瀾滄裂腹魚4個(gè)地理群體遺傳多樣性分析

金方彭，左鵬翔，冷 云，吳俊頡，熊合勇，高海濤，雷春云，周 睿，李光華

( 1.云南省漁業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650000；2.華能瀾滄江水電股份有限公司，云南 昆明 650000 )

瀾滄裂腹魚(Schizothoraxlantsangensis)，俗稱面魚，屬鯉形目鯉科裂腹魚亞科裂腹魚屬，為高原山區(qū)冷水性魚類，分布于瀾滄江中上游。分布區(qū)較狹窄，數(shù)量不多，已列為《中國(guó)物種紅色名錄第一卷》瀕危物種[1]。近年來(lái)，由于瀾滄江梯級(jí)水電站的開發(fā)建設(shè)導(dǎo)致流域出現(xiàn)片段化，阻礙了瀾滄裂腹魚的自然繁殖，導(dǎo)致自然資源量下降，而通過(guò)人工繁殖的方法進(jìn)行資源量恢復(fù)的效果尚不明顯。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)瀾滄裂腹魚的研究較少，主要集中在繁殖生物學(xué)[2]、肌肉營(yíng)養(yǎng)[3]等方面，有關(guān)瀾滄裂腹魚遺傳多樣性方面的報(bào)道較少。以高通量測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(SLAF-seq)技術(shù)具有通量高、有效讀長(zhǎng)長(zhǎng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、成本低等特點(diǎn)[4]。馬海鑫[5]基于SLAF-seq技術(shù)對(duì)弧唇裂腹魚(S.curvilabiatus)進(jìn)行了群體遺傳學(xué)分析，王鳳嬌等[6]基于SLAF-seq技術(shù)對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)3個(gè)選育世代進(jìn)行了遺傳多樣性分析，金方彭等[7]利用SLAF-seq技術(shù)對(duì)瀾滄江中上游光唇裂腹魚(S.lissolabiatus)4個(gè)地理群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析。筆者利用SLAF-seq技術(shù)獲得大量特異性單核苷酸多態(tài)性標(biāo)簽，并利用開發(fā)的位點(diǎn)分析不同地理群體樣品的遺傳多樣性，為瀾滄裂腹魚未來(lái)的種質(zhì)選育提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在瀾滄江中上游采集瀾滄裂腹魚野生群體40尾，劃分為4個(gè)地理群體(表1)。取野生樣本尾鰭，存放于無(wú)水乙醇中帶回實(shí)驗(yàn)室后于-85 ℃冰箱保存。

表1 瀾滄裂腹魚樣本采集點(diǎn)Tab.1 Sample collection sites of S. lantsangensis

1.2 DNA提取

采用異丙醇沉淀法，提取樣本DNA。純化后的DNA樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和紫外分光光度計(jì)[D(260 nm)/D(280 nm)]檢測(cè)合格。

1.3 建庫(kù)及高通量測(cè)序

根據(jù)Sun等[8]方法構(gòu)建SLAF-seq文庫(kù)，筆者選取錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)基因組作為酶切預(yù)測(cè)的參考基因組，其基因組大小為1.71 Gb，GC含量37.00%(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/951/615/GCF_000951615.1_common_carp_genome/GCF_000951615.1_common_carp_genome_genomic.fna.gz)，內(nèi)切酶的選擇原則是避免重復(fù)序列的內(nèi)切酶片段且片段必須均勻地分布在基因組中，并使酶切片段數(shù)符合預(yù)期特異位點(diǎn)片斷(SLAF)標(biāo)簽數(shù)。操作流程為:在酶切片段3′端加poly (A)、連接Dual-index專用測(cè)序接頭、PCR擴(kuò)增、純化、混樣、切膠回收目的片段，并將目的片段使用Illumina Hiseq 2500進(jìn)行雙末端測(cè)序。選用日本晴水稻(Oryzasativassp.japonica)基因組(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)為對(duì)照組，并將同一過(guò)程進(jìn)行排序以評(píng)估建庫(kù)的準(zhǔn)確性。

根據(jù)序列相似性特點(diǎn)，將各樣品的讀長(zhǎng)進(jìn)行聚類，聚在一起的讀長(zhǎng)來(lái)源于一個(gè)SLAF標(biāo)簽。不同SLAF標(biāo)簽間的相似度遠(yuǎn)低于同一SLAF標(biāo)簽在不同樣品間的序列；一個(gè)SLAF標(biāo)簽在不同樣品間序列有差異，即可定義為多態(tài)性SLAF標(biāo)簽。單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記的開發(fā)是以每個(gè) SLAF 標(biāo)簽中測(cè)序深度最高的序列類型作為參考序列，利用BWA[9]將測(cè)序讀長(zhǎng)比對(duì)到參考基因組上，并使用SAMtools[10]和GATK[11]方法開發(fā)SNP標(biāo)記，最終以2種方法得到的SNP標(biāo)記交集作為可靠的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)集，利用群體內(nèi)具有代表性的高質(zhì)量SNP標(biāo)記進(jìn)行群體多態(tài)性分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

核酸多樣性分析和4個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)使用PopGenome[12]軟件統(tǒng)計(jì)；遺傳多樣性參數(shù)和群體間分子變異分析使用Arlequin[13]軟件統(tǒng)計(jì)；使用MEGA X[14]軟件，基于鄰接法，采用Kimura 2-parameter模型，構(gòu)建各樣品的系統(tǒng)發(fā)育樹；通過(guò)admixture[15]軟件，進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析；通過(guò)EIGENSOFT[16]軟件，進(jìn)行主成分分析，得到樣品的聚類情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)

2.1.1 建庫(kù)評(píng)估與質(zhì)控

通過(guò)錦鯉基因組進(jìn)行方案預(yù)測(cè)，選擇Rsa Ⅰ+Hae Ⅲ酶對(duì)瀾滄裂腹魚進(jìn)行酶切，目標(biāo)片段長(zhǎng)度為364～414 bp，樣本平均獲得129 637個(gè)SLAF標(biāo)簽，SLAF標(biāo)簽在基因組上基本分布均勻，為保證項(xiàng)目分析質(zhì)量，本項(xiàng)目采用讀長(zhǎng)126 bp×2作后續(xù)的數(shù)據(jù)評(píng)估和分析，共獲得467.67 Mb讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)，Control數(shù)據(jù)雙端比對(duì)效率為97.19%，酶切效率為90.82%，測(cè)序Q30堿基含量平均為94.88%，GC含量平均為40.32%，所得到的Q30堿基質(zhì)量值較高，說(shuō)明堿基出錯(cuò)率低，測(cè)序結(jié)果可靠。讀長(zhǎng)比對(duì)率均大于70%，表明試驗(yàn)過(guò)程沒(méi)有污染，插入片段長(zhǎng)度呈正態(tài)分布(圖1)，建庫(kù)正常。

2.1.2 SLAF標(biāo)簽與SNP標(biāo)記開發(fā)

研究獲得498 199個(gè)SLAF標(biāo)簽，其中多態(tài)性SLAF標(biāo)簽有213 644個(gè)，標(biāo)簽的平均測(cè)序深度為29.36×。以每個(gè)SLAF標(biāo)簽中深度最高的序列類型作為參考序列，將測(cè)序讀長(zhǎng)比對(duì)到參考基因組上，共獲得736 515個(gè)群體SNP位點(diǎn)，其中：SNP的完整度為3.48%～58.54%，平均為36.64%；SNP雜合度為4.03%～21.47%，平均為15.51%(表2)。

表2 瀾滄裂腹魚SLAF標(biāo)簽和SNP信息Tab.2 SLAF labels and SNP information of S. lantsangensis

2.2 遺傳多樣性分析

過(guò)濾掉4個(gè)群體中完整度小于0.5、第2等位基因頻率小于0.05的SNP，用過(guò)濾后的SNP計(jì)算出各采樣點(diǎn)的遺傳多樣性指數(shù)。4個(gè)地理群體的觀測(cè)等位基因數(shù)、期望等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度和期望雜合度(基因多樣性)、根井正利基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)、多態(tài)信息含量均是黃登—大華橋地理群體最高(1.9653、1.5725、0.5032、0.3322、0.3430、0.4980、0.2655)；次要基因頻率以苗尾—功果橋群體最高(0.2724)(表3)。對(duì)不同地理群體的觀測(cè)等位基因數(shù)、期望等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、根井正利基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)、多態(tài)信息含量(PIC)作顯著性差異分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)(664.6)>Fcrit(2.660)且P(-8.94)<0.05，呈顯著差異。

表3 瀾滄裂腹魚4個(gè)地理群體遺傳多樣性指數(shù)Tab.3 Genetic diversity index of four geographical populations of S. lantsangensis

2.3 群體間遺傳分化分析

2.3.1 群體間遺傳距離

使用MEGA X 10.0.5軟件計(jì)算群體間的遺傳距離，所有樣品的遺傳距離為0.0323～0.8387，群體間遺傳距離為0.1946～0.6235。群體間遺傳分化指數(shù)計(jì)算結(jié)果(表4)表明，黃登—大華橋、苗尾—功果橋的分歧最大(0.0817)，黃登—大華橋、烏弄龍群體分歧最小(-0.0097)，平均為0.0242。平均顯著水平P=0.2098>0.05，F(xiàn)(1.89)

表4 瀾滄裂腹魚遺傳分化指數(shù)和遺傳距離Tab.4 Genetic differentiation index and genetic distance of S. lantsangensis

2.3.2 群體聚類分析

從系統(tǒng)發(fā)育樹來(lái)看，黃登—大華橋群體聚成一支，里底群體聚為一支，苗尾—功果橋群體聚為一支，烏弄龍和其他地理群體有交叉聚類的現(xiàn)象(圖2)?？偟目磥?lái)，各地理群體的樣本有交叉聚類的現(xiàn)象。

圖2 對(duì)照序列插入片段分布Fig.2 Distribution of insert fragments of control sequences

圖2 瀾滄裂腹魚系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of S. lantsangensis

2.3.3 不同群體之間分子變異分析

對(duì)4個(gè)地理群體的瀾滄裂腹魚的控制區(qū)序列進(jìn)行分子生物學(xué)方差分析(AMOVA)，結(jié)果顯示，群體遺傳分化指數(shù)0.02915(P=0.00348<0.01)，表明瀾滄裂腹魚群體間存在小的但差異顯著的遺傳分化。其中群體間變異占2.91%，群體內(nèi)的變異占97.09%，表明這些樣品的遺傳分化主要發(fā)生在群體內(nèi)部(表5)。

3 討 論

3.1 瀾滄裂腹魚遺傳多樣性分析

多態(tài)性信息含量可以反映出位點(diǎn)在群體中的多樣性水平：當(dāng)多態(tài)性信息含量>0.5時(shí)，為高度多態(tài)性位點(diǎn)；當(dāng)0.25<多態(tài)性信息含量<0.5時(shí)，為中度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)多態(tài)性信息含量<0.25時(shí)，為低度多態(tài)位點(diǎn)[17]。本研究中，瀾滄裂腹魚不同地理群體的多態(tài)性含量大小依次為黃登—大華橋(0.265)>里底(0.2499)>烏弄龍(0.2463)>苗尾—功果橋(0.1709)，除黃登—大華橋地理群體呈中度多態(tài)性外，其他3個(gè)地理群體均呈低度多態(tài)性。

雜合度是群體在所檢測(cè)位點(diǎn)上的雜合子頻率，可以衡量一個(gè)群體雜合程度的高低。雜合度和遺傳多樣性與群體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力正相關(guān)[18]。本研究中，瀾滄裂腹魚觀測(cè)雜合度和期望雜合度均是黃登—大華橋地理群體最大(0.5032、0.3322)苗尾—功果橋地理群體最小(0.1550、0.2133)。瀾滄裂腹魚4個(gè)地理群體的平均觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為0.3692、0.2909：與同一水系同屬的光唇裂腹魚(0.2695、0.2892)相比較[19]，雜合度較高；與同屬的短須裂腹魚(0.2007、0.3160)[20]相比較，觀測(cè)雜合度偏高，期望雜合度較低。這表明其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力可能稍弱。

根井正利基因多樣性指數(shù)是衡量群落豐富度的指標(biāo)，該指數(shù)越高，群落越穩(wěn)定；香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)是用來(lái)反應(yīng)群體的多樣性程度的指數(shù)，指數(shù)越大，多樣性越高[21]。在本次研究中，瀾滄裂腹魚4個(gè)地理群體的平均根井正利基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)分別為0.3137、0.4367，說(shuō)明瀾滄裂腹魚的4個(gè)群體多樣性指數(shù)低，群體不是很穩(wěn)定：與同水系同屬的光唇裂腹魚(0.3134、0.4628)[7]相比，平均根井正利基因多樣性指數(shù)偏高，香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)偏低；與同屬的短須裂腹魚(0.3386、0.4827)[20]相比，根井正利基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)均較低，說(shuō)明瀾滄裂腹魚群體多樣性偏低。4個(gè)地理群體中，黃登—大華橋根井正利基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)最高(0.3430、0.4980)，苗尾—功果橋根井正利基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)最低(0.2466、0.3187)，說(shuō)明黃登—大華橋地理群體遺傳多樣性最高，苗尾—功果橋地理群體的遺傳多樣性最低。

3.2 變異位點(diǎn)分析

瀾滄裂腹魚4個(gè)地理群體的遺傳變異的分子生物學(xué)方差分析結(jié)果顯示，群體間的變異占2.91%，群體內(nèi)的變異占97.09%。這表明遺傳分化主要發(fā)生在每個(gè)群體內(nèi)部，群體間遺傳分化程度低，與遺傳分化指數(shù)分析結(jié)果相吻合。與同水系的光唇裂腹魚(群體間變異占89.73%，群體內(nèi)變異占10.27%)相比[7]，群體內(nèi)變異程度偏高，群體間的變異程度沒(méi)有光唇裂腹魚高；與用同一種標(biāo)記方法分析的羅氏沼蝦(群體內(nèi)變異占73.67%，群體間變異占26.33%)[21]相比較，瀾滄裂腹魚群體間變異程度低；與同屬的塔里木裂腹魚(群體內(nèi)變異81.01%，群體間變異占16.68%)[22]相比較，瀾滄裂腹魚群體內(nèi)變異程度稍高，但群體間的變異程度教低；與雅礱江長(zhǎng)絲裂腹魚(S.dolichonema)群體(群體內(nèi)變異占84.84%，群體間變異占15.16%)[23]相比較，瀾滄裂腹魚群體內(nèi)變異程度高，群體間變異程度較低。這可能與所用測(cè)序方法不同有關(guān)系。

3.3 遺傳分化分析

研究表明：當(dāng)0.05<遺傳距離<0.3時(shí)為同種不同群體；0.3<遺傳距離<0.9時(shí)為同屬不同種；遺傳距離>0.9為不同屬[21]。本研究中40個(gè)樣本的遺傳距離為0.0323～0.2588，說(shuō)明研究對(duì)象為同種不同群體。根據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)0<遺傳分化指數(shù)<0.05時(shí)，表現(xiàn)為低等分化水平；當(dāng)0.05<遺傳分化指數(shù)<0.15時(shí)，表現(xiàn)為中等分化水平；當(dāng)遺傳分化指數(shù)>0.15時(shí)，表現(xiàn)為高等分化水平[17,24]。本研究中，群體間遺傳分化指數(shù)為-0.01496～0.12985：與同屬的墨脫裂腹魚(S.molesworthi)[25](遺傳分化指數(shù)-0.014～0.771)相比較，遺傳分化指數(shù)較低，可能與標(biāo)記的方法不同有關(guān)；與用同一種標(biāo)記方法的羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[26](遺傳分化指數(shù)0.045～0.363)相比較，遺傳分化指數(shù)較低。群體間分化指數(shù)均值為0.07629，分化程度處于中等水平。除苗尾—功果橋、烏弄龍、黃登—大華橋3個(gè)群體間分化處于低等水平外，其他群體間分化均處于中等水平。

聚類分析結(jié)果表明，黃登—大華橋地理群體聚成一支，里底地理群體聚為一支，苗尾—功果橋聚為一支，烏弄龍和其他地理群體有交叉聚類的現(xiàn)象，各地理群體的樣本有交叉聚類的現(xiàn)象。這可能是這些年來(lái)增殖放流引起的，因?yàn)辄S登魚類增殖站負(fù)責(zé)大華橋、黃登、里底和烏弄龍幾個(gè)電站的魚類增殖放流任務(wù)，且在2012年黃登魚類增殖站運(yùn)行之初，并未人工繁殖成功，放流所需魚苗是從下游功果橋增殖站調(diào)運(yùn)的魚苗，以完成放流工作，從而引起不同地理群體交叉聚類。

3.4 瀾滄裂腹魚保護(hù)建議

遺傳多樣性是物種進(jìn)化的基礎(chǔ)，豐富的遺傳多樣性在維持物種的種群數(shù)量和環(huán)境適應(yīng)能力方面發(fā)揮很大的作用。魚類在河流生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色，對(duì)于保持生態(tài)系統(tǒng)正常循環(huán)與能量流動(dòng)起著重要作用[26]，水利工程開發(fā)和建設(shè)都會(huì)對(duì)魚類群體結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分布造成不同程度的影響，進(jìn)而影響生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[27-28]。筆者對(duì)瀾滄裂腹魚的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，其群體遺傳多樣性偏中下水平，群體內(nèi)的變異程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于群體間，梯級(jí)水電工程建設(shè)可能阻斷了群體間的遺傳交流，促進(jìn)了這種遺傳分化現(xiàn)象的發(fā)展。建議瀾滄江中上游流域應(yīng)當(dāng)加大云南土著魚類資源監(jiān)控力度，水電站因地制宜地修筑過(guò)壩設(shè)施，增強(qiáng)人工增殖放流的質(zhì)量和力度。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果顯示：在黃登—大華橋、里底、烏弄龍和苗尾—功果橋4個(gè)地理群體中，觀測(cè)等位基因數(shù)和期望等位基因數(shù)分別為1.90～1.97和1.36～1.57；觀測(cè)雜合度和期望雜合度的分別為0.16～0.50和0.21～0.33；根井正利基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)分別為0.25～0.34和0.32～0.50；多態(tài)信息含量依次為0.2655、0.2499、0.2463、0.1709，處于中低等多態(tài)水平；最小等位基因頻率依次為0.2653、0.2579、0.2561、0.2724；所有遺傳多樣性指數(shù)中，以黃登—大華橋群體最高且呈差異顯著(P<0.05)；群體間的變異占2.91%，群體內(nèi)的變異占97.09%，說(shuō)明變異多發(fā)生在群體內(nèi)，群體間的變異程度?。蝗后w間遺傳距離為0.1946～0.6235，群體間的遺傳分化指數(shù)為-0.019～0.0817，4個(gè)地理群體出現(xiàn)交叉聚類的現(xiàn)象。