急性肝胰腺壞死病病原菌毒力的初步研究

李吉云，沈 輝，孟慶國(guó)，萬(wàn)夕和，蔣 葛，喬 毅，成 婕，馮艷琴,3，李浩瀾

( 1.南京師范大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210000；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；3.江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222000 )

急性肝胰腺壞死病作為一種新興蝦類疾病，自2009年我國(guó)海南省暴發(fā)以來(lái)，至今仍對(duì)全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重影響[1]。2012年，亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖聯(lián)盟因病蝦表現(xiàn)出獨(dú)特的肝胰腺壞死癥狀，將該病命名為急性肝胰腺壞死病。起初，部分學(xué)者認(rèn)為，該病的發(fā)生與黃頭病毒[2]、對(duì)蝦種質(zhì)[3]、養(yǎng)殖環(huán)境惡化[4]等因素有關(guān)。2015年，Tran等[5]通過(guò)試驗(yàn)確定了該病的病原為一類特異的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，這類特異的副溶血弧菌通過(guò)編碼二元毒素pirA和pirB而具有致病性[6]；Lee等[7]通過(guò)基因重組和敲除pirA和pirB毒力基因獲得突變株進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)一步證明這兩種毒素蛋白是引起急性肝胰腺壞死病的主要致病因子。組織病理學(xué)顯示，發(fā)生急性肝胰腺壞死病的病蝦肝胰腺小管上皮細(xì)胞脫落，大量血細(xì)胞浸潤(rùn)其中[8]。此外，致病性副溶血弧菌還能感染三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)等甲殼類動(dòng)物[9]。

迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)被致病性副溶血弧菌感染的蝦出現(xiàn)了不同死亡率。墨西哥株M1-1感染的蝦呈現(xiàn)亞急性死亡，與其他2株泰國(guó)株3HP和5HP相比，死亡率較低[10]，致病機(jī)理尚未明確。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)江蘇省不同地區(qū)暴發(fā)急性肝胰腺壞死病的養(yǎng)殖場(chǎng)調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生此病的不同養(yǎng)殖對(duì)蝦群體出現(xiàn)了急性和亞急性兩種病程，分析認(rèn)為，不同致病性副溶血弧菌菌株間可能存在毒力差異。因此，筆者通過(guò)攻毒試驗(yàn)驗(yàn)證不同致病性副溶血弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的毒力強(qiáng)弱，并利用多位點(diǎn)序列分型技術(shù)對(duì)收集的菌株進(jìn)行分型研究，為急性肝胰腺壞死病的積極防控提供實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用急性肝胰腺壞死病致病性菌株分離源為2016—2017年江蘇省發(fā)生急性肝胰腺壞死病的對(duì)蝦樣品(表1)，按照SC/T 7103—2008《水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范》規(guī)定方法采集對(duì)蝦樣品。

表1 致病性副溶血弧菌來(lái)源信息Tab.1 Information on pathogenic V. parahaemolyticus source

試驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦均取自南通市某養(yǎng)殖場(chǎng)，挑選健康、活躍、規(guī)格一致的凡納濱對(duì)蝦，體長(zhǎng)(3.0±0.5) cm，體質(zhì)量(2.79±0.50) g，未檢出致病性副溶血弧菌特定病原。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 菌株培養(yǎng)與核酸提取

菌株接于硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)20 h，挑取單菌落接種至LB固體培養(yǎng)基上繼續(xù)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。使用接種環(huán)挑取LB固體培養(yǎng)基單菌落于100 mL無(wú)菌雙蒸水中，沸水煮浴10 min后，12 000 r/min離心(離心半徑1 cm)5 min，取上清液為菌株DNA擴(kuò)增模板。

1.2.2 菌株病原菌鑒定與確認(rèn)

采用AP1、AP2上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物序列見表2。其中AP1、AP2擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，70 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用16S rRNA基因通用引物27 F/1492 R為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表2。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。分別取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用于2%瓊脂糖凝膠電泳以便觀察目標(biāo)條帶是否出現(xiàn)，余下產(chǎn)物16S rRNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析。

表2 PCR擴(kuò)增片段及引物序列Tab.2 PCR amplification fragment and primer sequences

1.2.3 菌株攻毒回感試驗(yàn)

試驗(yàn)于50 L藍(lán)色塑料水箱中進(jìn)行，每個(gè)水箱放養(yǎng)凡納濱對(duì)蝦30尾，水量20 L，鹽度6，水溫24～26 ℃，正常充氣，日投餌2次，暫養(yǎng)3 d后進(jìn)行回感試驗(yàn)。為排除LB液體培養(yǎng)基對(duì)試驗(yàn)干擾，試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)對(duì)照組，分別為海水對(duì)照組和添加LB液體培養(yǎng)基的海水對(duì)照組，對(duì)照組設(shè)置2個(gè)平行，處理組均設(shè)置3個(gè)平行。通過(guò)浸浴方式進(jìn)行感染，致病性副溶血弧菌密度為1×107cfu/mL[13]。攻毒后，隔6 h撈出死亡蝦，計(jì)數(shù)。死亡蝦經(jīng)液氮速凍處理后-80 ℃保存。

1.2.4 多位點(diǎn)序列分型目的基因的選擇和引物合成

以1.2.1的上清液為菌株DNA擴(kuò)增模板，通過(guò)PCR分別擴(kuò)增致病性副溶血弧菌的recA、gyrB、dnaE、dtdS、pntA、pyrC和tnaA共7對(duì)管家基因，隨后對(duì)PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行測(cè)序[14]。7對(duì)管家基因多位點(diǎn)序列分型引物合成參考PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)(表3)。

表3 致病性副溶血弧菌7對(duì)管家基因引物Tab.3 Seven primers of housekeeping genes in pathogenic V. parahaemolyticus

1.2.5 管家基因的擴(kuò)增體系及條件

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水19 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；96 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，測(cè)序結(jié)果用BioEdit軟件和DNAMAN軟件處理后，上傳至PubMLST副溶血弧菌數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)比對(duì)，獲得各管家基因位點(diǎn)的等位基因數(shù)值，并形成相應(yīng)的等位基因譜，提交多位點(diǎn)序列分型網(wǎng)站，確定致病性副溶血弧菌的序列型(ST)[15]。

1.2.7 多位點(diǎn)序列分型結(jié)果及序列型特征分析

在pubMLST副溶血弧菌數(shù)據(jù)庫(kù)等位基因檢索項(xiàng)(https://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)中檢索統(tǒng)計(jì)與新的序列型ST2355相近的序列型。統(tǒng)計(jì)比對(duì)各管家基因突變率[16]，并與文獻(xiàn)中報(bào)道的各個(gè)地區(qū)的致病性副溶血弧菌做進(jìn)化關(guān)系分析。

1.2.8 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用MEGA 7.0軟件對(duì)不同致病性副溶血弧菌的序列型對(duì)應(yīng)的7個(gè)管家基因拼接序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，以此分析不同序列型菌株的相互關(guān)系[17]。為評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹中節(jié)點(diǎn)的穩(wěn)定性，執(zhí)行1000次重復(fù)自我檢驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及LSD法多重比較，采用Excel繪制折線圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株病原菌的鑒定結(jié)果

通過(guò)AP1、AP2引物擴(kuò)增6株菌的AP1與AP2基因序列，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。6株菌在700 bp大小處有明顯條帶，與目標(biāo)條帶大小一致。將測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站中已登記的16S rRNA基因序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，6株菌與致病性副溶血弧菌的相似性最高，相似性均在99%以上，表明以上分離得到的6株菌均屬于致病性副溶血弧菌。

圖1 6株菌毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Dection of virulence genes of six strains by PCRa.AP1引物擴(kuò)增；b.AP2引物擴(kuò)增；M.DL1000 bp DNA標(biāo)志物；1.SHY1669;2.SHY1673;3.SHY1697;4.SHY1776;5.SHY1777;6.SHY1833.a.amplification of primer AP1;b.amplification of primer AP2;M.DL100 DNA maker;1.SHY1669;2.SHY1673;3.SHY1697;4.SHY1776;5.SHY1777;6.SHY1833.

2.2 攻毒回感試驗(yàn)結(jié)果

攻毒6 h后，試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦出現(xiàn)典型急性肝胰腺壞死病癥狀，如攝食緩慢、拖便、肝胰腺腫脹。死亡個(gè)體蝦出現(xiàn)空腸空胃、肝胰腺顏色變淡，檢測(cè)確認(rèn)為致病性副溶血弧菌陽(yáng)性。6株致病性副溶血弧菌感染凡納濱對(duì)蝦24 h后，對(duì)蝦開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象(圖2)。試驗(yàn)過(guò)程中，菌株SHY1673、SHY1697試驗(yàn)組致死速率較緩慢，攻毒96 h凡納濱對(duì)蝦總死亡率小于30%；反之，菌株SHY1669、SHY1776及SHY1777在12 h時(shí)致凡納濱對(duì)蝦出現(xiàn)死亡，表現(xiàn)出較高的死亡速率，24 h內(nèi)對(duì)蝦大量死亡，96 h死亡率達(dá)80%以上。對(duì)照組均未出現(xiàn)對(duì)蝦死亡情況。將72 h內(nèi)死亡率達(dá)到50%以上判定為急性死亡，未達(dá)到50%死亡率但出現(xiàn)死亡個(gè)體則判定為亞急性死亡。依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，將菌株SHY1673、SHY1697歸類為亞急性菌株，將菌株SHY1669、SHY1776、SHY1777、SHY1833歸類為急性菌株。

圖2 不同致病性副溶血弧菌感染凡納濱對(duì)蝦96 h累計(jì)死亡率Fig.2 The 96-hour cumulative mortality of Pacific white shrimp L. vannamei infected by different VPAHPNDSN1.海水對(duì)照組；N2.添加LB液體培養(yǎng)基的海水對(duì)照組.N1.seawater control group；N2.seawater control with LB liquid medium.

2.3 致病性副溶血弧菌管家基因擴(kuò)增結(jié)果

采用經(jīng)過(guò)優(yōu)化的退火溫度分別擴(kuò)增致病性副溶血弧菌7個(gè)管家基因位點(diǎn)，結(jié)果顯示均可擴(kuò)增(圖3)，電泳分析均出現(xiàn)目的條帶，經(jīng)檢驗(yàn)各擴(kuò)增產(chǎn)物核酸濃度及純度符合測(cè)序要求，可用于多位點(diǎn)序列分型的后續(xù)分析研究。

圖3 致病性副溶血弧菌的MLST管家基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 MLST amplification results of pathogenic V. parahaemolyticusM.2000 bp DNA標(biāo)志物;1.dnaE基因;2.gyrB基因;3.recA基因;4.dtdS基因;5.pntA基因.6:pyrC基因;7.tnaA基因.M.2000 bp Marker;1.dnaE gene;2.gyrB gene;3.recA gene;4.dtdS gene;5.pntA gene.6:pyrC gene;7.tnaA gene.

2.4 致病性副溶血弧菌多位點(diǎn)序列分型結(jié)果

將等位基因譜提交至pubMLST副溶血弧菌數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)結(jié)果見表4。6株致病性副溶血弧菌中有5株菌為已知序列型，菌株SHY1833為新序列型，其各管家基因均為已知等位基因型，但按順序拼接得到的等位基因組合在數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)已知的序列型，提交至數(shù)據(jù)庫(kù)，現(xiàn)已將其收錄，并確認(rèn)新序列型ST2355。

表4 6株致病性副溶血弧菌多位點(diǎn)序列分型結(jié)果Tab.4 Multilocus sequence typing(MLST) results of 6 strains of pathogenic V. parahaemolyticus

進(jìn)一步研究分析新序列型ST2355的序列特異性，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中ST1743與ST2355相似度最高，僅與dnaE等位基因存在差異，且只有2個(gè)突變位點(diǎn)(表5)，相似性高達(dá)99%。

表5 多位點(diǎn)新序列型ST2355等位基因突變位點(diǎn)信息(與ST1743比較)Tab.5 Genetic diversity at the seven loci examined of the new sequence type (comparied with ST1743)

將本試驗(yàn)6株致病性副溶血弧菌與文獻(xiàn)中報(bào)道的各個(gè)地區(qū)的12株不同致病性副溶血弧菌用7個(gè)管家基因拼接序列生成進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果顯示，所選菌株均分離自凡納濱對(duì)蝦或土壤環(huán)境中，序列型分別為ST313、ST314、ST315、ST394、ST395、ST760、ST764、ST1394、ST1576。從進(jìn)化關(guān)系可以發(fā)現(xiàn),所選18株致病性副溶血弧菌序列型可分為3個(gè)類群(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)，其中有16株主要分布在Ⅰ和Ⅱ類群內(nèi)。急性、亞急性2種序列型在3個(gè)類群中均有分布：亞急性序列型主要分布在中國(guó)、菲律賓等亞洲地區(qū)；急性菌株序列型則分布在美國(guó)、泰國(guó)、中國(guó)、菲律賓，分布范圍由亞洲延伸至北美洲。

圖4 多位點(diǎn)序列分型不同序列型進(jìn)化關(guān)系Fig.4 The evolutionary relationship among the different sequence types加粗字體為本試驗(yàn)所用菌株序列型.Sequence type of the strain used in this study is shown in bold font.

3 討 論

3.1 回感試驗(yàn)差異性分析

截至目前，已有許多致病性副溶血弧菌的序列及引起不同死亡率的研究被報(bào)道。Lai等[18]在2015年對(duì)致病性副溶血弧菌的致病機(jī)理進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，泰國(guó)株(5HP)的毒力顯著高于分離的越南株(M1-1、M2-36)。Phiwsaiya等[19]也報(bào)道了一株具有pVA1質(zhì)粒，但致死率僅有50%的致病性副溶血弧菌。在本試驗(yàn)中，浸浴攻毒96 h后，菌株SHY1776致凡納濱對(duì)蝦死亡率可達(dá)100%，而菌株SHY1673死亡率低于5%，存在顯著差異(P<0.05)，由此表明，菌株存在急性致死型和亞急性致死型，也進(jìn)一步驗(yàn)證了在中國(guó)各地的致病性副溶血弧菌中也存在不同毒力的現(xiàn)象。甄曉然等[20]發(fā)現(xiàn)，同一株拮抗菌對(duì)14株致病性副溶血弧菌的拮抗效果不同，這表明致病性副溶血弧菌株間差異明顯。致病性副溶血弧菌通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移重組，產(chǎn)生質(zhì)粒編碼的PirA、PirB毒力蛋白，獲得毒力致病性[21]。對(duì)致病機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，致病性副溶血弧菌(M2-36)菌株缺失pirB基因后不合成PirA及PirB毒素，也不具有致病性；致病性副溶血弧菌(M1-1)盡管具有pirA及pirB基因，也合成PirA及PirB毒素，但感染對(duì)蝦后其基本定殖在胃中，很少定殖在肝胰腺中，其毒力引起的致死率也較低。Kumar等[10]對(duì)致病性副溶血弧菌M1-1菌株進(jìn)行深入研究后發(fā)現(xiàn)，M1-1菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3周后，盡管其pVA1質(zhì)粒還存在，但其pirA/B基因已經(jīng)丟失，并通過(guò)基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，M1-1菌株比典型的致病性副溶血弧菌(5HP)菌株多了一些額外的基因，包括DNA代謝、壓力感應(yīng)、噬菌體DNA復(fù)制蛋白等，但其毒力減弱的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探討。筆者在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步推測(cè)，致病性副溶血弧菌所表現(xiàn)出的廣泛多樣性可能歸因于通過(guò)水平轉(zhuǎn)移獲得攜帶基因的質(zhì)粒的能力。在同種養(yǎng)殖條件下，不同株型的菌株在毒力產(chǎn)生能力上存在強(qiáng)弱之分，可能是因?yàn)轲B(yǎng)殖范圍流通，使得菌株在養(yǎng)殖條件中不斷轉(zhuǎn)化成為適應(yīng)環(huán)境的亞急性毒株，而其中一些菌株進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，逐漸突變成生命力頑強(qiáng)、更適應(yīng)環(huán)境的急性菌株。此因素導(dǎo)致急性菌株與亞急性菌株在不斷地轉(zhuǎn)化，而目前已有的淡水養(yǎng)蝦模式與海水養(yǎng)蝦模式促使不同鹽度之間弧菌的交流轉(zhuǎn)化，可能存在造成有毒種群的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖和人類健康產(chǎn)生一定影響。

另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，致病菌的毒力會(huì)因?yàn)橘|(zhì)粒間插入成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列而減弱，因?yàn)橘|(zhì)粒間插入成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列會(huì)形成原噬菌體等外源DNA侵入的防御屏障，從而降低其致病性[22-23]。Yu等[24]通過(guò)對(duì)不同毒力大小的致病性副溶血弧菌進(jìn)行基因組分析，發(fā)現(xiàn)缺少質(zhì)粒間插入成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列會(huì)為原噬菌體通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移插入毒力基因從而增強(qiáng)致病性副溶血弧菌的毒力提供條件，以此推斷原噬菌體和質(zhì)粒間插入成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列之間關(guān)系可能與致病性副溶血弧菌的毒力變化有一定關(guān)系，質(zhì)粒間插入成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列的存在可能使菌株的毒力降低或消失。

3.2 分型結(jié)果分析

目前致病性副溶血弧菌分布于多個(gè)國(guó)家，菌株材料收集范圍較廣，將不同地區(qū)菌株信息進(jìn)行比較分析存在一定難度，并且通過(guò)全球范圍的水產(chǎn)品貿(mào)易，副溶血弧菌污染和耐藥情況嚴(yán)重[25-26]。多位點(diǎn)序列分型可以將多個(gè)管家基因序列拼接，并與不同地區(qū)的同種類型菌株流行病學(xué)以及親緣進(jìn)化關(guān)系分析比較，在分析生物學(xué)中具有一定的優(yōu)越性。孫明玉等[16]對(duì)致病性副溶血弧菌進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型聚類分析，未發(fā)現(xiàn)全球不同地區(qū)的菌株在遺傳親緣關(guān)系上有明顯的分類性；泰國(guó)學(xué)者基于多位點(diǎn)序列分型的研究表明，致病性副溶血弧菌分布較廣，但非成群分布，具有遺傳多樣性[26]，但在地域上未表現(xiàn)出明顯的親緣關(guān)系；Yu等[24]對(duì)34株致病性副溶血弧菌進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型分析，發(fā)現(xiàn)ST970作為優(yōu)勢(shì)菌株最為常見。本試驗(yàn)中，對(duì)6株菌以及不同地區(qū)致病性副溶血弧菌進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型研究，結(jié)果顯示，江蘇不同地區(qū)收集到的6株致病性副溶血弧菌中5株為已知序列型，分別為ST452、ST882、ST415、ST114、ST919，具有較高的分布多樣性，且與ST970屬于2個(gè)不同的集群，分布距離較遠(yuǎn)。筆者還發(fā)現(xiàn)，ST2355與數(shù)據(jù)庫(kù)中ST1743同源性最高，相似性超過(guò)99%。由此推測(cè)這2株菌可能是來(lái)自于同一亞急性祖先或是由同一個(gè)亞急性菌株突變產(chǎn)生。本試驗(yàn)多位點(diǎn)序列分型聚類結(jié)果還顯示，中國(guó)致病性副溶血弧菌的遺傳多樣性較高，多株與泰國(guó)、菲律賓、馬來(lái)西亞等東南亞國(guó)家聚在一起，初步表明我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖活動(dòng)與東南亞國(guó)家交流緊密。Restrepo等[27]通過(guò)基因組測(cè)序也發(fā)現(xiàn)，南美洲致病性副溶血弧菌相比于墨西哥菌株，其基因相似性與東南亞菌株更高，由此也提出了急性肝胰腺壞死病防控的預(yù)警建議。

另外，由本試驗(yàn)多位點(diǎn)序列分型聚類分析結(jié)果可見，不同毒力的致病性副溶血弧菌并未從親緣關(guān)系上顯示出強(qiáng)弱差異聚類趨勢(shì)。這一結(jié)果與Yu等[24]研究結(jié)果一致，在多位點(diǎn)序列分型分析中，致病性副溶血弧菌并未按毒力的強(qiáng)弱程度進(jìn)行聚類，推測(cè)是因?yàn)橹虏⌒愿比苎【玖?qiáng)弱的差異是表現(xiàn)在質(zhì)?；虿町愋陨蟍18]，而多位點(diǎn)序列分型系統(tǒng)發(fā)育樹分析主要體現(xiàn)在菌株致病性副溶血弧菌不同地理種群的差異性上[24]。由此表明，多位點(diǎn)序列分型不能有效區(qū)分高度相關(guān)、不同血清型但遺傳關(guān)系相近的菌株[28]。

另外，筆者僅選擇江蘇地區(qū)的6株致病性副溶血弧菌與其他各地的9株致病性副溶血弧菌進(jìn)行比較，存在一定的局限性，不能完全反映不同類型致病性副溶血弧菌的遺傳關(guān)系。在野外條件下引起菌株變異和差異的情況很多，如藻毒素的影響、環(huán)境的惡化均可導(dǎo)致對(duì)蝦不同的死亡率，所以筆者選擇在統(tǒng)一的試驗(yàn)條件下，驗(yàn)證凡納濱對(duì)蝦感染菌株后死亡率的差異性。本試驗(yàn)中的多位點(diǎn)序列分型提示，致病性副溶血弧菌并不是來(lái)自一個(gè)單一的遺傳譜系，出現(xiàn)了1個(gè)新的序列型，豐富了數(shù)據(jù)庫(kù)的信息。在今后的研究中，筆者會(huì)繼續(xù)從比較基因組學(xué)、毒力因子和毒力蛋白等方面繼續(xù)進(jìn)行差異原因的探索，為致病性副溶血弧菌的致病機(jī)制研究提供思路，以便于后期急性肝胰腺壞死病的防控診斷。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示：不同致病性副溶血弧菌在感染凡納濱對(duì)蝦引起急性肝胰腺壞死病時(shí)，會(huì)由于毒力大小差異，出現(xiàn)急性與亞急性兩種類型；多位點(diǎn)序列分型顯示，毒力不同的菌株從親緣關(guān)系上不能表現(xiàn)出強(qiáng)弱差異聚類趨勢(shì)。