LC?MS/MS 法同時(shí)測定大鼠血漿中來那度胺、伏立諾他和地塞米松的濃度

張馨予，顏月園，劉 剛，胡玉濤

1江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，江蘇 連云港 222007；2連云港市藥物研發(fā)共性技術(shù)中心，江蘇 連云港222007

來那度胺是一種免疫調(diào)節(jié)類的抗腫瘤藥，可直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［1］。來那度胺聯(lián)合其他藥物如硼替佐米、沙利度胺等治療腫瘤的臨床試驗(yàn)也成為近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［2-5］。地塞米松是臨床上常用的一種糖皮質(zhì)激素，臨床上主要用于治療過敏性皮炎、支氣管哮喘和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾?。?］。地塞米松常與其他藥物聯(lián)用治療疾?。?］，如地塞米松與來那度胺的聯(lián)合用藥，臨床上主要用于治療多發(fā)性骨髓瘤［8-11］。伏立諾他是一種新型分子靶向抗腫瘤藥物，通過抑制組蛋白去乙?；傅幕钚远辜?xì)胞周期停滯和/或細(xì)胞凋亡，它在骨癌的治療中也受到重視。研究表明，來那度胺、伏立諾他和地塞米松三者聯(lián)合用藥在治療多發(fā)性骨髓瘤方面具有臨床研究價(jià)值［12-13］，因此同時(shí)監(jiān)測來那度胺、伏立諾他和地塞米松的血藥濃度對于三者的聯(lián)合用藥研究具有重要意義。

目前，研究人員多采用液相色譜法（liquid chro?matography，LC）、液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chro?matography?mass spectrometry，LC?MS）測定來那度胺、伏立諾他或地塞米松其中的一種［14-18］或進(jìn)行聯(lián)合用藥分析［4-5］，文獻(xiàn)調(diào)研顯示未發(fā)現(xiàn)同時(shí)定量大鼠血漿中來那度胺、伏立諾他和地塞米松的報(bào)道。近年來，因靈敏度高、穩(wěn)定性好，LC?MS 法越來越多地應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域，尤其是固相萃取及超高效色譜分離技術(shù)，使得高通量樣品定量檢測成為可能［19-20］。本研究建立了固液萃取法處理血液樣品，LC?MS/MS 法同時(shí)檢測兩種組分，定量限滿足生物微量含量分析，為來那度胺，伏立諾他、地塞米松的聯(lián)合用藥提供了重要研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

來那度胺（批號20200516）、伏立諾他（批號20191116）、地塞米松（批號20191025），內(nèi)標(biāo)物甲糖寧（批號20191114），均由南京澤朗生物科技有限公司提供，對照品經(jīng)HPLC 峰面積歸一化法檢測，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98.6%以上。甲醇（Merk公司，德國）、乙腈（國藥集團(tuán)）為色譜純；超純水經(jīng)過Milli?Q系統(tǒng)純化制備；其余試劑均為分析純，購自北京國藥集團(tuán)。

安捷倫三重四級桿1290 LC?6460 QQQ 串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有四元低壓梯度泵和MassHunter 工作站，安捷倫公司，美國）、Eppendorf 5427 R低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國），Mettler ME155DU 型十萬分之一電子分析天平（梅特勒?托利多儀器有限公司，美國），Oasis?HLB 固相萃取柱（規(guī)格60 mg，沃特世公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 儀器條件

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液?乙腈。梯度洗脫：0～1.5 min，20%～30% 乙 腈；1.5～2.0 min，30%～35%乙 腈；2.0～2.5 min，35%乙腈；系統(tǒng)平衡3 min；體積流量0.6 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜采用電噴霧正離子源（ESI+源），多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；駐留時(shí)間為100 ms。檢測離子的質(zhì)核和碰撞電壓：來那度胺m/z 260→149，13 eV；地塞米松m/z 393→355，5 eV；伏立諾他m/z 265→232，13 eV；內(nèi)標(biāo)甲糖寧m/z 271→155，37 eV。檢測電壓3.5 kV；離子源溫度120 ℃；錐孔電壓220 V；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣體（N2）體積流量9 L/min。

1.2.2 溶液的制備

混合對照品溶液：分別取來那度胺、伏立諾他、地塞米松對照品適量，精密稱定，單獨(dú)以甲醇溶解來那度胺，以70%甲醇溶解伏立諾他和地塞米松，并定容，制成質(zhì)量濃度分別為1.03、1.04、1.03 mg/mL的對照品儲備液；分別精密量取適量儲備液于同一容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，配制得系列混合對照品工作液，低溫避光保存。

內(nèi)標(biāo)工作液：取甲糖寧對照品10 mg，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)儲備液。臨用前將內(nèi)標(biāo)儲備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為40 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2.3 動物實(shí)驗(yàn)

8只雄性（190±25）g SD大鼠購自南京市青龍山實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心（SCXK 2008?0033）。大鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)6 d，維持溫度24～27 ℃，濕度（50±10）%，實(shí)驗(yàn)前12 h 停止進(jìn)食，飲用水一直供飲，動物實(shí)驗(yàn)遵守相關(guān)動物管理準(zhǔn)則，給藥4 h后可進(jìn)食。

取來那度胺、伏立諾他、地塞米松對照品適量，精密稱定，加0.5%甲基纖維素溶液制成三者質(zhì)量濃度分別2.01、2.01、1.98 mg/mL的混合水懸液。

灌胃前每只大鼠眼眶取無藥空白血液用于標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品及質(zhì)控（quality control，QC）樣品的制備。灌胃針給每只大鼠灌胃藥物溶液（10 mL/kg），灌胃后10、20、30、45 min 及1、2、3、5、12、18 h 時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行大鼠眼眶取血，約0.25 mL 血液樣品收集在K2?EDTA 離心管中，立即以4 ℃、6 000 r/min 離心10 min，制得血漿樣品，進(jìn)樣分析前貯存于-20 ℃環(huán)境下。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品及QC樣品的制備

標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品：分別精密量取上述系列混合對照品工作液適量，加入100 μL 空白血漿中，制成6 個濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，含來那度胺質(zhì)量濃度范圍為1.03～515.00 ng/mL、伏立諾他1.04～520.00 ng/mL、地塞米松1.03～515.00 ng/mL。每個標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品中含內(nèi)標(biāo)（internal standard，IS）甲糖寧200 ng。

空白血漿中制備成低、中、高3 個濃度水平的QC 樣品：來那度胺（1.03、103.00、515.00 ng/mL）、伏立諾他（1.04、104.00、520.00 ng/mL）和地塞米松（1.03、103.00、515.00ng/mL）。

1.2.5 血漿樣品處理

先加入1 mL 甲醇沖洗，后加入1 mL 超純水沖洗以活化固相萃取小柱。取空白、標(biāo)準(zhǔn)血漿或用藥后血漿樣品100 μL，置1.5 mL 無菌離心管中，加入5 μL IS（40 μg/mL），渦旋40 s 混勻，取混合溶液裝載進(jìn)活化后的固相萃取柱，加入1 mL超純水沖洗小柱，后加入1.2 mL 甲醇洗脫，取甲醇洗脫液于試管中，35 ℃N2吹干，加入100 μL 80%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋振蕩40 s，4 ℃低溫12 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)樣5 μL 進(jìn)行分析。

1.2.6 方法學(xué)考察

專屬性：取6份不同來源的空白大鼠血漿，配制加入對照品的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，取大鼠灌胃服藥后的血漿樣品，分別進(jìn)行分析以考察方法專屬性，記錄質(zhì)譜MRM圖。

線性關(guān)系和最低定量限（lower limit of quantifica?tion，LLOQ）：取含IS的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，以血漿中被分析物的濃度（x）為橫坐標(biāo)，被分析物與IS的峰面積比（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸（權(quán)重因子為1/x2）。在信噪比S/N ≥10時(shí)，重復(fù)分析5次標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，其精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）應(yīng)≤15%，準(zhǔn)確度的誤差在參考值80%～120%內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品中的最低濃度為LLOQ［21］。

精密度和準(zhǔn)確度：為考察日內(nèi)和日間精密度與準(zhǔn)確度，用空白血漿制成低、中、高質(zhì)量濃度QC 樣品各3 份，連續(xù)測定3 d，用建立的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的質(zhì)量濃度。

提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)：配制低、中、高濃度的QC 樣品，每個濃度平行制備5 份，按前述蛋白沉降方法處理后進(jìn)行液質(zhì)分析，記錄質(zhì)譜響應(yīng)峰面積為C。空白血漿處理后添加對照品工作液，制備QC同濃度的溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積為B。同濃度的對照品工作液，不加血漿直接進(jìn)樣記錄峰面積為A。內(nèi)源性物質(zhì)引起的基質(zhì)效應(yīng)表示為B/A×100%，提取回收率為C/B×100%。

穩(wěn)定性：為排除外界因素對測試結(jié)果的影響，分析血漿QC 樣品在不同儲存條件下以考察穩(wěn)定性，分別考察樣品在室溫下儲存24 h 的短期穩(wěn)定性、在-20 ℃下儲存14 d 的長期穩(wěn)定性、3 次冷凍?解凍循環(huán)后（-20～20 ℃）的穩(wěn)定性、在4～6 ℃下放置在儀器進(jìn)樣器內(nèi)12 h 的后處理穩(wěn)定性，采用凍融樣品與新鮮制備的樣品對照獲得準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

空白樣品和標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的典型質(zhì)譜圖譜見圖1，各化合物的分離度合適，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對檢測無干擾。

圖1 來那度胺、伏立諾他和地塞米松的空白和標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的MRM質(zhì)譜圖Figure 1 MRM mass spectra of blank and standard plasma samples of lenalidomide，vorinostat and dexamethasone

2.2 線性關(guān)系和LLOQ

結(jié)果表明，來那度胺、伏立諾他和地塞米松在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.995），線性方程分別為Y=0.038 1X-0.958 9（R2=0.998 3），Y=0.006 8X-0.1308（R2=0.997 9）和Y=0.015 8X-0.723 2（R2=0.996 8），3 種化合物的LLOQ 分別達(dá)到1.03、1.04、1.03 ng/mL，顯示出該法適合微量分析。

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

結(jié)果顯示，來那度胺、伏立諾他和地塞米松的各濃度QC 樣品的日內(nèi)和日間精密度RSD 均小于7.4%，準(zhǔn)確度為94.7%～106.7%（表1）。

2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

分析結(jié)果見表1。極性均較小的來那度胺、伏立諾他和地塞米松的基質(zhì)效應(yīng)均在92.3%～109.7%，基質(zhì)效應(yīng)不明顯。提取回收率在87.4%～103.6%之間，能夠滿足生物樣品濃度測定的要求。在實(shí)驗(yàn)過程中，考察IS 的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=5）分別為（91.7±6.7）%和97.2%～104.4%。

表1 精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果Table 1 Results of precision，accuracy，extraction recovery and matrix effect

2.5 穩(wěn)定性

結(jié)果見表2。準(zhǔn)確度誤差均符合要求［（100.0±12.8）%］，結(jié)果表明來那度胺、伏立諾他和地塞米松的血漿樣品在上述儲存條件下性質(zhì)穩(wěn)定。

表2 不同條件下來那度胺、伏立諾他和地塞米松穩(wěn)定性結(jié)果Table 2 The stability of lenalidomide，vorinostat and dexamethasone at different conditions

2.6 藥代動力學(xué)研究

方法學(xué)考察后，該方法應(yīng)用于大鼠血漿中來那度胺、伏立諾他和地塞米松的定量分析，血藥濃度曲線見圖2。

圖2 單劑量口服給藥后來那度胺、伏立諾他和地塞米松的血藥濃度?時(shí)間曲線（n=8）Figure 2 Plasma concentration?time curves of the lenalid?omide，vorinostat and dexamethasone after a single oral administration（n=8）

來那度胺、伏立諾他和地塞米松在給藥2 h 以內(nèi)均能達(dá)到最大血藥濃度（Cmax），分別為（327.7±37.2）ng/mL、（413.6±40.2）ng/mL 和（1 362.8±125.6）ng/mL，總體而言，上述藥品都能很快吸收，在給藥12 h時(shí)來那度胺、伏立諾他和地塞米松的含量仍高于LLOQ。和其他研究相比，各化合物的藥代動力學(xué)結(jié)果有所不同，原因可能是聯(lián)合用藥導(dǎo)致藥藥協(xié)同作用。

3 討論

預(yù)實(shí)驗(yàn)中，為選擇最佳血漿處理方法，考察比較了液液萃取法、固液萃取法、蛋白沉淀法對被分析物提取效率的影響。液液萃取法選擇性好，可以獲得較小的基質(zhì)效應(yīng)，但提取率的重復(fù)性差；蛋白沉淀法處理血漿樣品簡單、快速，但基質(zhì)效應(yīng)明顯，固液萃取法的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果都較好，操作省力，故采用固液萃取法。

根據(jù)指標(biāo)性成分的理化性質(zhì)和色譜行為，比較了以甲醇、乙腈與水、甲酸?水、磷酸?水、乙酸銨+甲酸構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)。結(jié)果表明，以甲醇?水或酸水為系統(tǒng)各成分的分離效果不理想，乙腈?酸的流動相系統(tǒng)色譜峰的對稱性不好，經(jīng)優(yōu)化后的乙腈?乙酸銨+甲酸?水的流動相可使各成分的分離效果較好，分離度符合要求，基線較平穩(wěn)。本研究選擇梯度洗脫，可改變被分析物的保留時(shí)間，從而提高被分析與共流出物的分離度以減小基質(zhì)效應(yīng)。

IS 在生物樣品定量分析中用來修正提取過程中損耗，本研究的化合物結(jié)構(gòu)、提取回收效果均有較大差異，雖然氘化標(biāo)準(zhǔn)品是最佳內(nèi)標(biāo)物選擇，但是這種IS 價(jià)格貴且不一定有售。甲糖寧的提取回收方式、質(zhì)譜分析條件和來那度胺、伏立諾他、地塞米松有很大相似性，甲糖寧的洗脫時(shí)間和3 個待測物不同，對待測物峰型和分離度的影響小，同時(shí)價(jià)廉易得，因此，本研究選擇甲糖寧為IS。

綜上，本研究建立了同時(shí)測定大鼠血漿中來那度胺、伏立諾他和地塞米松的LC?MS 方法，并應(yīng)用于大鼠藥代動力學(xué)研究。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法可同時(shí)測定來那度胺、伏立諾他和地塞米松的血藥濃度,且快速、經(jīng)濟(jì)，為這些藥物的研究提供了重要的分析手段。