節(jié)，性腺幾乎充滿整個體腔，其質(zhì)量可達體質(zhì)量的20%～30%，雌魚、雄魚的市場價值差異較大[9]，精巢的市場價格甚至高于魚肉制品的價格。

魚類生殖系統(tǒng)由性腺(精巢和卵巢)及生殖導(dǎo)管組成，是繁殖活動進行的基礎(chǔ)，對維持種群的延續(xù)至關(guān)重要。研究魚類性腺發(fā)育的方法包括形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)等方法。目前，國內(nèi)關(guān)于紅鰭東方鲀的研究主要集中在人工養(yǎng)殖技術(shù)、保鮮儲藏及生理生態(tài)方面[10-12]，對其繁殖生物學(xué)的研究還不全面[13-16]，對人工養(yǎng)殖條件下紅鰭東方鲀性腺發(fā)育過程與繁殖規(guī)律的研究在國內(nèi)外均未見系統(tǒng)報道。盡管對硬骨魚類性腺發(fā)育分期的研究較多[17-22]，但至今仍未有統(tǒng)一的分期標(biāo)準。1965年，李有廣等[23]根據(jù)各時相卵母細胞的數(shù)量及其所占比例及各時相卵母細胞體積比例將卵巢發(fā)育過程分成6個階段；1993年，劉筠[24]提出,可以根據(jù)生理學(xué)、組織學(xué)和形態(tài)學(xué)特征對卵巢發(fā)育過程進行劃分。近年來，國內(nèi)外學(xué)者除借鑒以上觀點外，結(jié)合目標(biāo)魚種的真實情況，將發(fā)育過程劃分為與卵母細胞時相對應(yīng)的6個時期，而在精巢發(fā)育階段劃分中，不同魚種略有差別[24]。藍軍南[25]將四指馬鲅(Eleutheronematetradactylum)的精巢發(fā)育及精子發(fā)生分為6個時期：精原細胞增殖期、精母細胞增長期、精母細胞成熟期、精子開始出現(xiàn)期、精子完全成熟期和精子退化吸收期。李忠利等[19]也將錦江翹嘴鲌(Culteralburnus)精巢發(fā)育分為6個時期：精原細胞增殖前期、精原細胞增殖期、精母細胞生長成熟期、精子開始出現(xiàn)期、精子成熟期和退化期；而Akayli等[26]將長鰭金槍魚(Thunnusalalunga)精巢發(fā)育過程分為5個時期：未成熟期、發(fā)育期、成熟期、排放期和衰退期。近年來，伴隨著紅鰭東方鲀養(yǎng)殖產(chǎn)量的逐漸提高，針對不同的市場需求，如能在透徹了解其生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與性腺發(fā)育規(guī)律的基礎(chǔ)上，對其繁殖過程進行人工調(diào)控，能節(jié)約生產(chǎn)成本，帶來顯著經(jīng)濟效益[27-28]，也可為其他東方鲀屬魚類繁殖生物學(xué)研究及工廠化養(yǎng)殖提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚2019年6月至2021年4月間采自大連某河鲀養(yǎng)殖基地。共采集試驗魚212尾，其中80日齡樣本60尾、7月齡樣本50尾、18月齡樣本40尾、30月齡樣本20尾、33月齡樣本22尾、36月齡樣本10尾和48月齡樣本10尾。

1.2 試驗方法

1.2.1 數(shù)量特征測量

測定所采集的紅鰭東方鲀體質(zhì)量、全長、體長、性腺質(zhì)量以及肝臟質(zhì)量。

1.2.2 性腺發(fā)育指數(shù)計算

與性腺發(fā)育相關(guān)的指數(shù)包括性腺指數(shù)(wGSI)、肝體指數(shù)(wHSI)和肥滿度(CF)，按下式計算：

wGSI=mG/m×100%

wHSI=mL/m×100%

CF=100m/L3

式中，mG為性腺質(zhì)量(g)，m為體質(zhì)量(g)，mL為肝質(zhì)量(g)，L為體長(cm)。

1.2.3 組織切片制備及性腺分期

解剖試驗魚，取精巢、卵巢，固定于4%多聚甲醛通用型組織固定液中,4 ℃冰箱保存24 h后，轉(zhuǎn)入70%乙醇溶液中保存?zhèn)溆?。利用自動脫水機(Diapath Donatello，意大利)脫水、二甲苯透明和石蠟包埋。使用切片機(Leica RM2016，中國)切片，厚度為5～7 μm，采用蘇木精—伊紅染色，中性樹膠封片保存，于顯微鏡(Carl Zeiss，德國)下觀察性腺發(fā)育狀況并拍照。性腺分期結(jié)合紅鰭東方鲀的性腺顏色、形態(tài)及組織切片情況進行劃分。

1.2.4 基于分子標(biāo)記的性別鑒定

紅鰭東方鲀性別鑒定參考文獻[13]的方法，利用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp，中國)提取魚鰭樣本中基因組DNA，1.0%瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性。利用amhr2基因外顯子9的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點作為性別鑒定的分子標(biāo)記，PCR引物使用SDexonF(5′-CAGATGC ACACAAACCACCT-3′)和SDexonR(5′-TCCCAG TGTTGCGGTATGTA-3′)。反應(yīng)程序為：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物擴增后通過測序鑒定性別。

1.3 統(tǒng)計分析

采用軟件SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準誤表示；相同性別間的指標(biāo)采用單因素方差分析數(shù)值的差異性，然后使用鄧肯多重比較檢驗均值；雌、雄魚之間的差異比較采用獨立樣本t檢驗；P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 采集的紅鰭東方鲀樣本的體長及體質(zhì)量

本試驗采集的紅鰭東方鲀共涵蓋7個不同年齡組(表1)。孵化后80日齡～30月齡，魚體生長迅速(P<0.05)；30～36月齡，增速緩慢(P>0.05)。不同年齡組體質(zhì)量差異顯著(P<0.05)。雌、雄魚間平均體長，除48月齡外，均無顯著差異(P>0.05)；在48月齡時，樣本組中雄魚平均體長顯著大于雌魚(P<0.05)。雌、雄魚間平均體質(zhì)量，除30月齡外，均無顯著差異(P>0.05)；在30月齡時，所采集的樣本組中雌魚的平均體質(zhì)量顯著大于雄魚(P<0.05)(表1)。

表1 不同發(fā)育階段紅鰭東方鲀體長、體質(zhì)量(平均值±標(biāo)準誤)Tab.1 Body length and body weight of tiger puffer T. rubripes in different developmental stages (mean±SE)

2.2 性腺分布位置及形狀

紅鰭東方鲀?yōu)榇菩郛愺w，其性腺均成對出現(xiàn)，呈長葉形(圖1)，左右成對排列。性腺位于魚體腔的腹中線，緊貼于腎臟腹面兩側(cè)的腹腔系膜上，性腺的形狀和位置與魚的體型有關(guān)。雌魚卵巢性成熟時呈黃色，血管密布；雄魚精巢左右分開，性成熟時呈灰白色；性腺由排泄孔與外界相通。

圖1 紅鰭東方鲀性腺組織示例Fig.1 Example of gonad of the tiger puffer T. rubripesa.卵巢；b.精巢.a.ovary;b.testis.

2.3 紅鰭東方鲀配子發(fā)生

2.3.1 卵子發(fā)生

在紅鰭東方鲀卵巢發(fā)育過程中，可以觀察到處于不同發(fā)育階段的卵細胞，即卵原細胞、初級卵母細胞、次級卵母細胞和成熟卵子。根據(jù)卵細胞的體積大小以及卵黃和濾泡發(fā)育等特征，可將卵細胞的發(fā)育分為Ⅵ個時相(圖2)。卵子發(fā)生過程中，卵巢內(nèi)含有不同發(fā)育階段的卵母細胞，且其一年內(nèi)只產(chǎn)卵一次，生殖季節(jié)集中，屬于部分同步型。

第Ⅰ時相：此階段，卵原細胞體積小，呈橢圓形，細胞核大。卵巢腔體四周出現(xiàn)初級卵母細胞，與卵原細胞相比，初級卵母細胞的體積較大，細胞質(zhì)占比增多，細胞核明顯。初級卵母細胞的出現(xiàn)是卵巢細胞分化的開始(圖2m)。

第Ⅱ時相：初級卵母細胞進入小生長期階段，細胞體積增大，呈卵圓形或多角形，細胞質(zhì)增加并呈強嗜堿性。細胞核體積變大，核膜內(nèi)壁分布多個核仁。濾泡細胞在卵母細胞外形成濾泡膜(圖2n)。

第Ⅲ時相：初級卵母細胞進入大生長期階段。在質(zhì)膜外側(cè)的濾泡膜，由單層轉(zhuǎn)化為雙層，在濾泡膜和卵細胞膜之間形成放射帶。隨著卵黃和脂肪的積累，卵母細胞體積明顯增大，在細胞質(zhì)外緣出現(xiàn)液泡，液泡不斷發(fā)育，數(shù)目增加，并逐漸向內(nèi)緣移位。卵黃沉積，在液泡間形成卵黃顆粒(圖2o)。

第Ⅳ時相：處于初級卵母細胞的發(fā)育晚期。細胞增大，核仁數(shù)量增多，卵黃積累，核外空間幾乎被卵黃充滿，細胞質(zhì)僅在核的周圍以及細胞膜邊緣存在。放射帶明顯增厚，濾泡膜和放射帶更加清晰(圖2p)。

第Ⅴ時相：卵細胞發(fā)育成熟。卵黃顆粒大多數(shù)呈橢圓形，散布于整個卵母細胞的胞質(zhì)內(nèi)。卵母細胞細胞質(zhì)的邊緣仍有液泡。即將排卵，濾泡膜松馳，大部分與卵膜分離(圖2q)。

第Ⅵ時相：為未排出卵子，或逐漸退化并被重吸收的卵母細胞。細胞呈不規(guī)則狀，蜷曲于卵巢內(nèi)，細胞核消失，卵黃顆粒變?yōu)橐簯B(tài)，顏色昏暗，放射帶明顯增厚(圖2r)。

圖2 紅鰭東方鲀卵巢外觀形態(tài)、卵子發(fā)生過程及組織切片觀察Fig.2 Observation of the appearance,oogenesis and histological section of the ovaries of tiger puffer T. rubripesa～f是Ⅰ～Ⅵ期卵巢的外觀形態(tài)；g～l分別對應(yīng)Ⅰ～Ⅵ期卵巢的組織切片觀察結(jié)果；m～r分別對應(yīng)卵子發(fā)生的第Ⅰ～Ⅵ時相；O.卵巢；OG.卵原細胞；PO.初級卵母細胞；OC.卵巢腔；SP.產(chǎn)卵板；BV.血管；N.細胞核；NU.核仁；FT.濾泡膜；YG.卵黃顆粒；OD.油滴；CA.液泡；ZR.放射帶；EF.空濾泡.a—f show the appearance and morphology of the ovaries of stages Ⅰ—Ⅵ;.g—l correspond to the observation of histological sections of ovaries with stages Ⅰ—Ⅵ,respectively;m—r correspond to the phases Ⅰ—Ⅵ in oogenesis,respectively;O.ovary;OG.oogonium;PO.primary oocyte;OC.ovarian cavity;SP.oviposition plate;BV.blood vessel;N.nucleus;NU.nucleolus;FT.follicle theca;YG.yolk granules;OD.oil droplets;CA.cortical alveola;ZR.zona radiata;EF.empty follicle.

2.3.2 精子發(fā)生

紅鰭東方鲀精子發(fā)生(圖3)，包括精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和成熟精子。首先，為精原細胞增殖期，精原細胞數(shù)量增加(圖3m)；在后期開始分化的精原細胞變?yōu)槌跫壘讣毎?，初級精母細胞要比精原細胞小，染色比精原細胞?圖3n)，初級精母細胞進入生長期，細胞變大；初級精母細胞進行物質(zhì)積累，物質(zhì)積累完成后，轉(zhuǎn)化為次級精母細胞(圖3o)；次級精母細胞再經(jīng)過減數(shù)分裂形成精子細胞(圖3p)；精子細胞最終轉(zhuǎn)化為精子(圖3q～r)，即變態(tài)期，精子細胞的核、質(zhì)經(jīng)過分化和重組，產(chǎn)生成熟的精子。

2.4 紅鰭東方鲀卵巢形態(tài)特征和組織學(xué)分期

紅鰭東方鲀卵巢的外部形態(tài)特征以及內(nèi)部組織發(fā)育過程，會隨其年齡的增加、繁殖活動的開始而產(chǎn)生相應(yīng)的變化。并且在卵巢發(fā)育過程中，通過組織切片技術(shù)，能夠觀察到處于不同發(fā)育階段的卵細胞。因此，以卵巢外部形態(tài)、顏色及性腺組織切片視野中占比大的卵母細胞類型為卵巢分期的劃分依據(jù)，可將紅鰭東方鲀的卵巢發(fā)育分為6個時期。

Ⅰ期：幼魚的卵巢，很小，緊貼腹腔系膜上，呈淡肉色，透明細線狀，外觀難辨雌雄(圖2a)。卵巢內(nèi)主要是卵原細胞，卵原細胞體積較小近似圓形或橢圓形，弱嗜堿性，出現(xiàn)卵巢腔以及產(chǎn)卵板，一生中只出現(xiàn)一次，持續(xù)時間短(圖2g)，如80日齡雌魚樣本組。

Ⅱ期：卵巢呈長條形，淺肉紅色，已分化出雙葉狀結(jié)構(gòu)，肉眼可初步辨別雌、雄，變寬且長度有所增加，表面被覆一層淡紅色膜，可見微細的血管(圖2b)。肉眼難以分辨卵粒，組織切片觀察，卵巢有明顯的卵巢腔，由卵巢表面向腔體內(nèi)部折疊形成產(chǎn)卵板，卵母細胞封閉在產(chǎn)卵板內(nèi)，緊密排列。卵巢中主要是處于生長期的初級卵母細胞。卵母細胞形狀為不規(guī)則的圓形，外有分散的濾泡細胞連成的一層濾泡膜包被，內(nèi)部出現(xiàn)卵圓形的細胞核，核膜內(nèi)壁分布強嗜堿性核仁，卵巢中以第Ⅱ時相卵母細胞為主，存在少量的第Ⅰ時相卵原細胞(圖2h)，如7、18月齡和部分30月齡雌魚樣本組。

Ⅲ期：卵巢呈肉色或淺紅色，表面密布血管，清晰可見。隨著發(fā)育，卵巢迅速生長，體積明顯增大，變?yōu)檩^膨脹的囊狀，占據(jù)體腔大部分，透過卵巢壁肉眼可見均勻的卵粒，淡黃色顆粒飽滿，但不能分離(圖2c)。組織切片觀察，初級卵母細胞開始積累營養(yǎng)物質(zhì)，進入大生長期，體積明顯增大，細胞基本呈圓形，大小不均，出現(xiàn)皮質(zhì)液泡和卵黃顆粒。位于核膜內(nèi)邊緣的核仁數(shù)量增多。油滴大小不一。晚期初級卵母細胞細胞膜與濾泡細胞之間出現(xiàn)放射帶，濾泡膜出現(xiàn)雙層結(jié)構(gòu)。卵巢內(nèi)第Ⅲ時相卵母細胞占大部分，存在少量的第Ⅱ時相卵母細胞(圖2i)，如部分30、33月齡雌魚樣本組。

Ⅳ期：卵巢接近成熟，體積繼續(xù)增大，中部膨脹，近乎充滿整個體腔。血管變粗，在卵巢膜上呈現(xiàn)網(wǎng)狀分布，肉眼可見卵粒，卵?；ハ囵みB，為非游離狀態(tài)(圖2d)。卵母細胞體積顯著增大，基本完成了卵黃積累，沉積大量卵黃顆粒和油滴。卵巢內(nèi)大多數(shù)卵母細胞處于第Ⅳ時相，且存在第Ⅲ時相和第Ⅱ時相的一定數(shù)量卵母細胞(圖2g)，如部分33、36、48月齡雌魚樣本組。

Ⅴ期：魚腹表面可見隆起，卵巢體積達到最大，卵母細胞充分發(fā)育，卵子成熟，卵巢呈松軟狀，卵巢壁變薄，卵粒呈現(xiàn)離散狀態(tài)，透明。濾泡膜破裂，卵母細胞釋放到腹腔，輕壓魚腹，泄殖孔處有卵子流出(圖2e)。組織切片觀察，細胞質(zhì)中充滿卵黃球和大油滴。細胞核極化，由中央向動物極偏移。濾泡細胞膜松弛，與卵母細胞膜分離。卵巢內(nèi)除了成熟的卵細胞外，還含有部分第Ⅳ時相、第Ⅲ時相卵母細胞(圖2k)，如部分48月齡雌魚樣本組。

Ⅵ期：卵巢退化，體積縮小，質(zhì)量減輕，表面密布血管，有充血現(xiàn)象，深紅色，松軟癟塌(圖2f)。留有未產(chǎn)出的成熟卵子和正在退化并被吸收的第Ⅲ、第Ⅱ時相卵母細胞，同時存在大量排卵后剩下的空濾泡。細胞形狀不規(guī)則，蜷曲于卵巢內(nèi)，其特征是核消失，卵黃液化，殘留的卵母細胞被溶解吸收。在卵母細胞生長發(fā)育的過程中存在卵母細胞萎縮現(xiàn)象(圖2l)，如部分48月齡雌魚樣本組。

2.5 紅鰭東方鲀精巢形態(tài)特征和組織學(xué)分期

紅鰭東方鲀的精巢為小葉型精巢，結(jié)構(gòu)單位是精小葉，而精小葉由許多精小囊組成。在精巢內(nèi)，精原細胞首先發(fā)育成精母細胞，之后是精子細胞，最終成為成熟的精子，成熟精子只在小葉腔和輸出管內(nèi)存在。根據(jù)精巢的形態(tài)特征以及組織切片觀察結(jié)果，可將精巢發(fā)育過程分為6個時期。

Ⅰ期：僅見于幼魚早期發(fā)育精巢，性腺成對，可以看到左右兩葉，外觀為白色透明細線狀，緊貼腹腔內(nèi)壁的兩側(cè)(圖3a)。切片觀察可見，通常多個精原細胞包裹在一起，呈多角形或橢圓狀無規(guī)則分散，核大且染色較深(圖3g)，如80日齡雄魚樣本組。

Ⅱ期：此期的精巢呈細線狀，淡肉色，半透明狀態(tài)，表面可見少許淺色毛細血管，不明顯(圖3b)。切片觀察，精小葉長條形，精小葉之間間隙明顯。開始形成精小囊，多個精小囊構(gòu)成一個精小葉。精原細胞分化，精小囊內(nèi)出現(xiàn)初級精母細胞。初級精母細胞體積比精原細胞小，染色比精原細胞深(圖3h)，如7月齡，部分18、30月齡雄魚樣本組。

Ⅲ期：雄魚精巢體積增大，呈棒狀，淺黃色(圖3c)。切片觀察，此期精小囊內(nèi)具有初級精母細胞、次級精母細胞和精原細胞，還可見少量的精子細胞。其中以初級精母細胞和次級精母細胞為主。次級精母細胞體積小于初級精母細胞，核的嗜堿性更強(圖3i)，如部分18、30、33月齡雄魚樣本組。

Ⅳ期：精巢進一步發(fā)育，體積增大，占據(jù)體腔的大半，富有彈性。顏色偏白，略帶紅色，呈袋狀(圖3d)。切片觀察，精巢中主要包括次級精母細胞、精細胞和精子。這些精細胞包裹在精小囊中，同一個精小囊中生精細胞同步發(fā)育。精子細胞數(shù)量增多，部分精小囊破裂，成熟精子溢出到小葉腔中(圖3j)，如部分33月齡雄魚樣本組。

Ⅴ期：精巢體積最大，飽滿柔軟，內(nèi)部充滿精液，達到完全成熟，外觀呈乳白色，輕壓雄魚腹部精液很容易從泄殖孔流出(圖3e)。切片觀察，小葉腔中含大量的成熟精子。精小葉邊緣分布著少量精細胞和次級精母細胞(圖3k)。如部分33、36月齡雄魚樣本組。

Ⅵ期：排精一周左右的精巢，精巢較性成熟期體積和質(zhì)量大幅減小，松軟，血管不明顯，呈淺黃色(圖3f)。切片觀察精巢腔萎縮，內(nèi)部部分呈中空狀，僅剩結(jié)締組織、精原細胞和少量初級精母細胞，精小葉中尚存有未排出的精子(圖3l)，如48月齡雄魚樣本組。

2.6 紅鰭東方鲀性腺發(fā)育過程中相關(guān)指數(shù)的變化

紅鰭東方鲀性腺發(fā)育過程中性腺指數(shù)的變化見圖4。隨著紅鰭東方鲀性腺開始發(fā)育，精巢、卵巢增大，質(zhì)量增加，性腺指數(shù)從Ⅲ期開始升高，性腺在進入發(fā)育期后發(fā)育加速，至成熟產(chǎn)卵期或排精期(Ⅴ期)時達到最大值。其中，雄魚精巢發(fā)育Ⅴ期的性腺指數(shù)為(18.79±0.69)%，雌魚卵巢發(fā)育Ⅴ期的性腺指數(shù)為(12.87±2.05)%，顯著高于其他時期的性腺指數(shù)(P<0.05)。

圖4 不同發(fā)育時期的性腺指數(shù)變化Fig.4 Changes in gonadosomatic index in different developmental stages數(shù)值均為平均值±標(biāo)準誤；不同字母表示差異顯著(P<0.05)；*為雌、雄魚之間差異顯著(P <0.05)；下同.The values are all the mean±SE;means with different letters are significant differences (P<0.05).*,represent significant difference between female and male fish;et sequentia.

紅鰭東方鲀性腺發(fā)育過程中，肝臟指數(shù)為(13.22±0.56)%～(9.21±0.52)%。雄魚肝臟指數(shù)在Ⅱ期和Ⅲ期差異不顯著(P>0.05)，Ⅲ期為(12.44±1.10)%，此后顯著逐漸下降(P<0.05)，降至(9.21±0.52)%。雌魚肝臟指數(shù)在各個時期樣本之間差異不顯著(P>0.05)(圖5)。

圖5 不同發(fā)育時期的肝臟指數(shù)變化Fig.5 Changes in hepatosomatic index in different developmental stages

隨著性腺的發(fā)育，紅鰭東方鲀肥滿度的變化為(3.12±0.04)%～(4.17±0.15)%(圖6)。雄魚肥滿度，與Ⅴ期相比，在Ⅵ期顯著降低(P<0.05)。雌魚肥滿度在各個時期樣本之間差異不顯著(P>0.05)。

圖6 不同發(fā)育時期的肥滿度變化Fig.6 Changes in condition factor in different developmental stages

3 討 論

3.1 紅鰭東方鲀繁殖類型及生殖細胞發(fā)育特征

硬骨魚類繁殖活動的調(diào)控十分復(fù)雜，受下丘腦—垂體—性腺(HPG)軸影響，即生殖軸的互相協(xié)調(diào)作用才能完成[29]。還需生殖器官的活動結(jié)合生殖細胞的變化來共同實現(xiàn)。

大部分硬骨魚類卵巢的變化均表現(xiàn)出周年規(guī)律。按卵子發(fā)生模式可分為3種類型：完全同步型、部分同步型和非同步型。(1)完全同步型，即該卵巢內(nèi)所有的卵母細胞都處于同一發(fā)育階段，一生只產(chǎn)卵一次，產(chǎn)后死亡，如大麻哈魚(Oncorhynchusketa)[30]。(2)部分同步型，該卵巢內(nèi)至少有兩種不同發(fā)育階段的卵母細胞，在一年內(nèi)通常只產(chǎn)卵一次，生殖季節(jié)很短，如虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[31]。(3)非同步型，該卵巢內(nèi)含有各個發(fā)育階段的卵母細胞，一年內(nèi)產(chǎn)卵多次，生殖季節(jié)相當(dāng)長，如青鳉(Oryziaslatipes)[32]。本試驗結(jié)果表明，紅鰭東方鲀卵巢中卵母細胞表現(xiàn)為部分同步發(fā)育，其特征是在不同發(fā)育階段的卵巢中卵子發(fā)生過程同時存在兩個以上的卵母細胞階段。并且雌魚在產(chǎn)卵期內(nèi)只產(chǎn)卵一次，因此紅鰭東方鲀應(yīng)該屬于一年產(chǎn)卵一次的部分同步型。在鲀科魚類中，暗紋東方鲀(T.obscurus)[33]也是這種產(chǎn)卵模式。

根據(jù)精子發(fā)生的模式，可將魚類精巢結(jié)構(gòu)分成2種類型：小葉型和小管型[34]。小葉型精巢由許多被結(jié)締組織分隔而成的精小葉構(gòu)成，精小葉包含許多精小囊，生精細胞在精小囊中發(fā)育，成熟后，精子被釋放到小葉腔中，成熟精子最終存在于小葉腔和輸精管。小葉型又可分為2種，即全囊成熟型和半囊成熟型。全囊成熟型指從精原細胞至精子細胞，同一階段的生精細胞存在于同一個精小囊中，含有精子細胞的精小囊破裂，精子釋放至小葉腔[35]。半囊成熟型是指精小囊中只含有精原細胞和初級精母細胞。初級精母細胞進一步分化，精小囊破裂，次級精母細胞在腔中繼續(xù)發(fā)育至成熟精子，等待釋放，精子數(shù)量較少[36]。小管型精巢中精小管連通中央腔，不具有精小葉，精子被釋放到中央腔中，如孔雀花鳉(Poeciliareticulata)[37]。本試驗結(jié)果表明，紅鰭東方鲀精巢結(jié)構(gòu)為小葉型，精巢由許多精小葉構(gòu)成，性成熟時小葉腔內(nèi)有許多成熟的精子細胞。絕大多數(shù)的硬骨魚類的精子成熟方式屬于小葉型中的全囊成熟型，如金魚(Carassiusauratus)[38]、許氏平鲉(Sebastodsschlegelii)[39]、鲇(Silurusasotus)[40]等，紅鰭東方鲀精子成熟方式與絕大多數(shù)硬骨魚類相同。

根據(jù)卵巢腔的有無以及卵巢與輸卵管的連接情況，可將魚類的卵巢分為2類：游離卵巢和封閉卵巢[32]。游離卵巢無卵巢腔、無輸卵管，卵子成熟后進入體腔；封閉卵巢有輸卵管，卵巢被腹膜形成的卵巢囊包裹，卵巢壁向卵巢的內(nèi)部延伸出產(chǎn)卵板。紅鰭東方鲀卵巢屬于封閉型。

魚類精子和卵子的發(fā)生均需經(jīng)過增殖、生長和成熟等幾個階段。卵母細胞的發(fā)育要經(jīng)過原生質(zhì)生長、卵黃的發(fā)生積累等過程，而卵黃發(fā)生期的主要特征是卵母細胞胞質(zhì)中合成卵黃顆粒。本試驗結(jié)果表明，紅鰭東方鲀卵母細胞在發(fā)育過程中首先在質(zhì)膜邊緣出現(xiàn)液泡，卵巢到發(fā)育后期開始出現(xiàn)卵黃顆粒，其后卵黃顆粒數(shù)量和體積迅速增加。此外，在紅鰭東方鲀性腺發(fā)育的過程中，并非所有細胞都會完成其整個發(fā)育過程，部分卵母細胞會發(fā)生萎縮，萎縮的卵子最終會被分解吸收。細胞萎縮的主要原因之一可能為在發(fā)育的過程中缺乏營養(yǎng)的供應(yīng)[41]。

3.2 紅鰭東方鲀性腺分期及發(fā)育尺度的判別

截至目前，關(guān)于魚類性腺發(fā)育的組織學(xué)分期，國際上仍未統(tǒng)一標(biāo)準。筆者參考李有廣等[23]提出的性腺劃分標(biāo)準，并依據(jù)卵細胞的發(fā)育過程，將紅鰭東方鲀雌、雄性腺均分為6期。但其研究中，試驗魚已達性成熟年齡，未見Ⅰ期性腺(卵原細胞期)。因此，筆者采集了紅鰭東方鲀的幼魚樣本，并在分期過程中將卵原細胞期作為第1個分期，此時卵巢內(nèi)絕大部分都是卵原細胞。

紅鰭東方鲀性腺的形態(tài)、大小、顏色特征與配子發(fā)生時所出現(xiàn)的組織與器官變化有關(guān)，Lowerre-Barbieri等[42-43]對硬骨魚類性腺發(fā)育的研究也有類似結(jié)果。除了性腺未成熟期與休止期只能通過組織學(xué)診斷來確定，紅鰭東方鲀性腺發(fā)育階段可以通過形態(tài)、大小和顏色加以區(qū)別。本試驗結(jié)果表明，分子標(biāo)記的性別鑒定結(jié)果與性腺組織學(xué)觀察確定的性別一致，因此紅鰭東方鲀大多數(shù)發(fā)育階段可以僅依靠性腺的形態(tài)、大小和顏色特征來定義性別是可行且快速的。同時，紅鰭東方鲀的性腺發(fā)育過程還包含了其他特征，如性腺組織血管化、性腺大小、性腺指數(shù)變化，也可作為性腺分期及發(fā)育尺度的判別。

3.3 相關(guān)指數(shù)與性腺發(fā)育的關(guān)系

性腺指數(shù)的變化能夠直接反映出在生殖活動過程中親魚性腺的快速生長和發(fā)育。與花鱸(Lateolabraxmaculatus)[44]和美洲鰣(Alosasapidissima)[45]相似，人工養(yǎng)殖的紅鰭東方鲀性腺指數(shù)在生殖期快速升高，Ⅴ期時達到峰值，產(chǎn)卵、排精后性腺指數(shù)與Ⅴ期相比均顯著降低(P<0.05)，且在非生殖期保持較低的水平，由此可見人工養(yǎng)殖的紅鰭東方鲀性腺對環(huán)境因子的調(diào)控應(yīng)答良好。

肝臟指數(shù)是評價魚類性腺發(fā)育的重要數(shù)量指標(biāo)。它能夠直觀表現(xiàn)魚體內(nèi)儲存能量的多少，其變化反映出親魚的攝食情況和肝臟卵黃蛋白原合成的動態(tài)變化[46]。本試驗結(jié)果表明，紅鰭東方鲀雄魚肝臟指數(shù)在發(fā)育前期差異不顯著(P>0.05)，在Ⅲ期后開始下降(P<0.05)。產(chǎn)生這種變化的原因可能是：在發(fā)育前期親魚大量攝食，能量儲備提高，當(dāng)接近性成熟期時紅鰭東方鲀攝食量減少，耗能持續(xù)，魚體儲能被消耗，肝臟指數(shù)在發(fā)育后期下降[47]。此外，暗紋東方鲀雌魚在性腺發(fā)育過程中存在性腺指數(shù)增大、肝臟指數(shù)減小的現(xiàn)象，即隨著性腺成熟度的提高，性腺體積和質(zhì)量逐漸增大，而肝臟卻減小[48]。紅鰭東方鲀魚雌性肝臟指數(shù)在各個時期樣本之間無顯著性差異(P>0.05)，未表現(xiàn)出與雄魚一致的變化趨勢，可能是由于各樣本營養(yǎng)狀態(tài)不同，存在個體差異所致。

肥滿度能夠直觀反映魚體的生長狀況。而繁殖與生長密不可分，魚類一般在性腺發(fā)育階段，肥滿度存在一定的上升趨勢，在繁殖之后肥滿度下降[45]。筆者對紅鰭東方鲀的性腺發(fā)育研究也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，但由于紅鰭東方鲀是一種體型較大的魚類，肥滿度在整個繁殖周期的變化并不明顯。

4 結(jié) 論

筆者首次描述了紅鰭東方鲀性腺發(fā)育規(guī)律，將卵子發(fā)生劃分為6個時相，精子發(fā)生分為5個階段。根據(jù)性腺的外部形態(tài)特征、大小及顏色等，可將紅鰭東方鲀卵巢及精巢發(fā)育過程分為6個時期，分別與性腺宏觀表型對應(yīng)。此外，性腺指數(shù)隨性腺的發(fā)育逐漸升高，產(chǎn)后下降，與性腺發(fā)育的變化規(guī)律保持一致。在精巢發(fā)育過程中，肝臟指數(shù)在Ⅳ期開始顯著下降；卵巢發(fā)育過程中，肝臟指數(shù)變化不大。上述研究成果將有助于提高對紅鰭東方鲀繁殖生物學(xué)的認知,為后續(xù)育種和工廠化養(yǎng)殖，以及深入探索東方鲀屬魚類性腺發(fā)育的分子調(diào)控機制提供生物學(xué)依據(jù)。