超高效液相色譜法測定枸杞中枸杞酸的含量

枸杞是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，其果實為枸杞子，屬于茄科枸杞屬。枸杞子作為藥食同源的可食用品種，具有很高的綜合價值

?！吨袊幍洹分杏涊d，枸杞子功能主治為滋補肝腎、益精明目

。近年來，隨著國內(nèi)外大量科學的研究，枸杞子的多種功效也被進一步挖掘，例如，服用枸杞子多糖的糖尿病患者，紅細胞異形率與溶血脆性均基本恢復正常，同時還能有效保護四氧嘧啶損傷的胰島細胞，并且能抑制由四氧嘧啶造成的MDA生成量上升

；枸杞子能增強機體呼吸系統(tǒng)的免疫功能，從而提高呼吸系統(tǒng)的免疫能力

；枸杞提取物通過誘導SKN-1介導的抗氧化系統(tǒng)來抑制過量活性氧的產(chǎn)生，從而抑制Aβ的產(chǎn)生并抑制線粒體損傷，提示其具有神經(jīng)保護作用，可用于阿爾茨海默病的預防和治療

。動物實驗顯示，枸杞子提取液還能增強小鼠皮膚內(nèi)SOD活性，增加皮膚中膠原蛋白量，并減少脂質(zhì)過氧化物丙二醛的含量

。枸杞子提取物還可以通過激活PKA-CREB信號通路，增加IIa型氧化肌纖維和有氧呼吸的比例來提高小鼠的平均跑步距離，增強小鼠肌肉耐力

。在臨床上，枸杞子的用法非常多，可單味煮服，也可以制作成藥酒應用，或者與其他藥物配伍同服。枸杞子還可以做成丸子、藥膏、藥散服用，而且枸杞子具有豐富的營養(yǎng)成分，保健價值受到人們的高度關注，其作為膳食補充劑可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物組的組成變化預防炎癥性腸病

。

根據(jù)《社會救助暫行辦法》，有些應該納入扶貧兜底的對象不符合現(xiàn)行農(nóng)村低保評定標準，應與中央《打贏脫貧攻堅戰(zhàn)的決定》保障兜底要求有效銜接，扶貧與低?！皟删€合一”有待明確，另外在脫貧時間上省市縣區(qū)不一致，有些市區(qū)縣甚至提出提前兩三年建成小康社會，這意味著脫貧攻堅任務也要提前，兜底工作如果嚴格按照中央脫貧時間節(jié)點實現(xiàn)“兩線合一”，極易引發(fā)新的社會矛盾。

以寧夏枸杞來說，平均每100 g枸杞中含有粗蛋白4.5 g、粗脂肪2.3 g、碳水化合物9.1 g、類胡蘿卜素0.096 g等，同時還含有多種氨基酸，微生物，鈣、鉀等微量元素

。枸杞酸也是唯一一種從天然資源提取的穩(wěn)定維生素C前體

。2004年，日本學者Toyoda-Ono等從寧夏枸杞和北方枸杞的干果中分離純化得到枸杞酸，即2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸。枸杞酸是枸杞特有的天然成分，是從天然資源中發(fā)現(xiàn)的一種新型、穩(wěn)定、純天然L-抗壞血酸(維生素C)前體物質(zhì)。研究表明，枸杞中的枸杞酸含量可以和新鮮檸檬中的維生素C含量相媲美，且抗氧化能力相比抗壞血酸更持久，能夠長時間存在于體內(nèi)發(fā)揮抗氧化活性，具有更高效的清除自由基能力，有效抑制黑色素的生成

。枸杞酸在抗衰老、抗腫瘤和改善結腸炎等方面也發(fā)揮了藥理作用

，其顯著增強了秀麗隱桿線蟲中SOD和CAT等抗氧化酶的活性，同時顯著降低了脂褐質(zhì)水平并減輕了蛋白質(zhì)毒性

。目前，枸杞中枸杞酸測定方法研究較少，對枸杞酸在枸杞子中含量分布也研究不多。因此，本研究通過分析枸杞子中枸杞酸的檢測方法，并檢測不同批次中枸杞酸的含量，為枸杞子的質(zhì)量評價提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞，均為市售品；枸杞酸對照品(含量按99.7%計)，上海詩丹德標準技術服務有限公司；乙腈(色譜純)，上海安譜實驗科技有限公司；乙酸銨(分析純)，國藥試劑；水為本實驗室自制超純水。

1.2 儀器與設備

Agilent1290高效液相色譜(帶Chemstation色譜工作站)，美國安捷倫科技有限公司；島津十萬分之一電子天平，日本島津公司；ELGA純水機，英國埃爾格公司；超聲機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Fresco-21常溫離心機，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.3 供試藥材溶液的制備 取粉碎后的枸杞樣品粉末約1 g，精密稱定，加水25 mL，稱定重量，超聲處理25 min，冷卻至室溫，加水補足減失的重量，搖勻，濾過，精密移取續(xù)濾液1 mL，至10 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

（1）DPPH·自由基清除能力測定參考等SLin的方法[28]。谷光甘肽作為標準品，繪制標準曲線回歸方程 為 ：y=0.301x+0.203（0.301～1.81 mg/mL，R 2=0.996）；y為DPPH自由基清除率，x為谷光甘肽濃度。

取枸杞酸標準溶液，每隔0、1、2、4、8、12、24 h進樣1次，每次1 μL，測得枸杞酸峰面積RSD為0.55%，表明枸杞酸對照品溶液在放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

取枸杞酸標準溶液，連續(xù)進樣6次，每次1 μL，測得枸杞酸峰面積RSD為0.18%，表明儀器的精密度好。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取枸杞酸對照品14.01 mg置于25 mL容量瓶中，加流動相液稀釋至刻度，搖勻，得枸杞酸標準貯備液濃度為0.560 4 mg/mL。

1.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column 130A(2.1×150，1.7μm)。流動相：乙腈(A)，0.05 mol/L乙酸銨溶液(B)；0～10 min 78%A～65%A；10～12 min 65%A～55%A；12～15 min 55%A。體積流量為0.30 mL/min，檢測波長為260 nm，柱溫25 ℃。

2 結果與分析

2.1 線性范圍的考察

精密量取枸杞酸對照品標準貯備液適量，用流動相分別稀釋成濃度為5.6、28.0、56.0、140.1、280.2 μg/mL的5個工作液，按照上述色譜條件分別進樣1 μL，測定。以峰面積值(

)為縱坐標、對照品進樣量(

)為橫坐標繪制標準曲線，枸杞酸的回歸方程為：

=6.832 0

-0.283 7(

=1.000 0)，枸杞酸在5.6～280.2 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.2 精密度試驗

氣缸處于收縮狀態(tài)時（見圖1a），扭簧作用下4桿機構處于內(nèi)收狀態(tài)，活動窗扇重疊與固定窗扇內(nèi)側，有效降低空氣阻力對活動扇頁及聯(lián)動機構的沖擊。此時車窗凈開度不為220mm。

2.3 穩(wěn)定性試驗

管理者樂觀情緒、研發(fā)支出與企業(yè)成長性..................................................................................................................江新峰 張敦力 汪曉飛（22）

2.4 重現(xiàn)性試驗

精密稱取同一批次枸杞樣品粉末6份，按上述供試品制備方法制得供試品溶液，按色譜條件檢測，進樣量為1 μL，計算枸杞酸的含量，枸杞酸含量平均值為97.5 mg/g，RSD為1.32%。

2.5 加樣回收率試驗

取已知含量的枸杞樣品粉末9份，精密稱定，分別準確加入枸杞酸80%、100%、120%各3份，按上述供試品制備方法制得供試品溶液，按色譜條件檢測，進樣量為2 μL，測得枸杞酸加樣回收率為94.5%，RSD為1.63%。

2.6 不同產(chǎn)地的枸杞酸的含量測定

取市售不同產(chǎn)地的枸杞樣品，按上述供試品制備方法制得供試品溶液，按色譜條件檢測，進樣量為1 μL，樣品進樣2次，測定枸杞酸的含量，典型供試品與標準品圖譜見附圖，不同產(chǎn)地分析結果見附表。

3 結論與討論

采用超高效液相色譜法對4個主要產(chǎn)地、8種不同批次枸杞中的枸杞酸含量進行測定，結果表明，枸杞中枸杞酸的含量變化差異大，這種差異在不同產(chǎn)地之間均存在，可能與種類及種植過程有較大的關系。整體而言，寧夏產(chǎn)的枸杞酸含量較其他產(chǎn)地高，但是批次間差異也較大。本研究通過方法學驗證，證明該方法有較好的線性、精密度和回收率，與前期研究方法相比

，受枸杞中其他類物質(zhì)干擾較少，分離度較好，具有很好的準確性，可作為枸杞中枸杞酸的質(zhì)量控制方法。

[1]Yao R,Heinrich M,Zhao X,et al. What's the choice for goji:

L. or L. Chinense mill? [J]. Journal of Ethnopharmacology,2021(276):114185.

[2]Yao R,Heinrich M,Weckerle C S. The genus Lycium as food and medicine:A botanical,ethnobotanical and historical review [J]. Journal of Ethnopharmacology,2018(212):50-66.

[3]Wetters S,Horn T,Nick P. Goji who?Morphological and DNA based authentication of a "superfood" [J]. Frontiers in Plant Science,2018(9):1859.

[4]Yao R,Heinrich M,Zou Y,et al. Quality variation of Goji (fruits of

spp.) in China:A comparative morphological and metabolomic analysis [J]. Frontiers in Pharmacology,2018(9):151.

[5]Gong H,Rehman F,Ma Y,et al. Germplasm resources and strategy for genetic breeding of

species:A review [J]. Frontiers in Plant Science,2022(13):802936.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2020:260.

[7]謝文,陳華國,趙超,等.枸杞多糖的生物活性及作用機制研究進展[J].食品科學,2021,42(5):349-359.

[8]劉雨萌.枸杞子多糖的降血糖和抗疲勞活性評價及片劑制備研究[D].長春：吉林大學,2016.

[9]李維波,王玲,鄧學端,等.2型糖尿病患者紅細胞脆性與異形率的觀察及枸杞多糖對二者影響[J].河北中醫(yī),2000(8):585-586.

[10]孫桂菊,左平國.枸杞多糖功效研究及應用狀況[J].東南大學學報(醫(yī)學版),2010，29(2):209-215.

[11]田陽,龔桂萍,路宇,等.枸杞子多糖不同組分的雙向免疫調(diào)節(jié)機制研究進展[J/OL].食品科學:1-15[2022-03-15].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206. TS. 20220216.1031.010.html.

[12]Sun Z Q,Liu J F,Luo W,et al.

extract promotes M2 polarization and reduces oligomeric amyloid-β-induced inflammatory reactions in microglial cells [J]. Neural Regeneration Research,2022,17(1):203-209.

[13]Meng J,Lv Z,Guo M,et al.

extract inhibits β-amyloid toxicity by activating the antioxidant system and mtUPR in a caenorhabditis elegans model of alzheimer's disease [J]. FASEB Journal :Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology,2022,36(2):e22156.

[14]Liu J,Baum L,Yu S,et al. Preservation of retinal function through synaptic stabilization in alzheimer's disease model mouse retina by

extracts [J]. Frontiers in Aging Neuroscience,2021(13):788798.

[15]昭子.枸杞子16種神奇功效[J].現(xiàn)代養(yǎng)生,2012(17):27-28.

[16]李洋,馬文平,倪志婧.寧夏枸杞體外抗氧化機理研究[J].食品科學,2014,35(1):79-84.

[17]Meng J,Lv Z,Sun C,et al. An extract of

mimics exercise to improve muscle endurance through increasing type IIa oxidative muscle fibers by activating ERRγ[J]. FASEB Journal :Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology,2020,34(9):11460-11473.

[18]Genome-wide association study of 14 000 cases of seven common diseases and 3 000 shared controls[J]. Nature,2007,447(7145):661-678.

[19]Cremonesi P,Curone G,Biscarini F,et al. Dietary supplementation with Goji berries (

) modulates the microbiota of digestive tract and caecal metabolites in rabbits [J]. Animals,2022,12(1)：121.

[20]Yao R,Heinrich M,Wei J,et al. Cross-cultural ethnobotanical assembly as a new tool for understanding medicinal and culinary values-the genus Lycium as a case study [J]. Frontiers in Pharmacology,2021(12):708518.

[21]Xiao X,Ren W,Zhang N,et al. Comparative study of the chemical constituents and bioactivities of the extracts from fruits,leaves and root barks of

[J]. Molecules,2019,24(8):1585.

[23]Bubloz C,Udrisard I,Micaux F,et al. The vitamin C analogue 2-O-β-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid in rhizomes,stems and leaves of

[J]. Chimia,2020,74(10):828-830.

[24]Potterat O. Goji (

and L. Chinense):phytochemistry,pharmacology and safety in the perspective of traditional uses and recent popularity [J]. Planta Medica,2010,76(1):7-19.

[25]謝凌云. 2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸及其類似物的合成和降血糖活性研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學,2016.

[26]謝若男,張正波,裘娟萍.新抗氧化劑2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸的研究進展[J].科技通報,2010,26(3):362-366.

[27]張自萍,李弘武,李敏,等.枸杞子中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸抑制黑素合成的研究[J].中國新藥雜志,2007,16(9):689-692.

[28]李弘武,張自萍,廖國玲.新型維生素C前體2-O-α/β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸的研究進展[J].中國新藥雜志,2007,16(3):212-215.

[29]Yang S,Chen X,Sun J,et al. Polysaccharides from traditional Asian food source and their antitumor activity [J]. Journal of Food Biochemistry,2022,46(3):e13927.

[30]Cenariu D,Fischer-Fodor E,TIigu A B,et al. Zeaxanthin-rich extract from superfood

selectively modulates the cellular adhesion and MAPK signaling in melanoma versus normal skin cells in vitro [J]. Molecules,2021,26(2):333.

[31]Huang K,Yan Y,Chen D,et al. Ascorbic acid derivative 2-O-β-d-glucopyranosyl-L-ascorbic acid from the fruit of

modulates microbiota in the small intestine and colon and exerts an immunomodulatory effect on cyclophosphamide-treated BALB/c mice [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2020,68(40):11128-11143.

[32]Dong W,Huang K,Yan Y,et al. Long-term consumption of 2-O-β-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid from the fruits of

modulates gut microbiota in C57BL/6 mice [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2020,68(33):8863-8874.

[33]Xiong L,Deng N,Zheng B,et al. HSF-1 and SIR-2.1 linked insulin-like signaling is involved in Goji berry (

spp.) extracts promoting lifespan extension of Caenorhabditis elegans [J].Food & Function,2021,12(17):7851-7866.

[34]周凌,朱吟吟,郁靜華,等.高效液相色譜法測定枸杞相關食品中枸杞酸和玉米黃質(zhì)二棕櫚酸酯的含量[J].食品安全質(zhì)量檢測學報,2021,12(20):8141-8149.

[35]楊延超,董慧燕,殷夢龍.HPLC測定枸杞提取物中枸杞酸的含量[J].食品工業(yè),2014,35(10):255-257.