武夷菌素防治大豆菌核病的作用機(jī)制

楊淼泠，謝家貝，魯妍璇,2，施李鳴，張克誠，葛蓓孛*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，保定 071000）

關(guān) 鍵 字：武夷菌素；大豆；核盤菌；抑菌機(jī)制；誘導(dǎo)抗性

1 農(nóng)用抗生素的概況

農(nóng)用抗生素是指由微生物產(chǎn)生的，可用于抑制或殺滅農(nóng)作物病、蟲、草害或調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)發(fā)育的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。因具有毒性低、易降解、選擇性強(qiáng)、對(duì)環(huán)境安全、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，成為被廣泛應(yīng)用的生物防治產(chǎn)品之一[2]。自20世紀(jì)50年代以來，我國相繼研制出多種具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的農(nóng)用抗生素，按作用功能可分為殺菌抗生素、殺蟲抗生素、除草抗生素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。

隨著用于植物病害防治的農(nóng)用抗生素產(chǎn)品不斷增加，其防病作用機(jī)制也成為了研究熱點(diǎn)。目前，已報(bào)道的農(nóng)用抗生素可直接利用拮抗機(jī)制殺死或抑制病原菌，通過作用于病原菌的細(xì)胞壁，使菌體細(xì)胞膨脹、變形，破壞病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)；或是通過增強(qiáng)病原菌細(xì)胞膜的通透性，使胞內(nèi)物質(zhì)外泄，導(dǎo)致菌體死亡；或是干擾病原菌蛋白質(zhì)和核酸合成以及能量代謝等生理生化過程，起到抑制和殺死病原菌的作用[3,4]。此外，農(nóng)用抗生素還可以通過與寄主植物互作，影響植株體內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)或相關(guān)防御反應(yīng)，提高植物的防御能力[1]。

2 武夷菌素對(duì)大豆菌核病的防治效果

武夷菌素是由小白鏈霉菌武夷變種Streptomyces albulusvar.wuyiensis代謝產(chǎn)生的一種高效、低毒的農(nóng)用抗生素[5]，可用于防治多種農(nóng)作物真菌性病害，對(duì)白粉病、灰霉病、白腐病、黑星病、菌核病、霜霉病、枯萎病等均具有很高的防效，同時(shí)還具有一定的增產(chǎn)作用[6,7]。1998年開始產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)并得到大面積推廣應(yīng)用[8]。前期平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，武夷菌素對(duì)核盤菌菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抑制效果，EC50為5.13 μg/mL[9]。離體葉片接種表明，200 mg/L武夷菌素防治大豆菌核病的效果為78.4%，顯著高于200 μg/mL中生菌素的防效69.4%[9]。大豆盆栽試驗(yàn)表明，經(jīng)50 μg/mL武夷菌素預(yù)防性噴施后對(duì)大豆菌核病的防效達(dá)62.56%。在田間人工模擬菌核病發(fā)病的情況下，2%武夷菌素（100倍液）分別于大豆封壟期、開花初期和開花盛期連續(xù)噴施3次，防治效果為64.0%[10]。以上結(jié)果均說明武夷菌素對(duì)大豆菌核病具有良好的防治效果，可作為防治大豆菌核病的生防制劑進(jìn)行應(yīng)用。因此，全面了解武夷菌素對(duì)核盤菌的防病機(jī)制，可以為在大豆生產(chǎn)上科學(xué)使用武夷菌素提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

3 武夷菌素抑制核盤菌的作用機(jī)制

3.1 影響核盤菌的生長(zhǎng)發(fā)育

細(xì)胞膜是細(xì)胞的一種重要的生物屏障。農(nóng)用抗生素可以通過作用于菌體細(xì)胞膜，破壞其屏障功能，造成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄，起到抑制和殺死病原菌的效果。通過碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染色法，測(cè)定武夷菌素對(duì)核盤菌細(xì)胞膜通透性及胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄露的影響[11]。研究表明，武夷菌素能增大核盤菌細(xì)胞膜通透性，其處理后，PI能穿過破損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，并與DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下能清晰地觀察到充滿紅色熒光的菌絲[9]。同時(shí)，武夷菌素處理組在260和280 nm下吸光度值顯著高于對(duì)照，證明武夷菌素能引起核盤菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸外泄，起到殺死病菌的作用[9]。

植物病原菌的正常菌體形態(tài)是維持其生長(zhǎng)發(fā)育及內(nèi)部生理代謝穩(wěn)定有序的重要因素。通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，武夷菌素處理的核盤菌，菌絲稀疏，菌絲量減少，且菌絲頂端分支減少[9]。菌核作為核盤菌長(zhǎng)期生存在土壤中的主要結(jié)構(gòu)，具有巨大的生殖潛力和長(zhǎng)期生存能力。當(dāng)條件適宜時(shí)，菌核通過萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤或菌絲，啟動(dòng)新的病害循環(huán)過程[12]，越冬前形成的菌核及越冬后萌發(fā)的菌核都是病害發(fā)生流行的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，武夷菌素能抑制核盤菌菌核的萌發(fā)，經(jīng)27.74 μg/mL武夷菌素處理后菌核萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤的萌發(fā)率降低了63.34%；同時(shí)，武夷菌素也能抑制菌核的形成，經(jīng)16 μg/mL武夷菌素處理后，菌核形成的數(shù)量降低了78.64%，重量減輕了86.07%[9]。

3.2 削弱核盤菌的生理毒性

細(xì)胞壁降解酶和草酸是影響核盤菌致病力的重要因素，也是影響其生理毒性的重要指標(biāo)[13]。核盤菌通過分泌一系列的細(xì)胞壁降解酶打破寄主植物的物理屏障，破壞植物組織，干擾內(nèi)部正常的生理代謝過程，同時(shí)從寄主植株體內(nèi)攫取所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14,15]。多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）和果膠甲基半乳糖醛酸酶（Pectinmethyl-galacturonase，PMG）是兩種重要的細(xì)胞壁降解酶[16]。此外，核盤菌通過分泌草酸，降低病變部位的 pH，營(yíng)造有利于核盤菌定殖與侵入的酸性環(huán)境[13,17,18]。利用二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）測(cè)定武夷菌素對(duì)核盤菌產(chǎn)生的PG和PMG的活性發(fā)現(xiàn)，武夷菌素可以顯著降低PG和PMG的活性。利用分光光度法測(cè)定武夷菌素對(duì)核盤菌合成草酸的影響，發(fā)現(xiàn)武夷菌素處理后草酸合成量顯著降低[9]。這說明武夷菌素能夠通過降低細(xì)胞壁降解酶的活性和減少草酸的合成，削弱核盤菌的生理毒性，阻礙定殖及侵入過程，抑制菌核病的發(fā)生流行。

3.3 影響核盤菌致病力及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)

近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展和核盤菌全基因組測(cè)序的完成，為從基因水平闡明武夷菌素抑制核盤菌的作用靶標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。目前，研究報(bào)道了多種影響核盤菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病力的功能基因。其中，分泌蛋白Ss-Caf1與核盤菌侵染墊的形成有關(guān)，其突變體不能在健康葉片上致病[19]；類似整聯(lián)蛋白（Ss-Integrin-like，SSITL）參與了核盤菌抑制寄主體內(nèi)JA/ET信號(hào)途徑介導(dǎo)的局部和系統(tǒng)性抗病反應(yīng)[20]；NADPH氧化酶基因（SsNox1）不僅與ROS產(chǎn)生相關(guān)，同時(shí)也能影響核盤菌草酸的合成和菌核的正常發(fā)育[21]；pph1也調(diào)控核盤菌菌絲生長(zhǎng)和菌核形成的生長(zhǎng)發(fā)育過程[22]。通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）分析武夷菌素對(duì)核盤菌生長(zhǎng)發(fā)育及致病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)間內(nèi)武夷菌素顯著下調(diào)了Ss-Caf1、SSITL、SsNox1和pph1表達(dá)量。其中，菌絲生長(zhǎng)階段，武夷菌素顯著下調(diào)SSITL基因的表達(dá)；菌核發(fā)育期，武夷菌素下調(diào)Nox1、pph1、Caf1基因的表達(dá)；菌核成熟期，pph1基因受武夷菌素抑制下調(diào)表達(dá)；侵染寄主階段，武夷菌素顯著抑制Ss-Caf1和SSITL基因的表達(dá)[9]。這表明武夷菌素既能通過作用于SSITL、Ss-Caf1、Ssnox1減緩菌絲生長(zhǎng)速度，抑制菌核的形成，進(jìn)而影響核盤菌的生長(zhǎng)發(fā)育，也能通過作用于Ss-Caf1和SSITL阻礙侵染墊的形成，抑制核盤菌負(fù)調(diào)控植物防御反應(yīng)，降低核盤菌致病力，從而達(dá)到良好的保護(hù)效果。

4 武夷菌素誘導(dǎo)大豆抗菌核病的作用機(jī)制

4.1 誘導(dǎo)大豆體內(nèi)胼胝質(zhì)的沉積

植物誘導(dǎo)抗性的組織病理學(xué)反應(yīng)是指植物通過生成促進(jìn)胞壁合成的物質(zhì)（如膠質(zhì)體和胼胝質(zhì)等）或修復(fù)、加厚細(xì)胞壁并使其木質(zhì)化，從而增強(qiáng)植物抵抗病原菌侵染的第一道屏障[23]。其中，胼胝質(zhì)沉積發(fā)生在病原體攻擊部位的質(zhì)膜和細(xì)胞壁之間，這種物理防御機(jī)制封閉胞間連絲間隙，阻止病原菌進(jìn)入細(xì)胞，增強(qiáng)植物對(duì)入侵病原體的防御反應(yīng)[24]。利用苯胺藍(lán)染色法測(cè)定武夷菌素對(duì)大豆體內(nèi)胼胝質(zhì)沉積的影響，發(fā)現(xiàn)在被核盤菌侵染的大豆葉片中，武夷菌素能誘導(dǎo)大豆葉片中的胼胝質(zhì)沉積。這證實(shí)了武夷菌素可以通過誘導(dǎo)植株體內(nèi)胼胝質(zhì)的沉積，從而增強(qiáng)大豆植株抵抗核盤菌侵染的能力。

4.2 提高防御相關(guān)酶的活性

農(nóng)用抗生素能通過提高植物體內(nèi)的防御相關(guān)酶活，增強(qiáng)植物的防御能力。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）是植物體內(nèi)主要的活性氧清除酶，它們通過催化代謝反應(yīng)，清除植物體內(nèi)因生物或其他非生物脅迫因子造成過量積累的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），維持ROS的生成和清除之間處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，避免 ROS造成的植物氧化損傷甚至死亡[25-27]。已有研究發(fā)現(xiàn)，利用分光光度法測(cè)定武夷菌素對(duì)核盤菌侵染的大豆葉片中 SOD、POD、CAT活性的影響，結(jié)果表明武夷菌素處理大豆葉片中活性氧清除酶的活性顯著高于對(duì)照。這說明武夷菌素可通過減少植物對(duì)核盤菌侵染而引起的活性氧過度積累，維持活性氧平衡，提高植物對(duì)核盤菌的抵御能力。多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）也是植物防御反應(yīng)的關(guān)鍵生理指標(biāo)之一。PPO能夠催化植物體內(nèi)的酚類底物，在有氧的條件下氧化生成醌類物質(zhì)，而醌類物質(zhì)對(duì)大部分病原菌具有較高的毒性從而起到抑菌或殺菌的作用[28,29]。PAL作為苯丙烷代謝過程中的限速酶[30,31]，其參與合成的酚類物質(zhì)，是木質(zhì)素、植保素和類黃酮等生物合成的基本分子。已開展的研究表明，利用分光光度法測(cè)定武夷菌素對(duì)核盤菌侵染的大豆葉片中PPO和PAL的活性發(fā)現(xiàn)，武夷菌素處理后，大豆體內(nèi)PPO和PAL活性在不同時(shí)間段內(nèi)都有顯著的增強(qiáng)，這表明武夷菌素也能增強(qiáng)PPO和PAL活性，進(jìn)而提高植物對(duì)核盤菌的抵御能力。幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶在植物抵御病原菌侵染過程中發(fā)揮重要作用[32,33]。β-1,3-葡聚糖酶不僅能水解真菌細(xì)胞壁中β-1,3葡萄糖鍵，通過裂解細(xì)胞壁使其細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)大量溢出，直接殺傷病原菌；還能誘導(dǎo)植物的其他防御酶發(fā)揮抗病作用[34]。幾丁質(zhì)酶可以將真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)水解成N-乙酰低聚糖和葡萄糖，導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)終止，甚至出現(xiàn)粗糙和畸形[28]。已開展的研究表明，利用分光光度法測(cè)定武夷菌素對(duì)核盤菌侵染的大豆葉片中幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)武夷菌素處理后大豆葉片幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性高于清水處理組，表明武夷菌素能增強(qiáng)大豆體內(nèi)幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性，破壞核盤菌細(xì)胞壁，直接阻礙核盤菌正常生長(zhǎng)發(fā)育和侵染大豆植株的過程。

4.3 激活防御信號(hào)傳導(dǎo)途徑

水楊酸（Salicylic Acid，SA）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）、乙烯（Ethylene，ET）是3種重要的植物信號(hào)物質(zhì)，也是植物防御反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，在調(diào)控植物免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[35]。SA主要參與調(diào)控植物對(duì)活體型或半活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的防御反應(yīng)，SA積累和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是系統(tǒng)獲得抗性（System acquired resistance，SAR）反應(yīng)產(chǎn)生的必要條件。JA和ET主要參與植物應(yīng)對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的防御反應(yīng)，JA和ET則參與調(diào)控植物誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（Induced systemic resistance，ISR）的獲得[36]。SA和JA/ET通路之間存在復(fù)雜的協(xié)同作用和交叉作用[37]。已有研究表明，農(nóng)用抗生素能通過影響植物體內(nèi)的防御反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)過程，誘導(dǎo)或增強(qiáng)植物提高抗病性。如在探究申嗪霉素誘導(dǎo)煙草對(duì)灰葡萄孢Botrytis cinerea抗病作用的研究中，發(fā)現(xiàn)申嗪霉素能上調(diào)SA和JA/ET途徑中關(guān)鍵協(xié)調(diào)因子NPR1的表達(dá)，激活煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性[38]。

通過選取SA和JA/ET信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因（NPR1，PR1，PR4，MYC2，COI1，ERF1），利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同基因在武夷菌素處理后的表達(dá)動(dòng)態(tài)，研究武夷菌素是如何影響并調(diào)控大豆體內(nèi)激素信號(hào)防御途徑。COI1作為 JA信號(hào)通路的標(biāo)記基因，與 JA-Ile相互作用，導(dǎo)致 JAZ（Jasmonate ZIM-domain）抑制因子通過26S蛋白酶體降解，從而減輕其對(duì)JA信號(hào)通路下游多種轉(zhuǎn)錄激活因子的抑制作用，激活JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑[39]。在核盤菌侵染的大豆葉片中，武夷菌素在6～12 h時(shí)上調(diào)了COI1的表達(dá)。此外，還發(fā)現(xiàn)ERF1基因受武夷菌素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)了3倍以上。有研究發(fā)現(xiàn)，ERF1是ET和JA信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子[40,41]。這表明武夷菌素在核盤菌侵染早期通過激活JA/ET信號(hào)傳導(dǎo)途徑，增強(qiáng)大豆防御核盤菌侵染的能力。據(jù)報(bào)道，JA/ET信號(hào)通路可以調(diào)控?cái)M南芥中PR3、PR4和PR12等PRs基因的表達(dá)，在研究中發(fā)現(xiàn)武夷菌素也誘導(dǎo)增強(qiáng)了大豆體內(nèi)PR4表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了武夷菌素通過影響大豆體內(nèi)JA/ET信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與抗核盤菌侵染的過程。此外，PR1是典型的SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的標(biāo)記基因[42]。NPR1是SA和JA信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[43]。在12～24 h內(nèi)武夷菌素顯著上調(diào)了SA信號(hào)通路的正向調(diào)控因子NPR1基因的表達(dá)，在12～36 h內(nèi)武夷菌素也上調(diào)PR1表達(dá)，這表明SA信號(hào)通路也參與了武夷菌素誘導(dǎo)的防御反應(yīng)。

5 展望

武夷菌素是我國具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型生物農(nóng)藥，對(duì)人畜低毒、與環(huán)境相容性好，是一種綠色安全的殺菌劑。研究武夷菌素防治大豆菌核病的作用機(jī)制，目的是提高武夷菌素對(duì)大豆菌核病的防治效果，為不斷優(yōu)化其田間應(yīng)用技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

目前，武夷菌素防治大豆菌核病的作用機(jī)制主要是從形態(tài)學(xué)和生理學(xué)角度分析，雖通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR初步探究了武夷菌素與核盤菌及大豆互作的作用靶標(biāo)，但僅局限于核盤菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病性及大豆體內(nèi)防御信號(hào)傳導(dǎo)途徑這兩方面，對(duì)核盤菌和大豆的其他生理生化代謝及信號(hào)傳導(dǎo)等方面的機(jī)制還不清楚。后期可利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)手段，分析武夷菌素處理后核盤菌和大豆體內(nèi)差異表達(dá)的基因或蛋白質(zhì)，并使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析來揭示對(duì)各類代謝途徑的影響，深入探究武夷菌素-核盤菌-大豆三者互作的作用機(jī)制。