生防菌D25與嘧環(huán)·咯菌腈復(fù)配對(duì)番茄灰霉病防治的增效作用

黃 鑫，鄭麗寧，顧學(xué)虎，許煊煒，張 浩*，王迎春

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人參鹿茸監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，長(zhǎng)春 130118；3. 吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，白城 137000）

番茄灰霉病是由半知菌亞門灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的一種真菌性病害?；颐共【虏∧芰^強(qiáng)，一旦侵入番茄組織就會(huì)迅速讓植株產(chǎn)生病狀并能夠快速產(chǎn)生新的分生孢子進(jìn)行多次侵染[1]。低溫、高濕有利于該病害的發(fā)生[2]，在春冬季節(jié)易發(fā)生、甚至暴發(fā)，可導(dǎo)致果實(shí)減產(chǎn) 20%～30%，病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn) 50%～60%[3]。該病害在番茄產(chǎn)后貯存和運(yùn)輸過(guò)程中依然可以發(fā)生，一旦條件適宜，番茄灰霉病菌就會(huì)大量繁殖導(dǎo)致果實(shí)腐爛，進(jìn)而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

目前，噴施化學(xué)農(nóng)藥是防治番茄灰霉病的主要方法[5]，但長(zhǎng)期大量使用殺菌劑會(huì)產(chǎn)生一系列問(wèn)題，如危害人類健康、破壞生態(tài)環(huán)境、使灰霉病菌產(chǎn)生抗藥性等。紀(jì)明山等[6]報(bào)道從遼寧省田間采集的番茄灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗性頻率已經(jīng)達(dá)到84.84%，對(duì)嘧霉胺的抗性頻率已高達(dá)100%；馮寶珍等[7]報(bào)道山西運(yùn)城地區(qū)的番茄灰霉病對(duì)啶酰菌胺的抗性頻率已經(jīng)達(dá)到77.14%。篩選高效、低毒防治藥劑和防治方法成為目前生產(chǎn)中防治番茄灰霉病急需解決的問(wèn)題[8]。生防菌具有低毒、高效等特點(diǎn)，目前已經(jīng)被廣泛研究，但因其受環(huán)境影響較大，防治效果不穩(wěn)定，使得其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制[9]；部分殺菌劑對(duì)真菌的抑制作用強(qiáng)，對(duì)細(xì)菌幾乎無(wú)抑制作用，因而采用生防細(xì)菌與殺菌劑復(fù)配可能是一種有效防治番茄灰霉病的措施[10]。前人研究表明部分化學(xué)殺菌劑與生防菌聯(lián)合使用可在降低農(nóng)藥使用量的同時(shí)提高防效，如王兵[11]報(bào)道以25%氰烯菌酯與綠色木霉LZT-3聯(lián)合使用防治水稻惡苗病、以25%嘧菌酯與長(zhǎng)枝木霉CZT-2聯(lián)合使用防治紋枯病、以 50%醚菌酯與枯草芽胞桿菌 ZKC-1聯(lián)合使用防治胡麻斑病和稻瘟病有明顯的增效效果，其抑菌率分別可達(dá)94.96%、86.82%和95.00%；陳美云[12]將枯草芽胞桿菌LV與99%噁霉靈聯(lián)合使用對(duì)生姜莖基腐病的防病效果可達(dá)到77.32%，同時(shí)具有一定的促生作用；張萌等[13]使用熒光假單胞菌YG-1與啶酰菌胺聯(lián)合使用防治番茄灰霉病，可減少一半施藥量且防效可達(dá) 71.31%，較啶酰菌胺單劑提高了 22.45%；Ji等[14]將氟醚菌酰胺與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌TA-1聯(lián)合使用，使田間番茄灰霉病發(fā)病率降低20%左右。生防菌和化學(xué)殺菌劑復(fù)配在一定程度上解決了用藥量過(guò)多導(dǎo)致病原菌抗藥性急劇增長(zhǎng)和生防菌見(jiàn)效慢的問(wèn)題。

生防菌D25是從番茄根際土壤中分離得到的菌株，屬于泛菌屬，對(duì)番茄灰霉病有較強(qiáng)防治作用[15]。為了減少化學(xué)殺菌劑用量，同時(shí)提高生防菌的防治效果，本研究從12種殺菌劑中篩選出與生防菌D25具有較好生物相容性的殺菌劑，明確了復(fù)配的最適配比及其防病效果，為番茄灰霉病的科學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和泛菌Pantoea jilinensisD25，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥生測(cè)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖 20.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1000 mL。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸粉5.0 g、氯化鈉 10.0 g、瓊脂15.0～20.0 g、蒸餾水1000 mL。

供試番茄品種：京丹綠寶石2號(hào)，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

供試殺菌劑見(jiàn)表1。

表1 供試殺菌劑Table 1 The tested fungicides

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同殺菌劑對(duì)番茄灰霉病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定 采用含毒介質(zhì)法[16]，測(cè)定 12種殺菌劑對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率。向冷卻至50 ℃的PDA培養(yǎng)基中加入配制好的不同濃度梯度的藥液（表2），混合均勻后倒板，對(duì)照組平板使用無(wú)菌水制備。將直徑為5.0 mm的番茄灰霉病菌餅接種在制備好的含藥PDA平板中央，每個(gè)濃度重復(fù)3次，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5～7 d后測(cè)量真菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率[17,18]。抑制率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

表2 殺菌劑的濃度梯度Table 2 The concentration gradient of fungicide

1.2.2 泛菌D25與殺菌劑相容性測(cè)定 對(duì)番茄灰霉病菌毒力較高的殺菌劑，測(cè)定其與泛菌D25的相容性。采用混和平板法測(cè)定微生物殺菌劑與泛菌D25的相容性[19]。具體方法如下：向已冷卻至50℃左右的90 mL PDA培養(yǎng)基中加入10 mL OD600=1.48的泛菌D25菌懸液，混和均勻后倒板，然后分別吸取配置好的10 μL枯草芽胞桿菌和哈茨木霉菌菌液點(diǎn)在平板中央，28 ℃黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后觀察有無(wú)抑菌圈出現(xiàn)。采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定泛菌D25與化學(xué)殺菌劑的相容性。在LB平板中加入化學(xué)殺菌劑，使其終濃度為50、100、150、200、250 mg/L；將1 mL OD600=1.48的泛菌D25菌液進(jìn)行10倍系列稀釋6次，取100 μL稀釋后的菌懸液均勻涂布于LB平板上，以無(wú)菌水為對(duì)照，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，48 h后測(cè)定泛菌D25的菌落數(shù)，計(jì)算每毫升菌液D25的存活量，每組重復(fù)3次。采用DPS軟件統(tǒng)計(jì)分析生物相容性。

1.2.3 泛菌D25與殺菌劑復(fù)配比例篩選 根據(jù)12種殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果以及泛菌D25與殺菌劑間的相容性試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)番茄灰霉病菌毒力最高且對(duì)泛菌 D25菌體生長(zhǎng)影響最小的嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25進(jìn)行復(fù)配，為能夠清晰地看出復(fù)配劑對(duì)番茄灰霉病菌的影響，嘧環(huán)·咯菌腈的濃度以EC50=0.043 mg/L進(jìn)行配制，泛菌D25濃度同樣選擇對(duì)番茄灰霉病菌抑制率在50%左右的濃度（7.0×104CFU/mL）。按照嘧環(huán)·咯菌腈與D25的體積比V:V=10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10進(jìn)行復(fù)配比例的篩選。根據(jù)張萌等[13]方法計(jì)算毒性比率。

1.2.4 盆栽試驗(yàn) 將直徑為5.0 mm的番茄灰霉病菌菌餅接種在制備好的PDA培養(yǎng)基中央，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5～7 d后，向培養(yǎng)皿中加入10 mL 0.5%的吐溫80，靜置2 min，然后將其菌絲和孢子刮下，用4層紗布過(guò)濾，獲得孢子懸液，采用血細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法將濃度調(diào)至5×106孢子/mL，備用[20]。

番茄種子用0.5%次氯酸鈉溶液消毒1 min，然后用無(wú)菌水沖洗干凈，置于兩層濕濾紙間，于28 ℃培養(yǎng)4 d，發(fā)芽后播種至9 cm×10 cm花盆中，每盆裝有0.8 Kg滅菌土（V蛭石:V土壤=1:5）。所有花盆放置在25 ℃～30 ℃、光照14 h/d、相對(duì)濕度70%左右的溫室中，定期澆水，待番茄幼苗長(zhǎng)至6葉期進(jìn)行防病試驗(yàn)。分別設(shè)置一組治療處理和一組預(yù)防處理，探究殺菌劑與泛菌 D25復(fù)配后的效果。在治療處理中，先將20 mL濃度為5×106孢子/mL的番茄灰霉病孢子懸液均勻噴施在番茄幼苗葉片上直至徑流；48 h后，分別噴施10 mL嘧環(huán)·咯菌腈和泛菌D25菌液的復(fù)配劑（體積比5:5）、10 mL嘧環(huán)·咯菌腈和10 mL泛菌D25，各處理中嘧環(huán)·咯菌腈濃度為0.043 mg/L，D25菌液濃度為7×104CFU/mL。預(yù)防處理組則先將復(fù)配劑、嘧環(huán)·咯菌腈和泛菌D25單劑分別噴施在番茄幼苗葉片上，48 h后噴施濃度為 5×106孢子/mL的番茄灰霉病孢子懸液，各藥劑濃度及用量同治療組，對(duì)照組用清水進(jìn)行處理。每個(gè)處理選取9盆番茄，每盆中3株番茄苗，共設(shè)3次重復(fù)。接種5～7 d后調(diào)查植株發(fā)病情況，病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照GB/T 17980.28-2000。0級(jí)：無(wú)病斑；1級(jí)：?jiǎn)稳~片有病斑3個(gè)；3級(jí)：?jiǎn)稳~片有病斑4～6個(gè)；5級(jí)：?jiǎn)稳~片有病斑7～10個(gè)；7級(jí)：?jiǎn)稳~片有病斑11～20個(gè)，部分密集成片；9級(jí)：?jiǎn)稳~片有病斑密集占葉面積四分之一以上。采用DPS軟件統(tǒng)計(jì)分析防治效果。病情指數(shù)＝Σ（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù)）/（最大病級(jí)數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對(duì)照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 12種殺菌劑對(duì)番茄灰霉病的毒力分析

12種殺菌劑的室內(nèi)毒力見(jiàn)表3。其中枯草芽胞桿菌和哈茨木霉菌兩種微生物菌劑表現(xiàn)出較高的抑菌活性，EC50值分別為4.564×10-5與0.021 mg/L；嘧環(huán)·咯菌腈、啶?！た┚婧袜ぞ鷩f唑·咯菌腈3種化學(xué)殺菌劑有較高的抑菌活性，EC50值分別為0.043、0.081和0.093 mg/L，均小于0.1 mg/L。而香芹酚和苦參·蛇床素兩種植物源殺菌劑的抑菌活性較低，其EC50值分別為12.469和19.220 mg/L。所以選擇枯草芽胞桿菌、哈茨木霉菌、嘧環(huán)·咯菌腈、啶?！た┚婧袜ぞ鷩f唑·咯菌腈與泛菌D25進(jìn)行生物相容性的測(cè)定。

表3 十二種殺菌劑對(duì)番茄灰霉病毒力測(cè)定結(jié)果Table 3 Toxicity of twelve fungicides to B. cinerea

2.2 泛菌D25與殺菌劑的相容性分析

微生物殺菌劑與泛菌D25相容性測(cè)定結(jié)果表明，枯草芽胞桿菌和哈茨木霉菌對(duì)泛菌D25的生長(zhǎng)有抑制作用，生物相容性不佳?；瘜W(xué)殺菌劑與D25相容性測(cè)定結(jié)果表明，在濃度為50 mg/L的異菌脲·腐霉利和啶?！た┚娴钠桨迳?，D25的活菌量分別為1.14×109和1.22×109CFU/mL，顯著低于對(duì)照組活菌量（P＜0.05）；但在濃度為50 mg/L的嘧環(huán)·咯菌腈的平板上，泛菌D25的活菌量為1.67×109CFU/mL，與對(duì)照無(wú)顯著差異（表4），表明嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25具有較好的生物相容性。

表4 三種殺菌劑對(duì)泛菌D25菌體生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of three fungicides on the growth of P. jilinensis D25

2.3 不同比例的嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25復(fù)配對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用

嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25不同比例復(fù)配對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果見(jiàn)表5。結(jié)果表明當(dāng)嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25體積比為9:1、8:2、2:8和1:9時(shí)，毒性比率在0.8858～0.9567之間，均小于1，表現(xiàn)為拮抗作用，而7:3、6:4、5:5、4:6、3:7五個(gè)比例的毒性比率在1.2224～1.3943之間，均大于1，表現(xiàn)為增效作用，其中比例5:5的毒性比率最大可達(dá)1.3943，說(shuō)明在此比例下嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25的協(xié)同作用最強(qiáng)，防治效果最好。

表5 嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25復(fù)配對(duì)番茄灰霉病的抑制作用Table 5 Inhibition of the cyprodinil·fludioxonil and P. jilinensis D25 complex on B. cinerea growth

2.4 盆栽試驗(yàn)結(jié)果

將0.043 mg/L的嘧環(huán)·咯菌腈與7×104CFU/mL泛菌D25按體積比5:5復(fù)配，進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，測(cè)定其預(yù)防和治療效果。結(jié)果（表6）表明，預(yù)防處理組中，泛菌D25和嘧環(huán)·咯菌腈單劑對(duì)番茄灰霉病的防治效果分別為43.00%和53.03%，而復(fù)配劑可使病情指數(shù)降低至12.82，防治效果可達(dá)72.29%；治療處理組中，泛菌D25和嘧環(huán)·咯菌腈單劑的防治效果略低，分別為40.34%和46.17%，復(fù)配劑可使病情指數(shù)降低至17.78，防治效果可達(dá)61.57%。上述結(jié)果說(shuō)明，嘧環(huán)·咯菌腈和泛菌D25復(fù)配劑對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果最強(qiáng)，復(fù)配劑對(duì)番茄灰霉病的預(yù)防和治療效果無(wú)明顯差異。

表6 復(fù)配劑對(duì)番茄灰霉病的盆栽防治效果Table 6 Efficacy of cyprodinil·fludioxonil and D25 complex on the control of tomato gray mold in pot experiment

3 討論

化學(xué)藥劑和生物藥劑復(fù)配防治植物病害已經(jīng)在實(shí)際生產(chǎn)中得到應(yīng)用，如紀(jì)兆林等[21]連續(xù)3年使用咪鮮胺單劑防治桃枝枯病，發(fā)現(xiàn)藥后35 d防效從55.22%下降至15.74%，而與地衣芽胞桿菌W10復(fù)配使用的防治效果能夠穩(wěn)定在30%以上；陳長(zhǎng)卿等[22]利用甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌NJ13分別與嘧菌環(huán)胺和苯醚甲環(huán)唑復(fù)配對(duì)田間人參黑斑病菌的防治效果可達(dá)80.39%和89.33%；谷春艷等[23]利用芽胞桿菌WH1G與氟啶胺復(fù)配防治草莓灰霉病的田間防效可達(dá)69.79%。近年多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)遼寧、山西等地的灰霉病菌對(duì)生產(chǎn)中常用殺菌劑已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性[6,7]，因此減少化學(xué)殺菌劑用藥量、提高防效成為生產(chǎn)中亟需解決的問(wèn)題，但該方面研究非常匱乏。本研究在前期獲得新的生防菌D25[15]基礎(chǔ)上，研究了該菌與常用殺菌劑的復(fù)配毒力和溫室防效，明確了復(fù)配制劑比例，為番茄灰霉病的防治提供了新的藥劑。

明確殺菌劑的毒力以及殺菌劑與生防菌的相容性是篩選復(fù)配制劑的重要指標(biāo)。本研究測(cè)定的2種微生物殺菌劑對(duì)番茄灰霉病菌的EC50值最低，殺菌作用強(qiáng)，但是兩種微生物殺菌劑在PDA培養(yǎng)基中抑制泛菌 D25的生長(zhǎng)，可能與兩種微生物殺菌劑產(chǎn)生的抗菌代謝物同時(shí)具有殺真菌和殺細(xì)菌作用[24]有關(guān)，因而不適合與泛菌 D25混和使用。植物源殺菌劑具有環(huán)境友好、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，但試驗(yàn)中使用的香芹酚和苦參·蛇床素的EC50值較高，對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用不強(qiáng)，需要使用高劑量才有可能達(dá)到較為可觀的防治效果。由于植物源殺菌劑通常以天然植物提取物、稀有植物和高毒植物為材料[25]，產(chǎn)量有限[26]，因而也不適合與泛菌D25聯(lián)合使用。8種化學(xué)殺菌劑中，嘧環(huán)·咯菌腈的EC50值最低，并與泛菌D25有較好的生物相容性，室內(nèi)毒力和盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明嘧環(huán)·咯菌腈的用藥量在減少50%情況下，復(fù)配制劑的防效顯著高于兩種單劑，具有很大應(yīng)用潛力，但仍需在田間進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)。

化學(xué)殺菌劑是防治番茄灰霉病的主要藥劑，但藥劑的選擇作用容易導(dǎo)致番茄灰霉病菌產(chǎn)生抗藥性，并逐漸成為田間流行的優(yōu)勢(shì)群體，從而使常用的殺菌劑防效下降甚至完全失效[27,28]。為能夠?qū)崿F(xiàn)番茄灰霉病的綠色防治，需要不斷推出科學(xué)的防治方案。生防菌 D25與殺菌劑嘧環(huán)·咯菌腈復(fù)配制劑的獲得，對(duì)番茄灰霉病的有效防控具有重要意義，有望降低殺菌劑用量和成本，達(dá)到農(nóng)藥減施增效的目的。