桉蛇止癢液抑制化合物48/80引起的急性瘙癢作用研究

宋亞軍 韋 婧 向翠曉 吉 忻 伍冠一

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530299；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530299

瘙癢是一種不愉悅且難以忍受的皮膚感覺(jué)，通常會(huì)引起強(qiáng)烈的搔抓欲望[1]，是皮膚科疾病的常見(jiàn)癥狀[2]，根據(jù)其持續(xù)時(shí)間不同可分為慢性和急性?xún)煞N[3]。瘙癢雖不直接威脅患者的生命，卻給患者的生活帶來(lái)了巨大困擾。引起瘙癢的原因有內(nèi)因如內(nèi)分泌疾病、神經(jīng)性疾病等，和外因如氣候、蚊蟲(chóng)叮咬等[4]。對(duì)于急性瘙癢，通常采用外用的止癢藥物，如抗組胺藥、激素類(lèi)、局麻藥等[5]，然而目前開(kāi)放治療急性瘙癢的中藥研究相對(duì)較少。

桉葉油是從桃金娘科植物藍(lán)桉中提取的具有芳香味的揮發(fā)性精油[6]，化學(xué)式為C10H18O，其主要化學(xué)成分是萜類(lèi)化合物及其含氧衍生物，具有抗菌、抗炎、促滲、驅(qū)蚊止癢等多種功效[7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)桉樹(shù)腦可抑制NF-κB的活化，進(jìn)而抑制多種炎癥性皮膚病的發(fā)生。此外，孫國(guó)慶等[9-11]還發(fā)現(xiàn)桉葉素是其主要成分，含量可高達(dá) 99.5%，具有很好的透皮促滲作用，與藥物聯(lián)用可以提高藥物吸收率和療效，而且謝遙[6]的動(dòng)物皮膚毒理實(shí)驗(yàn)顯示40%桉葉油無(wú)刺激性、急性毒性、過(guò)敏性，安全性高。

蛇床子素(Osthole),又名甲氧基歐芹酚，是天然香豆素類(lèi)化合物[12]，分子式為C15H16O3，不僅來(lái)源于蛇床子成熟果實(shí)，在陳皮、前胡、當(dāng)歸等藥用植物中也可提取[13]。有研究表明，蛇床子素藥理活性眾多，表現(xiàn)在抗炎[14]、抗過(guò)敏[15]、殺蟲(chóng)[16]、抗菌止癢[17]等方面。胡雪勤[18]研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素對(duì)特應(yīng)性皮炎的瘙癢癥狀有緩解作用且可以保護(hù)皮膚屏障，是一種安全有效的藥物。但由于蛇床子素是一種脂溶性化合物，水溶性差，不易經(jīng)皮吸收[19]，而桉葉油的透皮促滲作用恰能彌補(bǔ)蛇床子素的這一不足，研究者選擇乙醇為溶劑，將桉葉油與蛇床子素混合組成桉蛇止癢液，并觀察其作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只雄性SPF級(jí)ICR小鼠，6周齡，體重(35±10)g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)室溫為 22 ℃ 左右，光照時(shí)間8∶00～18∶00，自由飲水進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 桉葉油購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；蛇床子素、薄荷醇購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)科技有限公司；化合物 48 /80購(gòu)自上海sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 攝像機(jī)購(gòu)自上海索尼電子有限公司，型號(hào)：HDR-CX405；電子分析天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，型號(hào)：SQP；小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀購(gòu)自上海軟隆科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：BW-ZH600；亞力克透明盒子。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 桉蛇止癢液的配制 根據(jù)前期研究，配比為20∶1的桉葉油和蛇床子素的止癢效果最佳，故選擇該比例的桉葉油、蛇床子素混合液作為主藥，再加入80%乙醇配制成2∶8、3∶7、4∶6的桉蛇止癢液，最后再加入止癢液總質(zhì)量2%的薄荷醇即得。

2.2 Rotarod實(shí)驗(yàn) 提前3 d剃掉20只小鼠后頸部1～2 cm2的毛并進(jìn)行標(biāo)記，然后每天同一時(shí)間段將小鼠置于六通道轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上訓(xùn)練，轉(zhuǎn)速為21 r/min，每天進(jìn)行2次，每次5 min，每次訓(xùn)練結(jié)束后休息5 min繼續(xù)訓(xùn)練，持續(xù)3 d，目的是讓小鼠學(xué)會(huì)在轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上跑動(dòng)。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，隨機(jī)將訓(xùn)練后的老鼠分為空白組和實(shí)驗(yàn)組，分別給空白組和實(shí)驗(yàn)組背頸部滴加50 μL生理鹽水和50 μL配比為 4∶6 的桉蛇止癢液，15 min后，將小鼠置于轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上測(cè)試5 min，記錄小鼠的在棒時(shí)間。

2.3 急性瘙癢模型的建立 以ICR雄性小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)背頸部皮下注射50 μg/50 μL化合物48/80建立皮膚瘙癢模型[20]。

2.4 瘙癢行為實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前1 d剃掉小鼠頸部中央1～2 cm2的毛，實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)小鼠分為空白組與實(shí)驗(yàn)組并將小鼠放在完全相同的亞克力盒子中適應(yīng)30 min，之后將桉蛇止癢液滴于實(shí)驗(yàn)組小鼠頸部中央剃毛處，空白組小鼠滴等量生理鹽水，作用相應(yīng)時(shí)間(0 min 、15 min 、30 min)后，在空白組和實(shí)驗(yàn)組小鼠頸部剃毛處皮下注射50 μL的化合物48/80(50 μg/50 μL)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用高清攝像機(jī)對(duì)小鼠的瘙癢行為進(jìn)行記錄，然后采用雙盲法觀察并統(tǒng)計(jì)小鼠的瘙癢行為即每 5 min 內(nèi)的搔抓次數(shù)。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用GraphPad prism 8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有的結(jié)果均用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示，各組數(shù)據(jù)用配對(duì)t檢驗(yàn)的方法檢驗(yàn)差異性，P<0.05表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并計(jì)算不同配比桉蛇止癢液對(duì)化合物48/80誘導(dǎo)急性瘙癢的抑制率。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 桉蛇止癢液對(duì)化合物48/80 誘導(dǎo)急性瘙癢的直接作用 給予桉蛇止癢液后立刻給予化合物48/80，發(fā)現(xiàn)不同配比的桉蛇止癢液能夠抑制化合物48/80引起的瘙癢。與對(duì)照組(257.00±45.74)比較，2∶8的桉蛇止癢液作用后瘙癢次數(shù)降低到(122.00±19.17)次(*P<0.05,N=8)(如圖1 A、B所示)。此外，3∶7的桉蛇止癢液(225.10±29.46 VS 110.10±17.07,**P<0.05,N=8)(如圖1 C、D所示)以及 4∶6的桉蛇止癢液(245.10±16.90 VS 93.25±23.49,**P<0.05,N=8)(如圖1 E、F所示)都能抑制化合物48/80引起瘙癢。三種配比的桉蛇止癢液都能抑制抓撓次數(shù)峰值的出現(xiàn)或者延后抓撓次數(shù)峰值出現(xiàn)的時(shí)間(圖1 B、D、F)。三種配比的桉蛇止癢液給予小鼠后對(duì)于急性瘙癢的小鼠在短時(shí)間內(nèi)均能發(fā)揮很強(qiáng)、很快的止癢效果。配比為2∶8、3∶7、4∶6的桉蛇止癢液作用對(duì)急性瘙癢小鼠的抑制率分別為52.53%、51.09%、61.95%(如圖1 G所示)。

注：配比為2∶8的桉蛇止癢液作用于小鼠0 min后急性瘙癢小鼠30 min內(nèi)的搔抓次數(shù)(A)及30 min內(nèi)小鼠搔抓次數(shù)隨時(shí)間

3.2 給予桉蛇止癢液15 min對(duì)化合物48/80 誘導(dǎo)急性瘙癢的作用

3.2.1 桉蛇止癢液作用于小鼠15 min不能直接引起瘙癢行為 配比為2∶8的桉蛇止癢液作用于小鼠 15 min 的搔抓次數(shù)為(18.50±5.51)次，與對(duì)照組沒(méi)有差異(11.38±3.57)(P>0.05，N=8)(如圖2 A所示)。配比為3∶7(8.63±2.86 VS 6.88±3.40，P>0.05，N=8)(如圖2 C所示)。4∶6(11.25±2.96 VS 6.75±3.06，P>0.05，N=8)的桉蛇止癢液作用于小鼠15 min的搔抓次數(shù)與對(duì)照組也沒(méi)有顯著性差異。說(shuō)明止癢液作用15 min對(duì)小鼠沒(méi)有明顯的刺激性。

注：配比為2∶8的桉蛇止癢液作用于正常小鼠15 min內(nèi)的搔抓次數(shù)(A)及15 min內(nèi)搔抓次數(shù)隨時(shí)間變化的關(guān)系圖(B)，配比為

3.2.2 三種配比的桉蛇止癢液作用于小鼠15 min后對(duì)化合物48/80 誘導(dǎo)的急性瘙癢有顯著的抑制作用 給予小鼠桉蛇止癢液15 min后給予化合物48/80，發(fā)現(xiàn)不同配比的桉蛇止癢液均能顯著地抑制化合物48/80 誘導(dǎo)的急性瘙癢。與對(duì)照組(185.50±19.96)相比，2∶8的桉蛇止癢液作用于小鼠后瘙癢次數(shù)下降到(104.80±17.44)次(**P<0.05，N=8)(如圖3 A、B所示)。此外，3∶7的桉蛇止癢液(215.90±24.78 VS 96.63±11.47，**P<0.05，N=8)(如圖3 C、D所示)以及4∶6的桉蛇止癢液(228.30±34.85 VS 116.50±30.54，**P<0.05，N=8)(如圖3 E、F)都可顯著抑制化合物48/80誘導(dǎo)的急性瘙癢。三種配比的桉蛇止癢液均可抑制瘙癢次數(shù)峰值的出現(xiàn)或延后峰值出現(xiàn)的時(shí)間(如圖B、D、F所示)。上述結(jié)果表明，三種配比的桉蛇止癢液作用于小鼠15 min后對(duì)于急性瘙癢的小鼠在30 min內(nèi)均能發(fā)揮很快、較強(qiáng)的止癢效果，配比為2∶8、3∶7、4∶6的桉蛇止癢液對(duì)急性瘙癢小鼠的瘙癢抑制率分別為43.50%、55.24%、48.97%(如圖3 G所示)。

注：配比為2∶8的桉蛇止癢液作用15 min后急性瘙癢小鼠30 min內(nèi)的瘙癢次數(shù)(A)及30 min內(nèi)搔抓次數(shù)隨時(shí)間變化的

3.3 給予桉蛇止癢液30 min對(duì)化合物48/80誘導(dǎo)急性瘙癢的作用

3.3.1 桉蛇止癢液作用于小鼠30 min不會(huì)引起明顯的瘙癢行為 配比為2∶8的桉蛇止癢液作用于小鼠30 min內(nèi)搔抓(20.50±7.17)次，與其對(duì)照組沒(méi)有差異(16.50±3.76)(P>0.05，N=8)(如圖4 A、B所示)；配比為3∶7(20.13±3.89 VS 16.00±3.93，P>0.05，N=8)(如圖4 C、D)的桉蛇止癢液作用于小鼠30 min搔抓次數(shù)與對(duì)照組也無(wú)顯著性差異，說(shuō)明配比為2∶8、3∶7的止癢液均對(duì)小鼠沒(méi)有致癢性。配比為4∶6的桉蛇止癢液作用于小鼠30 min內(nèi)搔抓(52.75±9.60)次，與其對(duì)照組有顯著性差異(15.00±5.00，**P<0.05，N=8)(如圖4 E所示)，說(shuō)明4∶6的止癢液對(duì)小鼠可能有一定的刺激性，但總體的搔抓次數(shù)還是處于較低水平(如圖4 F所示)。

注：配比為2∶8的桉蛇止癢液作用于正常小鼠30 min內(nèi)的搔抓次數(shù)(A)及30 min內(nèi)搔抓次數(shù)隨時(shí)間變化的關(guān)系

3.3.2 桉蛇止癢液作用于小鼠30 min后對(duì)化合物48/80誘導(dǎo)的急性瘙癢有抑制作用 給予桉蛇止癢液 30 min 后給予化合物48/80，與對(duì)照組(166.20±21.85)相比，2∶8的桉蛇止癢液作用于小鼠后瘙癢次數(shù)下降至(101.40±13.54)次(P>0.05，N=5)(如圖5 A、B所示)，雖無(wú)顯著的差異，但是在一定程度上仍可抑制瘙癢。此外，3∶7的桉蛇止癢液(210.80±22.31 VS 121.80±16.22,*P<0.05，N=8)(如圖5 C、D)以及 4∶6的桉蛇止癢液(219.40±24.37 VS 118.00±19.52,**P<0.05,N=8)(如圖5 E、F所示)都能抑制化合物48/80引起瘙癢。三種配比的桉蛇止癢液都能抑制或者延后化合物48/80的瘙癢時(shí)間峰值(如圖5 B、D、F所示)。由結(jié)果可知，三種配比的桉蛇止癢液作用于小鼠30 min后對(duì)于急性瘙癢的小鼠在30 min內(nèi)均能發(fā)揮相對(duì)較弱，但見(jiàn)效快、持續(xù)時(shí)間久的止癢效果。配比為2∶8、3∶7、4∶6的桉蛇止癢液作用對(duì)急性瘙癢小鼠的抑制率分別為38.99%、42.22%、46.22%(如圖5 G所示)。

注：配比為2∶8的桉蛇止癢液作用30 min后急性瘙癢小鼠30 min內(nèi)的搔抓次數(shù)(A)及搔抓次數(shù)隨時(shí)間變化的關(guān)系

3.3 桉蛇止癢液對(duì)小鼠的強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)能力無(wú)影響 rotarod實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組和空白組小鼠基本都能穩(wěn)定地隨著疲勞轉(zhuǎn)棒儀的轉(zhuǎn)動(dòng)而跑動(dòng)，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，空白組的在棒時(shí)間為(300.00±0.01)s，實(shí)驗(yàn)組的在棒時(shí)間為(276.70±23.28)s,兩組之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)(如圖6所示)，由此可得結(jié)論：桉蛇止癢液對(duì)小鼠的強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)能力無(wú)影響。

圖6 桉蛇止癢液對(duì)小鼠強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)能力的影響

4 討論

桉葉油來(lái)源相當(dāng)廣泛，目前廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、食品加工、化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域，然而其作為藥用治療皮膚病的研究很少。蛇床子素常存在于傘形科和蕓香科植物中，在部分的菊科和豆科中也有分布。近年來(lái)對(duì)其的研究也較多，尤其是其在醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域。蛇床子素的研究主要針對(duì)抗炎、抗菌、抗腫瘤等藥理作用，但在止癢方面的研究相對(duì)較少。

研究者將二者聯(lián)用，自擬桉蛇止癢液，研究其止癢效果，結(jié)果顯示其對(duì)化合物48/80誘導(dǎo)的急性瘙癢有很好的抑制作用。從作用時(shí)間上看，三種配比的桉蛇止癢液對(duì)化合物48/80誘導(dǎo)急性瘙癢的小鼠能在給藥后 5 min內(nèi)發(fā)揮較強(qiáng)藥效(瘙癢抑制率均大于50%)且均能至少持續(xù)15 min。給予15 min以及 30 min 后的小鼠所表現(xiàn)出的整體止癢效果較弱，由此推測(cè)桉蛇止癢液的整體效果與其作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，這一系列變化趨勢(shì)可能與80%乙醇有關(guān)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，止癢液揮發(fā)越多，作用效果就越弱。從桉蛇止癢液的不同配比來(lái)看，4∶6的桉蛇止癢液作用效果最好(作用0 min、15 min、30 min的平均瘙癢抑制率為52.38%)，3∶7的桉蛇止癢液作用效果次之(作用 0 min、15 min、30 min的平均瘙癢抑制率為49.52%)，2∶8的桉蛇止癢液作用效果最差(作用 0 min、15 min、30 min的平均瘙癢抑制率為45.01%)，這一變化可能與止癢液中桉葉油與蛇床子素的含量有關(guān)，桉葉油與蛇床子素含量越高，止癢液的止癢效果越好。

有研究發(fā)現(xiàn)，桉葉油主要成分1,8-桉葉素、蛇床子素能夠作用于TRP通道以及其他抑制瘙癢物質(zhì)的釋放，這些作用可能參與桉蛇止癢液止癢機(jī)制。比如，陳凡等[21]研究表明桉葉油中的活性成分1,8-桉葉素能明顯抑制組胺的產(chǎn)生、降低IL-31的量、降低體內(nèi)PAF的含量從而抑制5-HT和組胺的釋放，進(jìn)而發(fā)揮止癢作用；Takaishi[22]認(rèn)為1,8-桉葉素是TRPM8通道的激動(dòng)劑，激活TRPM8通道可產(chǎn)生涼感覺(jué)，涼感覺(jué)可抑制癢覺(jué)；伍冠一等[23]發(fā)現(xiàn)蛇床子素能抑制肥大細(xì)胞釋放致癢物質(zhì)組胺；Yang等[24]的研究結(jié)果表明蛇床子素的止癢效果與抑制組胺依賴(lài)通路H1受體、H4受體下游的離子通道TRPV1有關(guān)。同時(shí)，Yang等[25]也發(fā)現(xiàn)蛇床子素能夠微弱激活TRPV1通道并使之脫敏，抑制組胺依賴(lài)瘙癢。綜上，桉蛇止癢液的止癢機(jī)制可能與抑制致癢物質(zhì)組胺以及IL-31的釋放，降低體內(nèi)PAF含量和抑制TRPV1和激活TRPM8通道有關(guān)。這一研究成果將為桉蛇止癢液止癢機(jī)制的進(jìn)一步研究和相關(guān)新藥的開(kāi)發(fā)提供參考。