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    胰島素樣生長(zhǎng)因子-1預(yù)處理對(duì)原代心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用

    2022-09-20 09:17:58吳連連胡安康
    生物化工 2022年4期
    關(guān)鍵詞:原代存活率心肌細(xì)胞

    吳連連,胡安康

    (徐州醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,江蘇徐州 221004)

    IGF-1是一種促生長(zhǎng)因子,參與調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物的體細(xì)胞生長(zhǎng)和多種代謝過(guò)程,在維持機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要作用[1-2],如促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化,抑制炎癥等[3-4]。IGF-1也是心臟結(jié)構(gòu)和功能的重要調(diào)節(jié)因子,研究證明其能有效改善心肌梗死后心功能恢復(fù)。心肌梗死是威脅人們生命健康的最常見(jiàn)的心血管疾病之一,心肌細(xì)胞缺氧是導(dǎo)致心肌梗死的重要原因。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)原代細(xì)胞培養(yǎng),經(jīng)過(guò)缺氧培養(yǎng)制備心肌細(xì)胞缺氧模型,觀察缺氧后的一些損傷指標(biāo)特征和凋亡情況,探討IGF-1對(duì)缺氧造成的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)新生1~3 d的KM小鼠,雌雄不限,用于原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)。由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào):SCXK(蘇)2020-0011]。

    1.2 試劑與儀器

    IGF-1(HY-P7070),美國(guó) MedChemExpress公司;MTT試劑盒(C0009S),上海碧云天生物技術(shù)有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)基(PWL107),大連美侖生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(085-150),維森特生物技術(shù)(南京)有限公司;胰酶(C0201),上海碧云天生物技術(shù)有限公司;II型膠原酶(QN0512),美國(guó)Gibco公司;乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(A020-1-2)、肌酸激酶(CK)檢測(cè)試劑盒(A032-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(A001-3-2)以及丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(A003-1-2),南京建成生物工程研究所;兔抗alpha-Actin單克隆抗體(ab124964),英國(guó)Abcam公司;山羊抗兔紅色熒光二抗(ab150080),英國(guó)Abcam公司。

    BX53熒光顯微鏡,日本奧林巴斯公司;IX73光學(xué)顯微鏡,日本奧林巴斯公司;Synergy2酶標(biāo)儀,美國(guó)BioTek公司。

    1.3 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

    預(yù)先配好0.08%胰蛋白酶、0.05%Ⅱ型膠原酶和0.04%胰蛋白酶等量配比的混合溶液。在無(wú)菌條件下快速取出乳鼠心臟,用D-Hanks液沖洗,在培養(yǎng)皿中將心臟剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的小碎塊。以0.08%胰蛋白酶消化5~8 min,靜置后棄去上清液,再用0.05%Ⅱ型膠原酶和0.04%胰蛋白酶混合液37 ℃消化10 min,吸取消化后的上清加入離心管中,再以同樣方法消化一次,兩次上清合并,向上清液中加入約1/3(體積)的DMEM/F12培養(yǎng)基以終止消化作用。過(guò)200目網(wǎng)篩,1 200 r/min轉(zhuǎn)速離心12 min。棄上清。用50 mL DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行差速貼壁,90 min后取細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心10 min,所得沉淀用培養(yǎng)基輕輕吹散以純化心肌細(xì)胞。最后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)濃度,接種于培養(yǎng)皿,48 h后更換培養(yǎng)液。

    1.4 藥物預(yù)處理及缺氧模型建立

    造模前24 h將狀態(tài)良好的細(xì)胞更換成無(wú)血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為3組,正常組即不做任何處理的細(xì)胞,缺氧組即模型組,細(xì)胞經(jīng)過(guò)缺氧處理,IGF-1預(yù)處理組在造模前1 h加入終濃度為200 ng/mL的IGF-1。正常組細(xì)胞在普通培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng),缺氧組和IGF-1干預(yù)組細(xì)胞轉(zhuǎn)至缺氧培養(yǎng)箱(37 ℃,94% N2,l%O2,5% CO2)中孵育24 h進(jìn)行缺氧處理建立缺氧模型,隨后進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

    1.5 α-Actin染色鑒定心肌細(xì)胞純度

    吸去培養(yǎng)基,將貼壁的心肌細(xì)胞用0.01 mol/L的PBS洗5 min×3次。4%的多聚甲醛固定細(xì)胞(4 ℃,20 min)吸干液體后用0.01 mol/L的PBS洗5 min×3次并吸去PBS。用10%正常羊血清(含0.3%TritonX-100)室溫封閉 1 h,然后吸干,加入α-Actin(1∶500)抗體并于4 ℃過(guò)夜。第二天將細(xì)胞先拿出復(fù)溫0.5 h,吸干抗體,0.01 mol/L的PBS洗5 min×3次后吸干,加入TRITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶1 000)避光孵育1 h后PBS洗3次,并用DAPI核染液染細(xì)胞核5 min,后經(jīng)PBS洗3次,于熒光顯微鏡下觀察熒光。

    1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

    MTT溶液的配制:用5 mL MTT溶劑溶解25 mg MTT,配制成5 mg/mL的MTT溶液。配制后即刻使用,或分裝后-20 ℃避光保存。

    通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100 μL 2 000個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100 μL 5 000個(gè)細(xì)胞(具體每孔所用的細(xì)胞數(shù)目,需根據(jù)細(xì)胞的大小、細(xì)胞增殖速度的快慢等決定)。按照實(shí)驗(yàn)需要,進(jìn)行培養(yǎng)并給予0~10 μL特定的藥物刺激。每孔加入10 μL MTT溶液,在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formazan溶解液,在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育,直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan全部溶解。在37 ℃下孵育4 h,然后在570 nm測(cè)定吸光度,按式(1)計(jì)算存活率。

    細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD) (1)

    1.7 LDH、CK、SOD活性和MDA含量的測(cè)定

    按照之前分組,細(xì)胞經(jīng)缺氧后,收集各組細(xì)胞和上清,處理好樣品,按照各檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,通過(guò)比色法測(cè)定各物質(zhì)含量、活性。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    利用圖像分析軟件和Photoshop 5.0軟件(Adobe)對(duì)圖像進(jìn)行處理,所有資料用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間均數(shù)的比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA),兩組比較用t檢驗(yàn),P<0.05表示有顯著性差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 α-Actin免疫熒光染色鑒定心肌細(xì)胞純度

    原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)2 d的明場(chǎng)圖見(jiàn)圖1(a),心肌細(xì)胞純度常用α-Actin染色鑒定,見(jiàn)圖1(b),可見(jiàn)α-Actin染色呈陽(yáng)性,純度大于95%。從圖中可以看見(jiàn)明顯的心肌特異性橫紋結(jié)構(gòu),并且在鏡下可見(jiàn)心肌細(xì)胞成片同步搏動(dòng),表明心肌細(xì)胞狀態(tài)良好。

    圖1 原代心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)及α-Actin染色鑒定

    2.2 IGF-1對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響

    運(yùn)用MTT法測(cè)定各組心肌細(xì)胞活力,結(jié)果見(jiàn)表1。與正常組相比,缺氧組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05),說(shuō)明缺氧使心肌細(xì)胞存活率下降,對(duì)細(xì)胞活力造成影響;與缺氧組相比,IGF-1干預(yù)顯著提高了細(xì)胞存活率(P<0.05),細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)。IGF-1可以改善缺氧造成的細(xì)胞存活率降低,對(duì)細(xì)胞損傷有顯著抑制作用,這也體現(xiàn)了IGF-1的促生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的功能。

    表1 各組心肌細(xì)胞存活率

    2.3 IGF-1對(duì)LDH、CK、SOD活性以及MDA含量的影響

    心肌細(xì)胞缺氧損傷后LDH、CK活性顯著升高(P<0.05),說(shuō)明缺氧造成心肌細(xì)胞明顯損傷,SOD活性下降(P<0.05),MDA含量顯著上升(P<0.05)。而IGF-1處理則緩解了這種損傷,明顯降低了LDH、CK活性(P<0.05),使SOD活性顯著升高(P<0.05),MDA含量顯著降低(P<0.05)。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。LDH、CK、SOD活性和MDA含量可以評(píng)價(jià)細(xì)胞應(yīng)激損傷的程度。缺氧會(huì)造成細(xì)胞氧化系統(tǒng)的失衡,自由基堆積,引起細(xì)胞損傷。而IGF-1對(duì)這種應(yīng)激損傷具有一定抑制作用,可以減少心肌細(xì)胞氧自由基生成,有利于心肌損傷后的恢復(fù)。

    表2 各組LDH、CK和SOD活性及MDA含量

    3 結(jié)論

    近年來(lái),IGF-1在心血管疾病中的作用被重視。有研究發(fā)現(xiàn),IGF-1可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和抵抗細(xì)胞死亡,與心肌細(xì)胞的發(fā)育和生長(zhǎng)密切相關(guān),顯示出對(duì)心血管疾病的保護(hù)作用[5]。另有研究報(bào)道,IGF-1在損傷心肌細(xì)胞中表達(dá)異常升高,提示IGF-1在心肌損傷中的重要性[6]。

    CK和LDH是臨床上評(píng)價(jià)心肌損傷的重要標(biāo)志物[7]。當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí),細(xì)胞膜破壞,胞內(nèi)的CK和LDH會(huì)釋放至細(xì)胞外使血液中含量顯著上升而被檢測(cè)到。SOD和MDA是與氧化應(yīng)激相關(guān)的兩個(gè)常用指標(biāo)。SOD活性與其清除自由基的能力相關(guān),當(dāng)SOD活性下降時(shí),清除自由基的能力就減弱,會(huì)導(dǎo)致大量自由基堆積[8]。而自由基堆積會(huì)進(jìn)一步使細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化,MDA則反映了這種過(guò)氧化程度,還可間接反映受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[9]。心肌細(xì)胞缺氧后會(huì)發(fā)生一定損傷,細(xì)胞活力下降,CK和LDH活性明顯上升,而細(xì)胞清除自由基能力下降,即SOD活性下降,自由基堆積造成MDA含量顯著升高。已有研究表明,急性心肌梗死后,IGF-1可以改善其不利的微環(huán)境,進(jìn)而促進(jìn)心肌修復(fù)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中,筆者觀察到IGF-1預(yù)處理緩解了心肌細(xì)胞缺氧后的損傷變化,與缺氧組相比,IGF-1能夠顯著降低CK、LDH活性和MDA含量,提高SOD活性,提升細(xì)胞活力。

    本次研究表明IGF-1是一個(gè)可以有效緩解心肌損傷的生長(zhǎng)因子。其主要通過(guò)抗氧化增強(qiáng)清除自由基能力,增加損傷心肌細(xì)胞活力,從而發(fā)揮心肌細(xì)胞缺氧損傷后的保護(hù)作用。

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