向日葵菌核病拮抗木霉菌篩選及防病效果

陳玉蓉，曹秋林，廉 華，馬光恕，蔣細(xì)良，李 梅*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝園林學(xué)院，大慶 163319）

向日葵是重要的油料作物，在我國的栽培面積僅次于大豆、油菜和花生。隨著對向日葵籽粒及其副產(chǎn)品的需求不斷增加，其種植面積也逐年加大。向日葵菌核病是由核盤菌Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary侵染引起的一種土傳病害[1]，在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生。該病菌寄主范圍廣泛，除向日葵外，還危害大豆、油菜、花生、菜豆、甘藍(lán)、蔥、胡蘿卜、苜蓿等[2]，主要以抗逆性強(qiáng)的菌核在土壤中越冬，春天萌發(fā)形成菌絲侵染寄主根莖部，或在條件適宜時，菌核萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤釋放子囊孢子，侵染植株地上部的葉片、莖稈和花盤[3]。在中國東北和內(nèi)蒙古等產(chǎn)區(qū)，因菌核病造成向日葵的平均發(fā)病率達(dá)到 40%～60%，最高可達(dá)到90%以上，嚴(yán)重危害向日葵種植業(yè)的發(fā)展[4]。隨著化學(xué)農(nóng)藥防治菌核病導(dǎo)致的環(huán)境污染、抗藥性和藥害等問題日益突出，篩選和利用生防微生物防治向日葵菌核病，對于保障向日葵安全生產(chǎn)、保護(hù)環(huán)境有重要的意義，并受到廣泛關(guān)注。迄今已報道了鏈霉菌[5]、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilisS-16[6,7]、蠟狀芽胞桿菌B. cereusCF4-51[8]、辣椒溶桿菌Lysobacter capsicaXRK5[9]等多株對向日葵菌核病具有高效拮抗作用的生防菌株。朱林等[5]篩選了2株鏈霉菌和3株芽胞桿菌對葵花菌核病的防治效果范圍為57.1%～79.1%，復(fù)合菌劑的防治效果可達(dá)到81%以上。李小娟[8]報道了一株蠟狀芽胞桿菌B. cereusCF4-51，對向日葵菌核病的室內(nèi)離體葉片測定防效為85.3%，盆栽和大田防效分別達(dá)到了78.4%和64.6%。王春等[10]篩選出木霉M1M2菌株對向日葵菌核病菌的生長抑制率為82.6%，盆栽防效為73.8%，田間防效為60%。木霉Trichodermaspp.對植物病原真菌具有廣譜的拮抗能力，能通過競爭、抗生、重寄生、誘導(dǎo)植物抗病性等機(jī)制防治真菌病害，特別是對土傳病害具有良好的防治效果，已有多株木霉菌被開發(fā)用于土傳病害防治[11,12]。本研究通過對來自內(nèi)蒙古、新疆地區(qū)的木霉菌株進(jìn)行篩選，并開展防治向日葵菌核病試驗(yàn)，獲得了3株具有較高防治效果的木霉菌，報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 向日葵菌核病菌S. sclerotiorum（Lib.）de Bary從向日葵菌核病病株腐爛花盤上分離、純化和鑒定。木霉菌株從內(nèi)蒙古和新疆地區(qū)的森林和草原土壤中分離并鑒定，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所木霉組保存，菌株信息見表1。

表1 本研究的12株木霉菌菌株Table 1 Trichoderma strains used in this study

1.1.2 供試向日葵 豐葵雜1號，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊試驗(yàn)基地提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后備用。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD）為不含瓊脂的液體PDA培養(yǎng)基。高粱粒用蒸餾水浸泡4 h后，倒掉水分，采用121℃高壓蒸汽滅菌30 min，制備高粱粒培養(yǎng)基[13]，采用相同方法制備大米培養(yǎng)基。

1.2 木霉培養(yǎng)及菌劑制備

將木霉接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃下活化培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅5塊，接種在含有100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD）的 250 mL 的三角瓶中，在28 ℃黑暗條件下振蕩培養(yǎng)7 d（250 r/min），發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過濾后再用0.4 μm濾膜過濾獲得上清液，用于離體葉片檢測。將木霉菌餅接種到滅菌的大米培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)5～7 d，每天翻動使病菌均勻生長，待大米粒表面長滿孢子后，過300目篩，獲得孢子粉劑，保存于4 ℃?zhèn)溆?。用血球記?shù)板統(tǒng)計孢子含量，用無菌水稀釋到1.0×107CFU/mL孢子懸液用于盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)。

1.3 病菌活化培養(yǎng)和制備

參考王春等[11]的方法，將向日葵病原菌在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)5 d，取直徑5 mm的菌餅接種到高粱粒培養(yǎng)基中，25 ℃下培養(yǎng)，每天翻動使病菌均勻生長，待菌絲長滿高粱粒表面，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 平板對峙試驗(yàn)

木霉接種于PDA平板，28 ℃培養(yǎng)3 d；向日葵菌核病菌接種于PDA平板，28 ℃培養(yǎng)5 d。用打孔器分別從木霉和菌核病菌的菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，在PDA平板的一側(cè)接入木霉菌餅，相對另一側(cè)接入病原菌菌餅，菌餅距平板邊緣1 cm，平板置于28 ℃培養(yǎng)。以僅接種病原菌為對照，5次重復(fù)。培養(yǎng)5 d后測量菌核病菌的菌落半徑，參照劉增亮等[14]的方法，計算木霉對病原菌的生長抑制率。抑制率（%）＝（對照組菌落半徑－處理組菌落半徑）/對照組菌落半徑×100。

1.5 離體葉片篩選

選取對病原菌生長抑制作用最強(qiáng)的木霉菌3株，采用離體葉片法對其進(jìn)行防效測定[15]。挑選葉齡一致的向日葵真葉，用無菌水沖洗兩次，晾干后備用。將葉片在PD木霉菌發(fā)酵濾液中浸泡30 s，取出后在超凈臺中自然晾干，放置在水瓊脂培養(yǎng)基上，在葉片中央接種直徑5 mm的病原菌菌餅，以PD培養(yǎng)基浸泡葉片30 s再接病原菌菌餅為對照，每個處理10個葉片，重復(fù)3次，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天拍照記錄發(fā)病情況。利用ImageJ圖像處理軟件掃描并計算病斑面積和防治效果。防治效果（%）=（對照平均病斑面積－處理平均病斑面積）/對照平均病斑面積×100。

1.6 盆栽試驗(yàn)

將營養(yǎng)土和蛭石按照4:1均勻混合，裝入塑料育苗盆（11 cm×11.5 cm×11.5 cm）中，每盆裝土量300 g。向日葵種子催芽后，每盆播種2粒，出苗后每盆保留一棵，置于陽光充足的地方。試驗(yàn)設(shè)5個處理：（1）播種前5 d用木霉孢子懸液100 mL/盆拌土+接種菌核病菌前2 d用等量的木霉孢子懸液灌根，設(shè)為拌土+灌根處理；（2）播種前5 d用木霉菌懸浮液200 mL（孢子量2×109）/盆拌土，設(shè)為拌土處理；（3）待植株長出4片真葉即播種后20 d接種菌核病菌，接種病菌前2 d用200 mL/盆木霉菌懸浮液灌根，200 mL（孢子量2×109）/盆，設(shè)為灌根處理；（4）單獨(dú)利用向日葵菌核病菌灌根且不施用木霉懸浮液，設(shè)為病菌對照B。播種前5 d和接病原菌前2 d處理的液體總量均通過補(bǔ)加無菌水補(bǔ)足到200 mL。每個處理設(shè)60盆，重復(fù)3次。病菌接種采用無菌牙簽，挑取直徑2 mm的病原菌菌餅，扎到向日葵植株莖基部，接種后48 h內(nèi)保持環(huán)境濕度100%。病菌接種后第6 d開始記錄發(fā)病情況，計算植株發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

向日葵菌核病分級標(biāo)準(zhǔn)參照陳嫻等[16]方法，分為5級：0級表示無??；1級表示病斑面積占全葉10%以下；2級表示病斑面積占全葉11%～30%；3級表示病斑面積占全葉31%～50%；4級表示病斑面積占全葉51%以上。植株發(fā)病率為接種后15 d各處理發(fā)病株數(shù)占調(diào)查總株數(shù)的百分比。病情指數(shù)參照宗兆鋒等[17]的計算方法。防治效果（%）=（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.7 小區(qū)試驗(yàn)

每個小區(qū)面積66.7 m2，種植10壟向日葵，株距0.60～0.61 m，行距0.61～0.62 m，共計175～180株，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。木霉處理分別設(shè)為BN862、BN246和BX102。木霉施入采用播種時拌土，按照108CFU/株的孢子用量與50 g土混合作為底肥施入，在向日葵4片真葉時按108CFU/株的孢子用量灌根處理一次，同時接種病菌，將高粱粒培養(yǎng)擴(kuò)繁的長滿菌絲的菌核病菌種200 g，與2倍土壤混合，每11.5 m長壟溝內(nèi)撒入600 g混合菌種。2周后再次木霉孢子懸液灌根處理一次。9月中旬調(diào)查發(fā)病率、病情指數(shù)和防效。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板對峙試驗(yàn)篩選拮抗菌

將供試木霉與向日葵菌核病菌對峙培養(yǎng)，接種5 d后檢測菌落生長抑制率，在檢測的12株木霉中，3株木霉菌X102、N862和N246對病菌生長的抑制率達(dá)到85%以上，分別為91.22%、90.27%和87.87%（圖1，2）。選取上述3株木霉進(jìn)行下一步的離體葉片檢測。

圖1 木霉對向日葵菌核病菌生長的抑制作用Fig. 1 Inhibition effects of 12 Trichoderma strains on the growth of Sclerotinia sclerotiorum

圖2 木霉與向日葵菌核病菌平板對峙試驗(yàn)Fig. 2 Trichoderma strains confrontation against S. sclerotiorum

2.2 離體葉片試驗(yàn)篩選高效菌株

向日葵離體葉片用木霉發(fā)酵液處理后，接種菌核病菌，3 d后觀察葉片發(fā)病情況（圖3），測定病斑面積，計算木霉處理對菌核病的抑制效果。N246、N862和X102對病斑擴(kuò)展的抑制率分別為90.62%、96.46%和63.84%，顯示3株木霉的代謝產(chǎn)物對葵花菌核病菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。說明木霉可通過產(chǎn)生抑菌的代謝產(chǎn)物抑制葵花菌核病，并且N246和N862代謝產(chǎn)物的抑制作用高于X102。

圖3 木霉防治葵花菌核病的離體葉片試驗(yàn)Fig. 3 Efficacy of three Trichoderma strains on S. sclerotiorum on detached sunflower leaves

2.3 木霉防治向日葵菌核病盆栽試驗(yàn)

3株供試木霉均對向日葵菌核病表現(xiàn)出一定的防治效果，N862單獨(dú)灌根處理防病效果顯著高于單獨(dú)拌土處理，N246與N862相反，而X102的單獨(dú)拌土和灌根處理的防效相當(dāng)，并顯著低于拌土+灌根處理。N862、N246和 X102的拌土+灌根處理的防病效果均高于單獨(dú)的拌土和灌根處理，防效分別為 86.97%、76.72%和73.30%，并且N862的防效高于N246和X102（表2）。

表2 木霉對向日葵菌核病的盆栽試驗(yàn)防效Table 2 Effects of three Trichoderma strains on sunflower sclerotinia rot in pot trials

2.4 田間小區(qū)試驗(yàn)防治效果

N862、N246和X102對病害的田間防效分別為67.54%、49.96%和49.23%，N864的防效顯著高于N246和X102，并且N246和X102的防效差異不顯著（表3）。

表3 木霉防治向日葵菌核病的田間小區(qū)實(shí)驗(yàn)防治效果Table 3 Effects of three Trichoderma strains on sunflower sclerotinia rot in field experiments

3 討論

應(yīng)用木霉防治植物土傳病害已經(jīng)成為目前生物防治研究的熱點(diǎn)[18,19]。木霉的防病機(jī)制包括競爭、抗生、重寄生、誘導(dǎo)植物抗病性等，不同菌株存在多種不同的機(jī)制并可能共同發(fā)揮作用，達(dá)到防病的目的[20-22]。本研究篩選的3株木霉菌N862、N246、X102，對向日葵菌核病菌均具有較強(qiáng)的競爭能力，生長抑制率均超過85%，對向日葵菌核病的盆栽防效均超過70%，其中N862的防效超過85%，田間防效達(dá)到67%以上，高于文獻(xiàn)報道的鏈霉菌、芽胞桿菌、木霉M1M2菌株等的防治效果[5-10]，有重要的開發(fā)應(yīng)用價值。本研究中的3株木霉菌通過拌土結(jié)合灌根處理防治向日葵菌核病均能夠獲得較好的防病效果，但單獨(dú)的拌土和灌根處理的防病效果差異較大，說明木霉N862、N246、X102的防病機(jī)制存在差異，并且N862和N246對病菌的抗生作用強(qiáng)于X102，需進(jìn)一步研究。

生防菌防治向日葵菌核病的機(jī)制研究中，報道了多種生防菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)。如枯草芽胞桿菌S-16能產(chǎn)生對向日葵菌核病有拮抗作用的抑菌物質(zhì), 為一種熱穩(wěn)定的脂肽類物質(zhì)，對菌核病的抑菌圈直徑最大可達(dá) 1.72 cm[7]，蠟狀芽胞桿菌 CF4-51產(chǎn)生 2種抑菌物質(zhì) 1-Methyldodecylamine（十二烷基甲胺）和2-cyano-acetamide（氰基乙酰胺）可以抑制核盤菌菌核的形成[8]。但木霉菌防治向日葵菌核病的機(jī)制報道較少。孫冬梅等[23]報道了一株黃綠木霉代謝產(chǎn)物能夠使向日葵菌核病菌的致病力降低97.9%。本研究通過離體葉片試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3株木霉都能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，其中N862和N246代謝產(chǎn)物的抑菌效果好于X102，它們所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有待進(jìn)一步研究。

此外，多株拮抗菌的復(fù)合菌劑對向日葵菌核病的防治效果往往高于單一菌劑，如鏈霉菌和芽胞桿菌復(fù)合菌劑的防治效果可達(dá)到81%以上，高于單一菌劑的防效[5]。鄭曉薇[24]將7株向日葵菌核病拮抗菌，包括微白黃鏈霉菌S. albidoflavus、肉桂色鏈霉菌S. cinnamonensis和貝萊斯芽胞桿菌B. velezensis等，按不同比例制備混合菌劑，對向日葵菌核病的盆栽防效最高達(dá)到83.08%。本研究僅開展了單一木霉處理的防病效果，下一步將開展利用不同木霉菌株和/或其他高效菌株的混合菌劑防治向日葵菌核病的研究，為提高防病效果，推動產(chǎn)品應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。