基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)經(jīng)典名方二冬湯質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）預(yù)測(cè)分析

帥麗霞，陳 旺，袁 袁，阮 佳，詹 雁，徐超群*

基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)經(jīng)典名方二冬湯質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）預(yù)測(cè)分析

帥麗霞1, 2，陳 旺1, 2，袁 袁1, 2，阮 佳2，詹 雁2，徐超群2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611100 2. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041

基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析預(yù)測(cè)二冬湯潛在的質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）。采用HPLC建立15批二冬湯指紋圖譜，并對(duì)其峰進(jìn)行指認(rèn)和歸屬，同時(shí)采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012版），并結(jié)合層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析、評(píng)價(jià)不同批次樣品質(zhì)量差異；基于可測(cè)性和可溯源性篩選出6個(gè)Q-Marker候選成分，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建二冬湯“成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)，分析二冬湯的潛在Q-Marker。建立了26個(gè)共有峰的指紋圖譜，指認(rèn)了新芒果苷、芒果苷、金絲桃苷、黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸銨、千層紙素-3--β--葡萄糖醛酸苷7個(gè)共有色譜峰，15批指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度均大于0.97，15批樣品聚為2類；采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析得出新芒果苷、芒果苷、金絲桃苷、黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸銨6個(gè)成分可能為二冬湯潛在的Q-Marker，其可能通過調(diào)節(jié)胰島素、Ras相關(guān)蛋白1（Ras-associated protein 1，Rap1）、肝炎等信號(hào)通路發(fā)揮養(yǎng)陰清熱、生津止渴的功效。建立的指紋圖譜分析方法靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠；并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)6個(gè)成分具有傳遞性和溯源性，且與二冬湯功效有關(guān)，可作為其潛在的Q-Marker，為二冬湯進(jìn)一步研究提供參考。

經(jīng)典名方；二冬湯；指紋圖譜；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；質(zhì)量標(biāo)志物；新芒果苷；芒果苷；金絲桃苷；黃芩苷；漢黃芩苷；甘草酸銨；千層紙素-3--β--葡萄糖醛酸苷；傳遞性；溯源性

經(jīng)典名方是中醫(yī)發(fā)展和歷代醫(yī)家臨床實(shí)踐的結(jié)晶，凝結(jié)著各代醫(yī)家的智慧，開發(fā)與研究經(jīng)典名方既有利于傳承中醫(yī)文化，有利于現(xiàn)代中醫(yī)藥的發(fā)展。2018年，國家中醫(yī)藥管理局公布了《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[1]，二冬湯被收錄于其中。二冬湯出自清代程國彭所著的《醫(yī)學(xué)心悟》卷三[2]，全方由天冬、麥冬、天花粉、黃芩、知母、甘草、人參、荷葉組成，主治上消，具有養(yǎng)陰清熱、生津止渴之功效，臨床上常被用于治療糖尿病、百日咳、肺結(jié)核、慢性支氣管炎、陰虛咳嗽等[3-8]。

因中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，檢測(cè)其任何一種成分均不能代表其整體藥效，且由于中藥的復(fù)雜性導(dǎo)致中藥質(zhì)量控制指標(biāo)與其有效性關(guān)聯(lián)度低且專屬性差等問題，因此劉昌孝院士[9]于2016年首次提出了質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）的概念，旨在更好地控制中藥材的質(zhì)量[10]。而中藥指紋圖譜能全面、定量地分析中藥所包含的化學(xué)信息，是中藥質(zhì)量控制的重要手段，同時(shí)在經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)的研究中也成為重要手段[11]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治原則一致，其通過建立“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)關(guān)系圖可以直觀反映藥物發(fā)揮藥效的特點(diǎn)，增加復(fù)方臨床應(yīng)用的科學(xué)性[12]。本研究將指紋圖譜與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合，并應(yīng)用相似度評(píng)價(jià)軟件和聚類分析，可以更加系統(tǒng)、全面地對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制，預(yù)測(cè)其發(fā)揮藥效的潛在Q-Marker，并同時(shí)分析指紋圖譜的質(zhì)量控制指標(biāo)是否合理，可為二冬湯后續(xù)研究提供可行性參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Sigma TGL-16G型高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；SB-XS205型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；2L液體加熱器，康雅順公司。

1.2 材料

芒果苷、金絲桃苷、黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸銨對(duì)照品，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110607-201704、111521-201809、110715-202122、112002-2-1702、110731-201910，質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為98.1%、94.9%、94.2%、98.0%、98.0%；新芒果苷、千層紙素-3--β--葡萄糖醛酸苷對(duì)照品，四川德思特樂美天有限公司，批號(hào)分別為DST201128-017、DST200802-040，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98.0%。

藥材購置于不同產(chǎn)地，15批藥材來源見表1，均由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定，天冬為百合科天冬屬植物天冬(Lour.) Merr.的干燥塊根，麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬(L. f) Ker-Gawl.的干燥塊根，天花粉為葫蘆科栝樓屬植物栝樓Maxim.的干燥根，黃芩為唇形科黃芩屬植物黃芩Georgi的干燥根，知母為百合科知母屬植物知母Bge.的干燥根莖，荷葉為睡蓮科蓮屬植物蓮Gaertn.的干燥葉，人參為五加科人參屬植物人參C. A. Mey.的干燥根和根莖，甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室阮佳研究員按《中國藥典》2020年版檢測(cè)炮制后符合要求。采用隨機(jī)數(shù)字表法將不同批次飲片進(jìn)行組合，結(jié)果見表2。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

MS Technologies Target-Core C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，2%乙腈；5～15 min，2%～6%乙腈；15～30 min，6%～9%乙腈；30～65 min，9%乙腈；65～70 min，9%～14%乙腈；70～85 min，14%～16%乙腈；85～95 min，16%～17%乙腈；95～105 min，17%乙腈；105～115 min，17%～20%乙腈；115～120 min，20%～27%乙腈；120～140 min，27%～33%乙腈；140～141 min，33%～90%乙腈；141～142 min，90%乙腈；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30 ℃。

表1 二冬湯藥材來源

Table 1 Source of Chinese medicinal materials of Erdong Decoction

藥材產(chǎn)地（批號(hào)） 天冬云南永勝（120201011～120201015）、貴州石阡（120201021～120201025）、四川綿陽（120201031～120201035） 麥冬四川三臺(tái)（220210511～220210515）、浙江慈溪（2202010721～2202010725）、浙江杭州（2202010731～2202010735） 天花粉江蘇泗陽（320201111～320201115）、河北安國（320201121～320201125）、河南濮陽（320201131～320201135） 黃芩河北圍場(chǎng)（420201111～420201115）、山西絳縣（420201121～420201125）、陜西商洛（420201131～420201135） 知母河北易縣（520201111～520201115）、安徽毫州（520201121～520201125）、山西絳縣（520201131～520201135） 荷葉江西石城（620210811～620210815）、山東曹縣（620210821～620210825）、湖南湘潭（620210831～620210835） 人參吉林撫松（720201011～720201015）、黑龍江鶴崗（720201021～720201025）、吉林長(zhǎng)春（720201031～720201035） 甘草甘肅酒泉（820201111～820201115）、內(nèi)蒙古赤峰（820201121～820201125）、寧夏吳忠（820201131～820201135）

表2 15批二冬湯樣品飲片批號(hào)

Table 2 15 batches of Erdong Decoction sample pieces

批號(hào)天冬麥冬天花粉黃芩知母荷葉人參甘草 S11202010152202010731320201111420201125520201123620210812720201022820201134 S21202010122202010123320201135420201121520201113620210822720201034820201131 S3120201011220210512320201123420201135520201121620210831720201013820201115 S4120201031220210511320201125420201123520201134620210835720201012820201122 S51202010332202010731320201124420201113520201121620210815720201014820201133 S61202010342202010122320201133420201122520201133620210811720201015820201112 S71202010232202010733320201115320201114520201135620210821720201031820201123 S8120201035220210515320201132420201134520201125620210834720201011820201111 S91202010132202010121320201114420201124520201112620210823720201025820201135 S101202010142202010735320201131320201115520201132620210832720201033820201125 S11120201024220210513320201122420201133520201114620210825720201032820201124 S121202010222202010125320201121320201111520201115620210813720201035820201114 S131202010212202010732320201134320201112520201131620210824720201023820201123 S14120201032220210514320201113420201131520201111620210814720201021820201113 S151202010252202010124320201112420201132520201124620210833720201024820201132

2.2 溶液的制備

2.2.1 水煎液的制備 二冬湯始載于清代程國彭所著的《醫(yī)學(xué)心悟》卷三，文中記載：“大法，治上消者，宜潤(rùn)其肺，兼清其胃，二冬湯主之…治上消，天冬（二錢，去心），麥冬（三錢，去心），花粉（一錢），黃芩（一錢），知母（一錢），甘草（五分），人參（五分），荷葉一錢，水煎服?！备鶕?jù)中醫(yī)藥管理局頒布的古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表（7首方劑）[13]并查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定，清代一錢等于現(xiàn)今3.73 g，一錢等于十分。因方中煎服方法僅有“水煎服”，故參照2009年國家中醫(yī)藥管理局關(guān)于印發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》和有關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)，確定二冬湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法：稱取天冬11.19 g，麥冬16.78 g，天花粉5.60 g，黃芩5.60 g，知母5.60 g，甘草2.81 g，人參2.81 g，荷葉5.60 g，共55.60 g，加純凈水650 mL，加蓋浸泡30 min，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，藥渣再加550 mL水加熱煮沸30 min，趁熱用100目濾布濾過，合并2次濾液，放冷加自來水定容至1000 mL量瓶中，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品的制備 精密稱取新芒果苷、芒果苷、金絲桃苷、黃芩苷、千層紙素-3--β--葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、甘草酸銨適量于25 mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.128、0.048、0.040、0.072、0.052、0.048、1.960 g/L的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.2.1”項(xiàng)下制備得到的二冬湯水煎液5 mL，10 000 r/min離心（離心半徑5 cm）10 min，取上清液過0.24 μm水相微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一水煎液（S1）供試品溶液，分別在制樣后0、2、4、8、12、24 h后測(cè)定，以23號(hào)色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.6%，相對(duì)峰面積的RSD均小于4%，各圖譜相似度均大于0.96，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一份水煎液（S1）供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以23號(hào)色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.4%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，各圖譜相似度均大于0.96，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一水煎液（S1），按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以23號(hào)峰為參照峰（S），結(jié)果各峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.4%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5%，各圖譜相似度均大于0.95，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 二冬湯指紋圖譜的建立

取15批二冬湯供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋譜圖相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以S1為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)定為0.1 min，采用中位數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和Mark峰匹配，生成二冬湯指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜（共有模式，R），結(jié)果見圖1。共標(biāo)定26個(gè)共有峰，其中指認(rèn)7個(gè)共有峰，分別為4號(hào)峰新芒果苷、6號(hào)峰芒果苷、10號(hào)峰金絲桃苷、17號(hào)峰黃芩苷、21號(hào)峰千層紙素-3--β--葡萄糖醛酸苷、23號(hào)峰漢黃芩苷、26號(hào)峰甘草酸銨。

2.5 共有峰歸屬

取二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)樣品S1以及缺天冬、缺麥冬、缺天花粉、缺黃芩、缺知母、缺甘草、缺人參、缺荷葉的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)合色譜峰的保留時(shí)間及紫外吸收?qǐng)D，通過對(duì)比分析，對(duì)26個(gè)共有峰進(jìn)行歸屬，見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4～7號(hào)峰來自知母，11、15～24號(hào)峰來自黃芩，1、9、10～14號(hào)峰來自荷葉，25、26號(hào)峰來自甘草，2、3號(hào)峰為知母荷葉共有峰，黃芩在該條件下出峰較多，因天冬、麥冬、天花粉成分大多為多糖類，本身藥典也無紫外檢測(cè)，故在本指紋圖譜下無貢獻(xiàn)。

4-新芒果苷 6-芒果苷 10-金絲桃苷 17-黃芩苷 21-千層紙素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 23-漢黃芩苷 26-甘草酸銨

2.6 相似度分析

以對(duì)照指紋圖譜為參照，計(jì)算15批二冬湯樣品圖譜相似度分別為0.976、0.976、0.976、0.976、0.999、0.997、0.994、0.997、0.999、0.993、0.981、0.994、0.998、0.995、0.995，相似度良好，均在0.90以上，表明所建立的指紋圖譜穩(wěn)定，可以反應(yīng)其指紋特征，樣品S1～S4、S11相似度小于0.99，表明不同產(chǎn)地、批次之間物質(zhì)基準(zhǔn)存在質(zhì)量差異。

圖2 二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)特征峰歸屬

2.7 HCA

HCA常用于數(shù)據(jù)的初步探索性分析，具有直觀、結(jié)論形式簡(jiǎn)明的特點(diǎn)[14]。采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)15批樣品的共有峰的峰面積進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用組間連接法，測(cè)量區(qū)間為平方歐氏距離，聚類結(jié)果見圖3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)歐氏距離為10時(shí)，將15批二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)可分為2類，樣品S1、S5、S9、S11、S15為第1類，樣品S2～S4、S6～S8、S10、S12～S15為第2類，表明不同產(chǎn)地間藥材質(zhì)量存在一定的差異性。

2.8 基于成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.8.1 基于可測(cè)性和可溯性的候選化合物篩選 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究，黃芩主要成分為多糖和黃酮類，黃芩的質(zhì)量控制指標(biāo)黃芩苷在控制高血糖中發(fā)揮重要作用，其可以通過增加人體谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，Gpx）活性，降低三酰甘油與總膽固醇水平，從而改善人體血糖，漢黃芩苷也為其黃酮類成分，具有抗炎、保護(hù)心腦血管等作用[15]。知母的主要成分為皂苷、雙苯吡酮類、生物堿類，知母的質(zhì)量控制指標(biāo)芒果苷和其他成分如新芒果苷具有良好的降血糖作用[16]。甘草主要成分為三萜類、黃酮類、多糖類等其它成分，甘草的控制指標(biāo)甘草酸具有較好的降血糖、調(diào)節(jié)免疫和抗動(dòng)脈粥樣化作用[17]。荷葉的主要活性成分為生物堿和黃酮類，金絲桃苷具有調(diào)脂作用[18]。天冬、麥冬、人參主要活性成分為皂苷和多糖類，天花粉的活性成分為多糖類。結(jié)合文獻(xiàn)研究和指紋圖譜研究，以上6個(gè)成分均可以得到指認(rèn)和測(cè)定，且能夠?qū)崿F(xiàn)飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物的傳遞?；诳蓽y(cè)性和可溯性，將以上6個(gè)化合物作為候選化合物。利用NCBI數(shù)據(jù)（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/）查找這6個(gè)候選化合物的Canonical SMILES，為后續(xù)研究做準(zhǔn)備。

圖3 15批二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)的HCA樹狀圖

2.8.2 二冬湯主要化學(xué)成分的靶蛋白預(yù)測(cè) 將6個(gè)活性成分的Canonical SMILES分別輸入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（https://www.swisstarget prediction.ch/）進(jìn)行其對(duì)應(yīng)靶蛋白的預(yù)測(cè)，將相關(guān)靶蛋白進(jìn)行整理，去除重復(fù)靶點(diǎn)，共得到6個(gè)活性成分作用的252個(gè)靶點(diǎn)。

2.8.3 蛋白-蛋白相互作用（protein-protenin interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將通過篩選得到的252個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入在線數(shù)據(jù)庫STRING（http://string-db. org）進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，選擇物種為“Homo sapiens”，蛋白交互評(píng)分值“high confidence＞0.9”，并隱藏?zé)o聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，其余參數(shù)設(shè)置保持不變，得到242個(gè)靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。將PPI的分析結(jié)果以TSV文本格式導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，并利用其中的“Network Analyzer”功能對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，選取計(jì)算選取度值（degree）、介數(shù)中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）3個(gè)拓?fù)鋮?shù)均大于中位數(shù)且度值≥10的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。經(jīng)過篩選共得到21個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，結(jié)果見表3。

圖4 242個(gè)靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表3 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

Table 3 Topological properties of target network

靶點(diǎn)名稱介數(shù)中心性接近中心性度值 PTPN1protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 10.015 50.329 310 JUNJun proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit0.022 00.354 313 SYKspleen associated tyrosine kinase0.003 50.352 513 HDAC1histone deacetylase 10.062 90.321 415 SRCSRC proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase0.308 00.438 343 ITGB3integrin subunit beta 30.014 10.351 615 INSRinsulin receptor0.008 60.324 510 STAT3signal transducer and activator of transcription 30.219 70.402 932 MAPK14mitogen-activated protein kinase 140.014 50.355 312 NR3C1nuclear receptor subfamily 3 group C member 10.026 00.341 813 PRKCZprotein kinase C zeta0.006 40.332 512 EGFRepidermal growth factor receptor0.064 80.384 616 IL2interleukin 20.011 70.340 114 ARandrogen receptor0.035 70.036914 CASP8caspase 80.037 80.348 813 PIK3CAphosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha0.026 60.380 324 LCKLCK proto-oncogene, Src family tyrosine kinase0.062 20.385 724 CASP3caspase 30.026 90.319 114 KDRkinase insert domain receptor0.033 90.356 213 GRB2growth factor receptor bound protein 20.047 40.369 923 PRKACAprotein kinase cAMP-activated catalytic subunit alpha0.063 00.384 612

2.8.4 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用David6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf. gov/）對(duì)篩選得到的22個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能分析和KEGG通路分析均選取“≤0.01”和“Eenjamini≤0.01”，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

GO功能分析共得到49個(gè)條目，其中生物過程（biological process，BP）占28條，細(xì)胞組成（cell composition，CC）占3條，分子功能（molecular function，MF）占18條。選取部分顯著性強(qiáng)的進(jìn)行展示，見圖5，BP主要包括蛋白質(zhì)生成、RNA多聚酶促轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)（egulation of transcription from RNA polyerase prometer）和酶結(jié)合等方面；CC主要涉及質(zhì)膜、ATP結(jié)合等過程；MF主要涉及胞漿、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等方面。KEGG富集分析共得到條56通路。選取部分顯著性強(qiáng)的進(jìn)行展示，見圖6。根據(jù)顯示結(jié)果可知，二冬湯的活性成分富集的通路主要包括癌癥、Ras相關(guān)蛋白1（Ras-associated protein 1，Rap1）信號(hào)通路、肝炎等信號(hào)通路。

圖5 二冬湯GO富集分析

圖6 二冬湯KEGG富集分析

2.8.5 成分-靶點(diǎn)-網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 根據(jù)篩選得到的6個(gè)成分、21個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和56條通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，建立二冬湯“成分-靶點(diǎn)-網(wǎng)絡(luò)”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖7，由圖可知，二冬湯作用于多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路發(fā)揮作用。

2.8.6 Q-Marker的分析 二冬湯在臨床上應(yīng)用較為廣泛，可被用于治療糖尿病、百日咳、肺結(jié)核、慢性支氣管炎、陰虛咳嗽等，尤其在治療糖尿病相關(guān)癥狀中具有顯著療效[19-22]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果可知，二冬湯中6個(gè)成分可能作用于蛋白酪磷酸酶N1（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 1，PTPN1）而影響蛋白酪磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase-1B，PTP1B）編碼，而PTP1B是去磷酸化胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中信號(hào)分子磷酸化的酪氨酸殘基，進(jìn)而影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo)[23]；白細(xì)胞介數(shù)- 2（interleukin-2，IL-2）是炎癥因子，在炎癥調(diào)控中起作用；胰島素受體（insulin receptor，INSR）分泌胰島素促進(jìn)組織、細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取與利用，調(diào)節(jié)血糖水平；表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是表皮生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（transforming factor α，TGF-α）的受體，活性成分與該通路相互作用阻斷促炎因子和EGFR的結(jié)合發(fā)揮抗炎作用，增加機(jī)體免疫功能[24]。生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor binding protein 2，GRB2）通過被促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞受體A2（erythropoietin hepatocyte receptor A2，EphA2）調(diào)控參與肝細(xì)胞侵襲[25]。在GO功能富集分析顯示，二冬湯對(duì)蛋白質(zhì)生成、RNA多聚酶促轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，酶結(jié)合等途徑具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。在KEGG富集的通路中，二冬湯主要調(diào)節(jié)癌癥、炎癥、免疫等信號(hào)通路。叉頭框蛋白O（forkhead box protein O，F(xiàn)oxO）通路能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、自噬以及氧化應(yīng)激等反應(yīng)發(fā)揮生物作用，從而影響靶基因葡萄糖6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6ase）和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）表達(dá)，進(jìn)而抑制肝臟糖異生，改善2型糖尿病大鼠血糖異常[26]。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3- kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路是細(xì)胞中一個(gè)典型的信號(hào)通路，該條通路與磷脂酰肌醇和PTK介導(dǎo)衍生信號(hào)通路有關(guān)，其能刺激胰島素對(duì)葡萄糖的攝取與儲(chǔ)存[27]，Rap1是一種能夠調(diào)控細(xì)胞黏附、細(xì)胞極性和細(xì)胞-細(xì)胞連接形成等多種生物過程的小三磷酸鳥苷環(huán)水解酶（guanosine triphosphate cyclic hydrolase，GTPase），可以通過調(diào)控下游Akt、PI3K因子改善血糖水平[28]。

圖7 二冬湯“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

由此可知，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道較為一致，說明該研究方法具有一定的準(zhǔn)確性和可取性。同時(shí)，這6個(gè)有效成分可通過作用于多靶點(diǎn)，干預(yù)多條通路發(fā)揮藥效作用，進(jìn)一步說明指紋圖譜所選的指標(biāo)成分具有合理性。這6個(gè)成分可以從飲片-煎液實(shí)現(xiàn)良好的傳遞和溯源，且無陰性干擾，基于Q-Marker的五原則，新芒果苷、芒果苷、金絲桃苷、漢黃芩苷、黃芩苷、甘草酸銨都基本符合，故可初步預(yù)測(cè)其為二冬湯潛在的Q-Marker。

3 討論

中藥復(fù)方成分復(fù)雜，為對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面控制，本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液5種不同的流動(dòng)相下色譜峰的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-水、甲醇-水時(shí)，峰較少，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液時(shí)，峰數(shù)量接近，但乙 腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)各峰分離效果好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相。同時(shí)，對(duì)203、230、254、270、290 nm等不同檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，通過比較發(fā)現(xiàn)203 nm和230 nm基線漂移嚴(yán)重，270 nm和290 nm與254 nm相比較，254 nm中指標(biāo)性成分甘草酸銨峰面積更高，故選擇254 nm。另外，考察了色譜柱溫度（25、30、35 ℃），體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）及不同類型色譜柱，最終確定上述色譜條件。

本研究采用HPLC法建立二冬湯的指紋圖譜，篩選出26個(gè)共有峰，并對(duì)7個(gè)峰進(jìn)行了指認(rèn)，經(jīng)與各單味藥陰性色譜圖對(duì)照，得到知母、荷葉、黃芩、荷葉4味飲片的特征峰，其中來源于黃芩的色譜峰較多，天冬、麥冬、天花粉主要成分為多糖和皂苷類，不具備紫外檢測(cè)的特點(diǎn)，通過課題組前期實(shí)驗(yàn)，這4味藥可通過薄層或分光光度法進(jìn)行鑒別。采用相似度評(píng)價(jià)軟件結(jié)合聚類分析，將15批藥材分為2類，說明不同產(chǎn)地的藥材因氣候、海拔等原因會(huì)造成一定的差異。指紋圖譜作為質(zhì)量控制的手段之一，還需結(jié)合多指標(biāo)成分的含量測(cè)定、出膏率、大類成分含量測(cè)定等方法對(duì)經(jīng)典名方質(zhì)量進(jìn)行全方位控制。

中藥質(zhì)量是影響中藥事業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素，Q-Marker基于中藥化學(xué)成分與中藥安全性、有效性，選擇中藥中一些可測(cè)性成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，提高中藥可控性和溯源性，促進(jìn)中藥質(zhì)量的控制研究。本實(shí)驗(yàn)基于Q-Marker可測(cè)、特有、有效、傳遞及配伍“五原則”，首先采用高效液相色譜法建立標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜，并指認(rèn)出相關(guān)峰，預(yù)測(cè)出二冬湯可能的質(zhì)量標(biāo)志物，體現(xiàn)中藥質(zhì)量的可測(cè)性。隨后采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法從有效性方面對(duì)6個(gè)可能的標(biāo)志物成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及相關(guān)通路的富集，其主要涉及蛋白酪磷酸酶N1、INSR、EGFR等21個(gè)靶點(diǎn)，富集的通路包括FoxO通路、PI-3K-AKT等56條信號(hào)通路，且涉及的靶點(diǎn)和通路大多與治療糖尿病相關(guān)癥狀相關(guān)[29-30]，這與古方記載“治療上消”一致，因?yàn)樘悄虿儆谏舷懂?。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍存在一些局限性，后續(xù)仍需要通過一些藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證以促進(jìn)二冬湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明新芒果苷、芒果苷、金絲桃苷、黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸銨這6個(gè)成分可能為二冬湯的潛在Q-Marker，為二冬湯質(zhì)量控制及后續(xù)研究提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Predictive analysis of quality markers of Erdong Decoction based on fingerprint and network pharmacology

SHUAI Li-xia1, 2, CHEN Wang1, 2, YUAN Yuan1, 2, RUAN Jia2, ZHAN Yan2, XU Chao-qun2

1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611100, China 2. Sichuan College of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610041, China

To analyze and predict the quality markers of Erdong Decoction (二冬湯) based on fingerprint and network pharmacology methods. Analyzing the potential quality markers (Q-Marker) in Erdong decoction by constructing the the network of “compound-target pathway” through network pharmacology.The fingerprints of 15 batches of Erdong Decoction were established by using HPLC method, and their peaks were identified and assigned. At the same time, the results were analyzed and evaluated by using the similarity evaluation software of chromatographic fingerprints of traditional Chinese medicine (2012 Edition) and hierarchical cluster analysis (HCA).The fingerprints of 26 common peaks were established and 7 common peaks of neomangiferin, mangiferin, hyperoside, baicalin, wogonside, ammonium and melaleuca-3--β--glucuronide were identified. The similarity between 15 batches of fingerprints and the control was greater than 0.97, and 15 batches of medicinal materials were grouped into two categories. Using the method of network pharmacology, it is concluded that neomangiferin, mangiferin, hyperoside, baicalin, wogonside and ammonium glycyrrhizinate may be the potential Q-Marker of Erdong decoction, which may play the effects of nourishing yin and clearing heat, promoting fluid production to quench thirst by regulating insulin, Rap1 (Ras-associated protein 1) signal pathway, hepatitis and other signal pathways.The established fingerprint analysis method has high sensitivity, strong stability and accurate and reliable data. Combined with network pharmacology, it is found that the six components have transmissibility and traceability, and are related to the efficacy of Erdong decoction. It can be used as its potential Q-Marker to provide reference for the further study of Erdong Decoction.

classical prescription; Erdong Decoction; fingerprint; network pharmacology; quality marker; neomangiferin; mangiferin; hyperoside; baicalin; wogonside; ammonium; melaleuca-3--β--glucuronide; transmissibility; traceability

R283.6

A

0253 - 2670(2022)18 - 5682 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.011

2022-03-28

四川省科技計(jì)劃（2020JDZH0021）

帥麗霞（1997—），女（漢族），四川眉山人，碩士研究生，從事中藥新制劑、新工藝、新技術(shù)研究。Tel: 15244825492 E-mail: 1342477457@qq.com

徐超群（1964—），女，博士，研究員，從事中藥新藥與新型給藥系統(tǒng)研究。Tel: (028)85213973 E-mail: chaoqun_xu@sina.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]