基于E2F5研究強心苷類化合物21-hydroxy-neriaside抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用機制

植韻詩，李晨陽，陳 鐵*

基于E2F5研究強心苷類化合物21-hydroxy-neriaside抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用機制

植韻詩1, 2，李晨陽1，陳 鐵1, 2*

1. 深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，廣東 深圳 518055 2. 深圳大學(xué) 廣東省天然小分子創(chuàng)新藥物工程技術(shù)研究中心，廣東 深圳 518055

探究強心苷類單體化合物21-hydroxy-neriaside的抗胃癌作用及機制。采用CCK-8法考察21-hydroxy-neriaside對胃癌HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞增殖的影響；觀察21-hydroxy-neriaside對HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞形態(tài)的影響；考察21-hydroxy-neriaside對HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞集落形成的影響；采用RNA測序探究21-hydroxy-neriaside抑制胃癌細(xì)胞增殖的可能機制；采用qRT-PCR驗證RNA測序結(jié)果；考察shRNA-E2F轉(zhuǎn)錄因子5（E2F transcription factor 5，E2F5）對GT112細(xì)胞E2F5表達的影響；采用Western blotting檢測21-hydroxy-neriaside對HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞E2F5、骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）、細(xì)胞周期D1（Cyclin D1）、細(xì)胞周期E2（Cyclin E2）和剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase，cleaved PARP]蛋白表達的影響。CCK-8實驗、形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞克隆形成實驗均表明21-hydroxy-neriaside具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的活性，與時間和藥物濃度呈正相關(guān)。RNA測序、qRT-PCR和shRNA-E2F5慢病毒轉(zhuǎn)染實驗表明21-hydroxy-neriaside通過調(diào)控E2F5影響細(xì)胞周期通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。Western blotting實驗結(jié)果表明21-hydroxy-neriaside組細(xì)胞中E2F5、c-Myc、Cyclin D1和Cyclin E2蛋白表達水平均明顯降低（＜0.05、0.01、0.001），cleaved PARP蛋白表達水平顯著升高（＜0.001）。21-hydroxy-neriaside具有抗胃癌活性，能夠通過下調(diào)E2F5表達來影響細(xì)胞周期通路相關(guān)蛋白，抑制胃癌細(xì)胞生長，從而促使腫瘤細(xì)胞凋亡。

21-hydroxy-neriaside；強心苷類化合物；胃癌細(xì)胞；E2F轉(zhuǎn)錄因子5；細(xì)胞凋亡

國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）2020年報道，胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別占所有腫瘤發(fā)病率和死亡率的第5位和第4位[1]。胃癌具有發(fā)病率高、預(yù)后差、細(xì)胞和分子異質(zhì)性等特點，是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一[2]。我國屬于胃癌的高發(fā)區(qū)，胃癌患病率和死亡率超過世界平均水平的2倍，故胃癌是我國癌癥研究和防治的重點[3]。

當(dāng)前我國對于胃癌的治療主要為手術(shù)切除和化療[4]，但對于中晚期胃癌，化療發(fā)揮更為重要的作用。因此，發(fā)現(xiàn)新型、高效且低毒的化療藥物用以延長晚期胃癌患者的生存期、提高患者的生存質(zhì)量和減輕患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)勢在必行。長春新堿、紫杉醇等新型化療藥物均直接或間接來源于天然產(chǎn)物，具有較好的抗腫瘤作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，天然來源的強心苷類化合物具有一定的抗癌作用，能夠抑制惡性細(xì)胞增殖[5]，使乳腺癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并促進癌細(xì)胞凋亡[6-10]。21-hydroxy-neriaside（圖1）是從夾竹桃L.葉中提取的強心苷類單體化合物，外觀為白色無定形粉末，其分子式為C30H46O8，相對分子質(zhì)量為534.68。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，21-hydroxy-neriaside抗癌活性強，具有良好的藥物研究和臨床應(yīng)用價值[11]。目前尚未有關(guān)于21-hydroxy-neriaside在抗胃癌方面的報道。本研究采用CCK-8法、細(xì)胞克隆形成實驗、RNA測序、qRT-PCR、shRNA-E2F5慢病毒轉(zhuǎn)染和Western blotting技術(shù)，初步探究21-hydroxy-neriaside抑制胃癌細(xì)胞增殖的機制，進一步明確強心苷類化合物的抗癌機制，為強心苷類化合物抗腫瘤的深入研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

胃癌HGC27、MGC803細(xì)胞購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；原位胃癌GT0603、GT112細(xì)胞由本課題組分離培養(yǎng)[12]。

圖1 21-hydroxy-neriaside的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 藥品與試劑

21-hydroxy-neriaside（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%）為天津中醫(yī)藥大學(xué)姜苗苗教授惠贈；胎牛血清（批號2176404）、PBS（批號8120015）購自美國Gibco公司；胰酶（批號J210006）、青鏈霉素（批號J210031）、DMEM培養(yǎng)基（批號AG29871451）購自上海HyClone公司；發(fā)光A液和B液（批號1735602）購自美國Millpore公司；蛋白酶抑制劑（批號HY-K0010）、磷酸酶抑制劑（批號HY-K0021）、Marker（批號01022134）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8凋亡試劑盒（批號BJ05203090）購自北京Bioss公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號SHBH2446V）購自美國Sigma公司；PVDF膜（批號R7KA8936A）購自美國Immobilon-PSQ公司；E2F轉(zhuǎn)錄因子5（E2F transcription factor 5，E2F5）抗體（批號9）、骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）抗體（批號12）、細(xì)胞周期E2（Cyclin E2）抗體（批號7）、細(xì)胞周期D1（Cyclin D1）抗體（批號4）、剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase，cleaved PARP]抗體（批號15）、β-actin抗體（批號32）、脫脂奶粉（批號17）、HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（批號24）、HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（批號31）購自美國CST公司；RNA提取試劑盒（批號DP315-R）購自北京天根生化科技公司；熒光定量PCR試劑盒（批號RR820A）購自大連寶生物工程公司；RIPA細(xì)胞裂解液（批號MAO152-Jan-18H）購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑盒（批號251808）購自美國Invitrogen公司。

1.3 儀器

AC2-4S8-NS型二級生物安全柜、371型細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000c型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；AXIO-Axiocam 503 color型倒置顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；6000 EXP TOUCH型凝膠成像分析系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器公司）；EPOCH2NS型吸收光酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell小型垂直電泳儀、T100型PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞用含100 U/mL雙抗（青霉素和鏈霉素）、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法測定細(xì)胞存活率

取處于對數(shù)生長期的HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞，消化離心后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，取100 μL細(xì)胞懸液接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。分別加入終濃度為4、8、12、16、20 μmol/L的21-hydroxy-neriaside，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，對照組加入等體積DMSO。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)1～2 h后取出，振蕩1 min后，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（）值。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

按“2.2”項下方法處理細(xì)胞，分別加入終濃度為8、16、20 μmol/L的21-hydroxy-neriaside，對照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照記錄。

2.4 細(xì)胞克隆形成實驗

取處于對數(shù)生長期的HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為500個/mL，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液至12孔板中，培養(yǎng)48 h后，分別加入終濃度為16、20 μmol/L的21-hydroxy-neriaside，對照組加入等體積DMSO。培養(yǎng)48 h后更換為新鮮預(yù)溫不含藥物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1～2周后棄去培養(yǎng)基，每孔用PBS清洗2次后，無水甲醇固定15 min，棄無水甲醇，每孔加入0.5 mL結(jié)晶紫染液染色20 min，洗凈多余染料后室溫干燥并拍照。計數(shù)每孔中染色的集落數(shù)，以DMSO處理的腫瘤細(xì)胞為對照，計算腫瘤細(xì)胞集落形成抑制率。

集落形成抑制率＝(對照組集落數(shù)－給藥組集落數(shù))/對照組集落數(shù)

2.5 RNA測序

取處于對數(shù)生長期的HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.25×105個/mL，加入4 mL細(xì)胞懸液至6 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。加入終濃度為16 μmol/L的21-hydroxy-neriaside，對照組加入等體積DMSO。培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，加入1 mL的TRIzol試劑，反復(fù)吹打均勻后轉(zhuǎn)移EP管中，對提取的RNA樣本進行Illumina建庫測序后，得到原始數(shù)據(jù)及clean-reads，將原始基因表達量進行標(biāo)準(zhǔn)化。采用R語言包對差異表達基因進行分析，通過Metascape數(shù)據(jù)平臺對差異表達基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2.6 cDNA合成及qRT-PCR驗證

“2.5”項下提取出的總RNA滿足質(zhì)檢條件后，根據(jù)常規(guī)反應(yīng)體系配制反應(yīng)混合液置于PCR儀中反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。取足夠?qū)嶒炇褂皿w積的對照組及給藥組cDNA，采用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒配制PCR反應(yīng)液（β-actin作為內(nèi)參），根據(jù)差異基因上下調(diào)表達情況選擇候選基因，設(shè)計引物進行擴增，采用2?ΔΔCt方法計算趨勢表達基因mRNA相對表達量，重復(fù)3次。通過Primer Bank查詢引物序列并合成引物（表1）。

2.7 shRNA-E2F5慢病毒轉(zhuǎn)染

取處于對數(shù)生長期的GT112細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，取2 mL細(xì)胞懸液接種到6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，對其進行慢病毒轉(zhuǎn)染（shRNA-序列為GGAGGTACCCATTCCAGAAAT）。轉(zhuǎn)染48 h后，于熒光顯微鏡下觀察E2F5表達情況，并統(tǒng)計轉(zhuǎn)染效率。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 (5’-3’)大小/bp E2F5F: TTCAGCAGGATCTATTAGTGGAG191 R: AGATAACAGTCCCAAGTTTCCAT191 β-actinF: TGTCACCAACTGGGACGATA165 R: GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA165

2.8 Western blotting檢測E2F5、c-Myc、Cyclin D1、Cyclin E2和cleaved PARP蛋白表達

取處于對數(shù)生長期的HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.25×105個/mL，加入4 mL細(xì)胞懸液至6 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為16 μmol/L的21-hydroxy-neriaside，對照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入6×Loading buffer，100 ℃加熱10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h；分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌3次，每次5 min；加入二抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，顯影。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 9、Image J和SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，每個實驗至少重復(fù)3次，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用檢驗。

3 結(jié)果

3.1 21-hydroxy-neriaside對HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞增殖的影響

如圖2所示，隨著21-hydroxy-neriaside濃度的增加，其對HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞存活率的抑制作用逐漸增強。如表2所示，隨著作用時間的積累，21-hydroxy-neriaside對GT0603和MGC803細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）呈下降趨勢，藥物的抑制作用增強；而21-hydroxy-neriaside對GT112和HGC27細(xì)胞的IC50在藥物處理72 h后略微上升，但仍低于藥物處理24 h的IC50，說明21-hydroxy-neriaside對其增殖有一定的抑制作用。21-hydroxy-neriaside對GT112、GT0603和HGC27細(xì)胞的增殖抑制作用較強，故以上述3個細(xì)胞株進行后續(xù)實驗，后續(xù)實驗21-hydroxy-neriaside的濃度設(shè)置為16、20 μmol/L，處理時間為48 h。

3.2 21-hydroxy-neriaside對HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖3所示，對照組細(xì)胞生長旺盛，伸展性良好，細(xì)胞間排列緊密，形狀基本上是不規(guī)則的多邊形（MGC803細(xì)胞則相對規(guī)則），胞體飽滿，漂浮細(xì)胞較少；各給藥組細(xì)胞隨藥物濃度增加，細(xì)胞的增殖速度減慢，胞間的縫隙明顯變大，胞體逐漸萎縮變圓，從培養(yǎng)皿脫落并漂浮于培養(yǎng)基表面，體積和密度顯著降低而失去正常細(xì)胞形態(tài)。21-hydroxy-neriaside對4種胃癌細(xì)胞的生長均有抑制作用，其結(jié)果與CCK-8實驗基本相符。

3.3 21-hydroxy-neriaside對HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞集落形成的影響

胃癌細(xì)胞經(jīng)16、20 μmol/L的21-hydroxy-neriaside處理48 h后，觀察細(xì)胞克隆數(shù)目和克隆體積大小，如圖4所示，各給藥組細(xì)胞克隆數(shù)顯著減少（＜0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性，表明21- hydroxy-neriaside對3種胃癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，與CCK-8實驗結(jié)果基本相符。

圖2 21-hydroxy-neriaside對HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞存活率的影響(, n = 3)

表2 各細(xì)胞系在21-hydroxy-neriaside處理下不同時間點的IC50

Table 2 IC50 of each cell line at different time points under the treatment of 21-hydroxy-neriaside

細(xì)胞系t/hIC50/(μmol·L?1)細(xì)胞系t/hIC50/(μmol·L?1) GT112細(xì)胞2417.38±0.01MGC803細(xì)胞2434.06±0.02 4813.93±0.01 4824.59±0.01 7216.64±0.01 7222.44±0.01 GT0603細(xì)胞2413.53±0.01HGC27細(xì)胞2431.34±0.04 4812.07±0.01 487.60±0.02 7211.50±0.01 729.40±0.02

圖3 21-hydroxy-neriaside對HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞形態(tài)的影響

3.4 RNA測序探究21-hydroxy-neriaside抑制胃癌細(xì)胞增殖的可能機制

如圖5所示，對GT112、GT0606、HGC27細(xì)胞的給藥組和對照組進行差異分析，分別篩選出483、825、361個基因，3個細(xì)胞的共有差異基因為44個。

經(jīng)過篩查44個差異基因發(fā)現(xiàn)，3個胃癌細(xì)胞株的共同下調(diào)基因有36個，共同上調(diào)基因有1個。為了探究21-hydroxy-neriaside抑制胃癌細(xì)胞增殖所涉及到的細(xì)胞通路調(diào)控過程，對上述44個共有差異基因進行KEGG通路富集分析，將相關(guān)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對（圖6），在20條差異基因富集的通路中，富集顯著的通路有細(xì)胞周期、-谷氨酰胺和-谷氨酸代謝、細(xì)胞衰老、轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路等。其中，細(xì)胞周期通路中有4個重要差異基因［、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，）、細(xì)胞分裂后期促進復(fù)合物亞基13（anaphase promoting complex subunit 13，）、透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白4（hyaluronan binding protein 4，）]在表達量上發(fā)生了顯著變化。

與對照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

圖5 21-hydroxy-neriaside處理后HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞的差異基因Venn圖

3.5 qRT-PCR驗證RNA測序結(jié)果

根據(jù)RNA測序的結(jié)果，4個重要差異基因中只有、、基因共同下調(diào)。和下調(diào)促進癌細(xì)胞生長；而下調(diào)抑制癌細(xì)胞增殖，據(jù)此本研究選擇作為研究對象，采用qRT-PCR技術(shù)對重要差異基因的表達情況進行檢測，驗證21-hydroxy-neriaside調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的機制。如圖7所示，經(jīng)21-hydroxy-neriaside處理后，HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞中基因表達水平均顯著降低（＜0.01、0.001），與RNA測序結(jié)果一致。

3.6 shRNA-E2F5對GT112細(xì)胞E2F5表達的影響

如圖8所示，shRNA-E2F5慢病毒轉(zhuǎn)染效率大于95%，且成功轉(zhuǎn)染E2F5后，細(xì)胞中E2F5蛋白表達顯著下調(diào)（＜0.001），能夠抑制癌細(xì)胞增殖，達到殺傷胃癌細(xì)胞的作用。

3.7 Western blotting檢測21-hydroxy-neriaside對HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞E2F5、c-Myc、Cyclin D1、Cyclin E2和cleaved PARP蛋白表達的影響

KEGG分析顯著富集的通路有細(xì)胞周期，細(xì)胞周期信號通路中、、為E2F5的下游基因。如圖9所示，與對照組比較，給藥組c-Myc、Cyclin D1、Cyclin E2、E2F5的蛋白表達水平均明顯下降（＜0.05、0.01、0.001），cleaved PARP蛋白表達水平顯著升高（＜0.001）。表明21-hydroxy-neriaside通過調(diào)控細(xì)胞周期，促進胃癌細(xì)胞凋亡。

與對照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

A-免疫熒光檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后GT112細(xì)胞中E2F5蛋白表達 B-Western blotting檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后GT112細(xì)胞中E2F5蛋白表達 與對照組比較：***P＜0.001

4 討論

當(dāng)前胃癌的發(fā)病率仍然偏高，且病死率一直居高不下。近年來，化療藥取得了長足的進步，然而在胃癌治療中，化療藥選擇有限，而且在長期的藥物治療中，還存在細(xì)胞耐藥性的問題。因此開發(fā)潛在有效的抗腫瘤藥物并明確其抗腫瘤機制將有效改善目前胃癌治療的困境。本研究通過CCK-8法、形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞克隆形成實驗初步證實21-hydroxy-neriaside的體外抗腫瘤作用。RNA測序表明，細(xì)胞周期通路上有4個重要差異基因（、、、）的表達發(fā)生了顯著變化，然而，只有、、基因明顯下調(diào)。

E2F5是一種重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，其結(jié)合位點存在于許多基因的啟動子中，其下游轉(zhuǎn)錄基因與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，能夠調(diào)控細(xì)胞周期。研究表明，在前列腺腫瘤細(xì)胞和肝腫瘤細(xì)胞中，E2F5的表達上調(diào)[13-14]。CDKN1A是一種抑癌基因，參與由DNA損傷引起的p53/TP53介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制，并抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）活性，從而阻斷關(guān)鍵的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物磷酸化，進而抑制細(xì)胞周期。在胃癌細(xì)胞中，CDKN1A表達水平較低[15]。ANAPC13是細(xì)胞分裂后期促進復(fù)合物/環(huán)體（anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C）的組成部分，同時也是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的E3泛素連接酶（E3 ubiquitin ligase mind bomb 2，MIB2），可以控制有絲分裂和調(diào)控細(xì)胞周期G1期。APC/C復(fù)合物主要通過細(xì)胞分裂周期蛋白20（cell division cycle 20，CDC20）和E-鈣黏蛋白基因來協(xié)同調(diào)控細(xì)胞周期，二者的失調(diào)會引起細(xì)胞染色體的異常變化或癌癥的發(fā)生[16-17]。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

CDKN1A和ANAPC13的正常表達不利于腫瘤細(xì)胞生長，其表達下調(diào)則利于癌細(xì)胞生長；而E2F5的正常表達利于腫瘤細(xì)胞的生長，其表達下調(diào)則可抑制癌細(xì)胞的增殖。qRT-PCR和shRNA-E2F5慢病毒轉(zhuǎn)染表實驗表明，經(jīng)21-hydroxy-neriaside處理后，胃癌細(xì)胞E2F5表達下調(diào)，與RNA測序的結(jié)果一致，可以證明RNA測序結(jié)果的正確性。研究表明，c-Myc為E2F5調(diào)控的下游蛋白，Cyclin E2、Cyclin D1為c-Myc調(diào)控的下游蛋白，能夠調(diào)控細(xì)胞周期，并促進細(xì)胞增殖[18-21]。Western blotting實驗結(jié)果表明，經(jīng)21-hydroxy-neriaside處理后，GT112、GT0603和HGC27細(xì)胞中c-Myc、Cyclin E2和Cyclin D1蛋白表達水平降低，與RNA測序結(jié)果一致；cleaved PARP蛋白表達水平升高，表明21-hydroxy-neriaside可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

綜上，21-hydroxy-neriaside可能通過調(diào)控E2F5來影響細(xì)胞周期通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanisms of cardiac glycoside monomeric compound 21-hydroxy-neriaside on inhibiting proliferation of gastric cancer cells based on E2F5

ZHI Yun-shi1, 2, LI Chen-yang1, CHEN Tie1, 2

1. School of Pharmaceutical Sciences, Health Science Center, Shenzhen University, Shenzhen 518055, China 2. Guangdong Natural Small Molecule Innovative Drug Engineering Technology Research Center, Shenzhen University, Shenzhen 518055, China

To explore anti-tumor effect and mechanisms of cardiac glycoside monomeric compound 21-hydroxy-neriaside against gastric cancer.The effect of 21-hydroxy-neriaside on proliferation of gastric cancer HGC27, MGC803, GT0603 and GT112 cells was investigated by CCK-8 method; The effect of 21-hydroxy-neriaside on morphology of HGC27, MGC803, GT0603 and GT112 cells was observed; The effect of 21-hydroxy-neriaside on colony formation of HGC27, GT0603 and GT112 cells was observed; RNA sequencing was used to explore the possible mechanism of 21-hydroxy-neriaside inhibiting gastric cancer cell proliferation; qRT-PCR was used to verify RNA sequencing results; The effect of shRNA-E2F transcription factor 5 (E2F5) on E2F5 expression of GT112 cells was investigated; Western blotting was used to detect the effect of 21-hydroxy-neriaside on E2F5, cellular-myelocytomatosis viral oncogene (c-Myc), cell cycle D1 (Cyclin D1), cell cycle E2 (Cyclin E2) and cleaved poly(ADP-ribose) polymerase (cleaved PARP) protein expressions in HGC27, GT0603 and GT112 cells.CCK-8 assay, morphological observation and cell clone formation assay showed that 21-hydroxy-neriaside had the activity of inhibiting the proliferation of gastric cancer cells, which was positively correlated with time and drug concentration. RNA sequencing, qRT-PCR and shRNA-E2F5 lentiviral transfection experiments showed that 21-hydroxy-neriaside affected cell cycle pathways by regulating E2F5, thereby inhibiting tumor cell growth. The results of Western blotting showed that the protein expression levels of E2F5, c-Myc, Cyclin D1 and Cyclin E2 in 21-hydroxy-neriaside group were significantly decreased (< 0.05, 0.01, 0.001), and cleaved PARP protein expression level was significantly increased (< 0.001).21-Hydroxy-neriaside has anti-gastric cancer activity. It can affect cell cycle pathway-related proteins by down-regulating E2F5 expression, inhibit the growth of gastric cancer cells, and promote tumor cell apoptosis.

21-hydroxy-neriaside; cardiac glycoside; gastric tumor cells; E2F transcription factor 5; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)18 - 5712 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.014

2022-05-23

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項目（B2020031）

植韻詩（1997—），女，碩士研究生，研究方向為胃癌藥理學(xué)。E-mail: 2070245062@email.szu.edu.cn

陳 鐵，男，碩士生導(dǎo)師，研究方向為消化道腫瘤干細(xì)胞的靶向治療和腫瘤藥理。E-mail: tiechen@szu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]