伴隨基因突變/擴(kuò)增在肺癌患者中的變化及其臨床意義

潘 雪，高春峰，邢玉斐，鐘安媛，周 童，張?jiān)隼?，施敏?/p>

蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 蘇州 215004

2021年美國癌癥協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)報(bào)告，肺癌仍是目前人類死亡率最高（男性22%，女性22%）的腫瘤［1］。肺癌的惡性程度較高，病情進(jìn)展較快，超過70%的患者在確診時(shí)已出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)隔器官的轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)［2］。表皮生長因子受體?酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor?tyrosine kinase inhibitor，EGFR?TKI）已成為表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因敏感突變患者的一線標(biāo)準(zhǔn)治療，建議初診非小細(xì)胞肺癌患者完善新一代基因測序（next?generation sequencing technology，NGS）檢測［3］。NGS 檢測除了可為患者選擇合適的靶向治療外，還可以預(yù)測療效，發(fā)現(xiàn)耐藥機(jī)制，同時(shí)能發(fā)現(xiàn)新的基因突變類型，為靶向藥物研發(fā)提供依據(jù)［4］。本研究回顧性分析經(jīng)NGS檢測的71例肺癌患者的基因檢測數(shù)據(jù)，并進(jìn)一步分析其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象

納入蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院2015 年12 月—2020年7月入組的肺癌患者，依據(jù)氣管鏡、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺、胸腔積液病理結(jié)果明確診斷?；颊呋蚣覍倬押炇饡嬷橥鈺?，本研究已經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審批［（2013）倫審科研第（K11）號(hào)］通過。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診的肺癌患者；②年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)有其他惡性腫瘤；②存在可能影響隨訪和短期生存的其他嚴(yán)重疾??；③既往服用過EGFR?TKI 等靶向藥物、免疫藥物；④既往接受過化療、放療或其他治療。共納入71例患者（132份標(biāo)本）。

1.2 標(biāo)本收集及患者隨訪

1.2.1 檢測標(biāo)本

腫瘤組織來源為氣管鏡下活檢組織標(biāo)本、肺穿刺活檢組織標(biāo)本，循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor deoxyribo nucleic acid，ctDNA）檢測標(biāo)本為外周血液、胸腔積液、腦脊液。

1.2.2 標(biāo)本收集

血液、胸腔積液、腦脊液標(biāo)本：收集患者用藥前和耐藥后全血（8 mL）或胸腔積液（8 mL）或腦脊液（3 mL），保存于streck管，并于管壁標(biāo)記患者姓名及樣品號(hào)，15～35 ℃條件下運(yùn)輸，72 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。4 ℃條件下，1 590g離心10 min，收集上清至15 mL離心管，4 ℃條件下16 000g離心10 min，再次收集上清至新的15 mL離心管。封口膜封口后干冰運(yùn)輸。

石蠟組織標(biāo)本：收集患者腫瘤組織切片，要求惡性腫瘤細(xì)胞占比≥10%，壞死組織區(qū)域≤50%，標(biāo)本編號(hào)標(biāo)記規(guī)范清晰，石蠟組織標(biāo)本切片厚度5 μm（防脫玻片），切片時(shí)攤片即可，無需烤片處理，取6 周以內(nèi)的石蠟切片，每組切片15 張，常溫或2～8 ℃運(yùn)輸。

1.2.3 檢測方法

采用NGS檢測技術(shù)（廣州燃石醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司：Illumina 公司檢測平臺(tái)，美國）捕獲與腫瘤發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)基因的全部外顯子，包括腺瘤性結(jié)腸息肉（adenomatous polyposis coli，APC）、乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）、細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因2A（cyclin?dependent kinase inhibitor 2A gene，CDKN2A）等，及與肺癌個(gè)性化治療相關(guān)或高頻突變基因的重要外顯子及部分內(nèi)含子區(qū)域，包括間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（v?raf murine sarcoma viral onco?gene homolog B1，BRAF）、細(xì)胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）等，進(jìn)行1 000×高深度測序，以測量上述基因中出現(xiàn)的低頻及超低頻的來自腫瘤的DNA突變、重排、拷貝數(shù)增加等。

1.2.4 生存隨訪

通過門診或電話隨訪，于2016 年1 月開始，每個(gè)月隨訪1次，直至患者死亡或研究結(jié)束。隨訪截至2020年11月30日，患者在隨訪截止時(shí)間仍未死亡，則按截尾數(shù)據(jù)處理。中位隨訪時(shí)間28.5個(gè)月。隨訪率為95%，3例失訪?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為患者治療開始至患者死亡或末次隨訪的時(shí)間，中位OS定義為生存率為50%時(shí)所對應(yīng)的生存時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定性資料采用例數(shù)和率描述；符合正態(tài)分布的定量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；非正態(tài)分布資料，采用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用Mann?WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal?Wallis 檢驗(yàn)，配對設(shè)計(jì)資料采用Wil?coxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn)。采用Kaplan?Meier 法繪制生存曲線圖，比較采用Log?rank 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

本研究共入組71 例患者，共132 份標(biāo)本，檢測標(biāo)本類型包括血液（67 份）、腫瘤組織（48 份）、胸腔積液（15 份）、腦脊液（2 份）。71 例患者均為初診患者，其中男性32 例、女性39 例；年齡（65±11）歲，年齡范圍36～85歲；其中Ⅰ期患者2例，Ⅱ期患者3例，Ⅲ期患者3 例，Ⅳ期患者63 例；吸煙患者23 例；腺癌患者62 例，鱗狀細(xì)胞癌患者7 例，小細(xì)胞肺癌患者2 例。所有檢測標(biāo)本EGFR 突變陽性率39.4%（52/132）。所有檢測標(biāo)本除EGFR 突變之外，另外可檢測到前5位基因突變/擴(kuò)增分別是腫瘤蛋白p53（tumor suppressor protein p53，TP53）、鼠類肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）、表皮生長因子受體2（human epithelial growth factor receptor 2，ERBB2）、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1（retino?blastoma 1，RB1）、肝細(xì)胞生長因子酪氨酸激酶受體（hepatocyte growth factor receptor，MET）。

2.2 初診肺癌患者血液伴隨基因狀態(tài)

共入組初診肺癌患者血液標(biāo)本50例，基于血漿ctDNA NGS 檢測結(jié)果顯示，EGFR 突變陽性率34%（17/50），除EGFR 突變之外，所檢測標(biāo)本還可檢測到79 種基因突變/擴(kuò)增，共出現(xiàn)123 次伴隨基因突變/擴(kuò)增，人均2.46次/例（123次/50例），伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)≥2 次的見圖1，伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)為1 次的共有60 種基因，伴隨基因突變/擴(kuò)增（除EGFR 外）與患者臨床分期、吸煙、年齡、性別、病理類型均無關(guān)（均P＞0.05，表1）。

表1 50例初診肺癌患者血液標(biāo)本伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Correlation between frequency of associated gene mutation/amplification and clinicopatho?logical features in blood samples of 50 newly diagnosed lung cancer patients

圖1 50例初診肺癌患者血液標(biāo)本伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)分布圖Figure 1 Frequency distribution of gene mutation/amplification in blood samples from 50 newly diagnosed lung cancer patients

除EGFR 突變之外，初診肺癌患者血液標(biāo)本中伴隨基因TP53突變頻數(shù)最高，因此針對此基因做進(jìn)一步生存分析。入組Ⅳ期肺癌患者血液標(biāo)本40例，TP53陽性患者中位OS為66個(gè)月，TP53陰性患者中位OS 為47 個(gè)月，兩組生存曲線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.321，P=0.571，圖2）。

圖2 肺癌患者血液標(biāo)本伴隨基因TP53陽性和陰性患者生存曲線的比較Figure 2 Comparison of survival curves between patients with TP53 positive and negative concomitant gene in blood samples of lung cancer patients

2.3 初診肺癌患者腫瘤組織伴隨基因狀態(tài)

共入組初診肺癌患者腫瘤組織46 例，EGFR 突變陽性率50%（23/46），除EGFR 突變之外，所檢測標(biāo)本還可檢測到160 種基因突變/擴(kuò)增，所有標(biāo)本共出現(xiàn)285 次伴隨基因突變/擴(kuò)增，人均6.20 次/例（285 次/46 例），伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)≥2 次的見圖3，伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)為1 次的共有107 種，伴隨基因突變/擴(kuò)增（除EGFR 外）與患者臨床分期、年齡均無關(guān)（均P＞0.05），與吸煙狀態(tài)、性別、病理類型均有關(guān)（均P＜0.05，表2）。

表2 46例初診肺癌患者腫瘤組織標(biāo)本伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)與臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Correlation between frequency of associated gene mutation/amplification and clinicopatho?logical features in tumor tissue samples of 46 newly diagnosed lung cancer patients

圖3 46例初診肺癌患者腫瘤組織標(biāo)本伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)分布圖Figure 3 Frequency distribution of gene mutation/amplification in tumor tissue samples from 46 newly diagnosed lung can?cer patients

除EGFR 突變之外，初診肺癌患者腫瘤組織標(biāo)本中伴隨基因TP53出現(xiàn)突變頻數(shù)最高，因此針對此基因做進(jìn)一步生存分析，入組Ⅳ期肺癌患者腫瘤組織標(biāo)本25 例，TP53 陽性患者中位OS 未達(dá)到，TP53陰性患者中位OS為38.5個(gè)月，兩組生存曲線間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.309，P=0.579，圖4）。

圖4 肺癌患者腫瘤組織標(biāo)本伴隨基因TP53陽性和陰性患者生存曲線的比較Figure 4 Comparison of survival curves between patients with TP53 positive and negative concomitant gene in tumor tissue samples of lung cancer patients

2.4 同時(shí)進(jìn)行腫瘤組織和血液標(biāo)本配對檢測的患者伴隨基因狀態(tài)

共入組25 例，初診腫瘤組織中基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)［3（1，8）］高于同一患者的血液組［3（0，1）］，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（W=-150，P=0.001）；動(dòng)態(tài)監(jiān)測抗腫瘤治療前后的17例患者，其中使用EGFR?TKI 治療9 例，間變性淋巴瘤激酶抑制劑（anaplastic lymphoma kinase inhibitor，ALK?TKI）治療3 例，化療5 例，抗腫瘤治療前后兩組伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)相比［1（0，2）vs.1（0，3）］，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（W=-3，P=0.916）。

3 討論

全面的分子生物學(xué)檢測信息可為肺癌患者方案選擇、預(yù)后判斷以及臨床試驗(yàn)入組提供依據(jù)。準(zhǔn)確獲取患者基因的突變狀態(tài)，有助于篩選更加合適的治療人群，精準(zhǔn)地指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療，為腫瘤診斷、治療方案選擇、預(yù)后監(jiān)控等提供重要信息［5］。以EGFR 為例，與標(biāo)準(zhǔn)化療方案相比，EGFR 敏感突變型晚期非小細(xì)胞肺癌患者使用小分子靶向藥物EGFR?TKI 治療，極大地提高了該患者群的臨床療效（客觀緩解率、無進(jìn)展生存期、總生存時(shí)間）及生命質(zhì)量［6］。但仍有20%～30%的EGFR 敏感基因突變的患者出現(xiàn)原發(fā)性耐藥或快速進(jìn)展，可能是由于EGFR 突變合并其他伴隨基因突變，導(dǎo)致下游或旁路信號(hào)通路激活［7］。BENEFIT 研究是一項(xiàng)單臂、多中心、前瞻性、大型Ⅱ期臨床試驗(yàn)（CTONG1405；NCT02282267），2014 年12 月—2016 年1 月，共納入中國15個(gè)中心的426例Ⅳ期肺腺癌患者，其中391例具有組織和血液樣本，188 例患者血液EGFR 突變陽性并接受吉非替尼治療（250 mg/d），在180 例具有基線NGS 數(shù)據(jù)的EGFR 突變患者中，僅存在EGFR 敏感突變患者，無進(jìn)展生存期可達(dá)13.2個(gè)月，EGFR敏感突變合并TP53 突變患者，無進(jìn)展生存期為9.3 個(gè)月，伴隨其他基因突變亞組患者，無進(jìn)展生存期僅為5.5個(gè)月［8］。

正常情況下TP53可以控制細(xì)胞循環(huán)周期、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡及抗血管生成。TP53突變幾乎在所有人類癌癥中均有發(fā)生，是最常見的突變基因之一，在肺鱗狀細(xì)胞癌患者中甚至高達(dá)80%［9-10］。TP53突變可激活T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，可能成為免疫治療療效的潛在預(yù)測因子［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨基因TP53 突變與否與生存率無關(guān)，可能與本研究入組患者多為使用靶向藥物治療患者，且免疫治療患者相對較少有關(guān)，后續(xù)有待進(jìn)一步增大樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在肺癌患者組織標(biāo)本中行生存分析時(shí)，TP53 陽性患者中位OS 未達(dá)到，考慮可能與隨訪時(shí)間仍較短，且樣本量不足有關(guān)，后續(xù)有待進(jìn)一步增大樣本量行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

本研究共入組初診肺癌患者血液標(biāo)本50例，除EGFR 突變之外，所檢測標(biāo)本還可檢測到79 種基因突變/擴(kuò)增，共出現(xiàn)123 次伴隨基因突變/擴(kuò)增；本研究入組初診肺癌患者腫瘤組織46例，除EGFR 突變之外，所檢測標(biāo)本還可檢測到160 種基因突變/擴(kuò)增，所有標(biāo)本共出現(xiàn)285 次伴隨基因突變/擴(kuò)增，同一患者腫瘤組織標(biāo)本中伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)高于血液標(biāo)本，原因可能是腫瘤患者體內(nèi)ctDNA 的含量低、半衰期短、需要高靈敏度的檢測技術(shù)進(jìn)行基因檢測［12］。另外，需考慮腫瘤存在異質(zhì)性，腫瘤組織檢測反映腫瘤局部基因水平狀態(tài)，基于ctDNA 的基因檢測更能反映患者的整體狀態(tài)，并允許實(shí)時(shí)監(jiān)測，可作為腫瘤組織基因檢測的補(bǔ)充［13］。

本研究針對抗腫瘤治療前后的17 例患者進(jìn)行基因檢測結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)抗腫瘤治療前和抗腫瘤治療后兩組伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原因可能為入組病例較少，且各組患者一線治療方案有所差異，不同的治療方案可能導(dǎo)致基因突變/擴(kuò)增發(fā)生改變，后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，同時(shí)針對不同臨床標(biāo)本及不同治療方案的患者分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。另外，本研究入組胸腔積液、腦脊液病例以及病理類型為鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌病例均較少，后續(xù)應(yīng)盡可能擴(kuò)大樣本量。本研究為單中心研究，期待有更多的隨機(jī)對照研究進(jìn)一步探索伴隨基因異常對患者預(yù)后的影響。

肺癌患者抗腫瘤治療前即存在多種伴隨基因突變/擴(kuò)增，有吸煙史、男性患者具有較高水平的伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)，伴隨基因突變/擴(kuò)增頻數(shù)的改變不能提示患者病情進(jìn)展，隨著靶向治療和免疫治療逐漸在腫瘤治療中占據(jù)主導(dǎo)地位，基因測序技術(shù)具有極大的發(fā)展前景。肺癌是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜病變過程，采用多標(biāo)本、多基因的平行、動(dòng)態(tài)檢測有助于反映肺癌驅(qū)動(dòng)基因全貌，更全面評(píng)估腫瘤的耐藥機(jī)制，對臨床具有指導(dǎo)意義。