重組酶介導(dǎo)的腸出血性大腸桿菌O157：H7等溫擴增方法的建立

蔡 欣，王源林，趙 杰，匡 衡，孫學(xué)偉，劉宗財，崔 茜，楊 展，汪茂榮*

1安徽醫(yī)科大學(xué)八一臨床學(xué)院東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)肝病科教研室，安徽 合肥 230000；2東部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210002；3中國人民解放軍空軍93801部隊醫(yī)院醫(yī)療所，陜西 咸陽 712201；4南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院感染病科，江蘇 南京 210029；5濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003；6空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系，陜西 西安 710032；7東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 南京 210001

腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagicE.coli，EHEC）是一種常見的食源性致病微生物，主要引起食源性疾病［1-3］。EHEC 中主要的致病血清型是O157：H7，是1975 年從1 例出血性結(jié)腸炎患者中分離出來的，最早在1982年美國的俄勒岡州和密歇根州暴發(fā)流行［4］。由EHEC O157：H7引起的癥狀主要是非出血性腹瀉［5-6］，嚴(yán)重的可發(fā)展為溶血性尿毒癥綜合征［7-8］、出血性結(jié)腸炎、血栓性血小板減少性紫癜和永久性器官衰竭［9］。目前世界上很多國家中，仍有不少人缺乏干凈的飲水和基本醫(yī)療衛(wèi)生保障［10］，由EHEC O157：H7造成的感染仍會對大眾健康造成威脅，近兩年不時有EHEC感染的報道［11-12］。早期發(fā)現(xiàn)是應(yīng)對EHEC O157：H7 傳播的最佳策略之一，可以及時控制感染者，遏制其暴發(fā)流行。因此，快速檢測可以在這個階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，檢測方法的研究具有重要意義。

之前常用的檢測EHEC O157：H7 的方法為PCR 和脈沖場凝膠電泳等［13-14］。這些方法準(zhǔn)確性較高，在實驗室應(yīng)用普遍，然而，它們都需要精密的設(shè)備和訓(xùn)練有素的人員，成本較高，應(yīng)用場景有限。在條件有限的情況下，需要一種操作簡便、省時省力的檢測方法，從而早發(fā)現(xiàn)早治療，為疾病防控贏取時間。重組酶介導(dǎo)的恒溫擴增（recombi?nase?aided amplification，RAA）技術(shù)具有檢測時間短、操作簡便等優(yōu)點［15-16］，所以本研究基于此方法建立了EHEC O157：H7 的快速RAA 熒光法和RAA試紙條法（RAA?lateral flow dipstick，RAA?LFD），旨在為基層等特殊環(huán)境提供簡便的篩查EHEC O157：H7的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

MiniBEST 質(zhì)粒純化試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；RAA核酸擴增試劑盒（熒光法）、RAA核酸擴增試劑盒（試紙條法）、膠體金側(cè)向流免疫層析試紙條、B?6100 RAA 恒溫振蕩離心儀、F?1620 恒溫核酸擴增檢測儀（江蘇奇天基因生物科技有限公司）；-20 ℃冰箱（青島Haier 公司）；Eppendorf 移液器（Eppendorf公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

從GeneBank 數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/gen?bank）中獲得EHEC O157：H7 保守基因Stx Ⅰ和StxⅡ的核酸序列，尋找相對保守區(qū)域，挑選480 bp 的目的基因合成并導(dǎo)入PUC57質(zhì)粒中，該質(zhì)粒的構(gòu)建由上海生工生物工程股份有限公司完成。以同樣的方法構(gòu)建其他常見的腸道致病菌（金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌、彎曲菌、耶爾森菌、志賀桿菌）質(zhì)粒模板。

1.2.2 引物探針合成

引物和探針根據(jù)RAA引物和探針設(shè)計原則，在構(gòu)建好的重組質(zhì)粒內(nèi)運用Primer Premier 5 在該擴增片段上分別設(shè)計2條上游引物、5條下游引物和1條探 針，利 用NCBI 網(wǎng) 站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Primer?BLAST 驗證引物和探針的特異性。所有引物和探針（表1）均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，并采用高效液相色譜法（high perfor?mance liquid chromatography，HPLC）進行純化。

表1 RAA熒光檢測EHEC O157：H7的引物和探針核酸序列Table 1 Sequences of primers and probe for fluorescent RAA assay for EHEC O157：H7

1.2.3 RAA熒光方法的建立

RAA 熒光法最佳引物的篩選：以含有EHEC O157：H7 DNA序列的質(zhì)粒作為模板，將設(shè)計的2條上游引物、5條下游引物進行2×5組合，結(jié)合探針，并與RAA 熒光核酸擴增試劑盒中的其他試劑混合為50 μL 的擴增體系。將反應(yīng)體系置于B?6100 RAA 恒溫振蕩離心儀中震蕩混勻2 min，轉(zhuǎn)移至F?1620恒溫核酸擴增檢測儀，39 ℃反應(yīng)16 min，每20 s采集1次熒光值。挑選出起峰時間最早、峰值最高的上下游引物組合作為最佳引物。

RAA熒光法引物濃度和探針濃度優(yōu)化：在50 μL擴增體系中分別加入1.5、1.8、2.1、2.4、2.7 μL原始濃度為10 μmol/L的最佳上下游引物進行擴增，以濃度為1×106拷貝數(shù)/μL的EHEC O157：H7質(zhì)粒為模板進行熒光RAA核酸擴增，篩選出最佳引物濃度。在擴增體系中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL 原始濃度為10 μmol/L 的探針進行擴增，以濃度為1×106拷貝數(shù)/μL 質(zhì)粒為模板進行熒光RAA 法擴增，篩選出最佳探針濃度。

1.2.4 RAA?LFD法的建立

在RAA熒光法優(yōu)化的條件下，將熒光法優(yōu)化好的引物和探針序列設(shè)計成LFD 法的引物和探針。將設(shè)計好的引物探針按照RAA 熒光法的50 μL 體系配置反應(yīng)管，將反應(yīng)管置于B?6100 RAA 恒溫振蕩離心儀中震蕩混勻2 min后，設(shè)置反應(yīng)溫度39 ℃，反應(yīng)時間16 min。反應(yīng)結(jié)束后的擴增產(chǎn)物通過膠體金側(cè)向流免疫層析試紙條檢測。從反應(yīng)管中取5 μL擴增產(chǎn)物，與95 μL PBS緩沖液在1.5 mL EP管中混勻，將試紙條的偶聯(lián)墊末端垂直插入EP管中，使其接觸混合液，2 min 后取出試紙條觀察并拍照記錄結(jié)果（陽性樣品出現(xiàn)紅色檢測線和藍色質(zhì)控線，陰性樣品不出現(xiàn)紅色檢測線僅出現(xiàn)藍色質(zhì)控線）。

1.2.5 靈敏性實驗

以EHEC O157：H7 質(zhì)粒為模板進行靈敏性評價。將構(gòu)建質(zhì)粒按濃度梯度10 倍倍比稀釋成1×100～1×109拷貝數(shù)/μL陽性標(biāo)準(zhǔn)品備用。利用優(yōu)化好的兩個RAA 反應(yīng)擴增體系依次對上述定量樣品進行測定，確定方法的檢出限。

1.2.6 特異性實驗

采用與消化道感染相關(guān)或者臨床癥狀相近的細菌質(zhì)粒樣本進行特異性評價。以5種在人群中較為常見的腸道細菌如金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌、彎曲菌、耶爾森菌、志賀桿菌及EHEC O157：H7質(zhì)粒為模板同時進行檢測，評價EHEC O157：H7 RAA熒光法和RAA?LFD法的特異性。

2 結(jié)果

2.1 EHEC O157：H7 RAA 擴增體系的建立

2.1.1 引物、探針篩選

以濃度為1×106拷貝數(shù)/μL 的EHEC O157：H7質(zhì)粒為模板，進行RAA 熒光實驗，篩選出最佳上下游引物E?F2、E?R2，擴增曲線如圖1所示（未擴增的引物組合及每組的陰性對照未顯示），E?F2、E?R2引物對在4 min 內(nèi)即開始起峰，在16 min內(nèi)達到峰值，表明最佳引物組合為E?F2、E?R2。

圖1 EHEC O157：H7引物篩選Figure 1 Primer screening for EHEC O157：H7

2.1.2 引物和探針濃度的優(yōu)化

根據(jù)2.1.1實驗得出的最佳引物組合，以濃度為1×106拷貝數(shù)/μL質(zhì)粒為模板，ddH2O為陰性對照，將濃度為10 μmol/L的E?F2、E?R2引物設(shè)置5個梯度加樣量進行RAA熒光檢測（圖2A），引物體積為1.5 μL時擴增曲線效果最佳。同樣，探針體積為1.0 μL時，擴增效果最佳（圖2B）。

圖2 引物和探針的濃度優(yōu)化Figure 2 Concentration optimization of primers and probes

2.2 RAA?LFD法的建立

利用熒光法篩選好的引物和探針更改熒光標(biāo)記的位置，設(shè)計出RAA?LFD法的引物和探針（表2）。

表2 EHEC O157：H7 RAA?LFD法檢測引物和探針核酸序列Table 2 Sequences of primers and probe for RAA?LFD assay for EHEC O157：H7

2.3 靈敏性實驗

RAA 熒光法靈敏性實驗結(jié)果（圖3A）顯示，16 min左右1×104～1×109拷貝數(shù)的樣本均有擴增曲線出現(xiàn)，1×100～1×103拷貝數(shù)樣本和陰性對照無擴增曲線，由此得出最低檢出限為1×104拷貝數(shù)。RAA?LFD法的靈敏性檢測結(jié)果（圖3B）顯示，16 min左右1×104～1×109拷貝數(shù)出現(xiàn)紅色檢測線，1×100～1×103拷貝數(shù)及陰性對照僅出現(xiàn)藍色質(zhì)控線，RAA?LFD法最低檢出限為1×104拷貝數(shù)。說明EHEC O157：H7 RAA熒光法及RAA?LFD法均具有較好的靈敏性。

圖3 EHEC O157：H7靈敏性試驗Figure 3 Sensitivity test of EHEC O157：H7

2.4 特異性試驗

RAA熒光法檢測結(jié)果（圖4A）顯示，只有EHEC O157：H7 出現(xiàn)光滑的擴增曲線，為陽性擴增，其他樣本如金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌、彎曲菌、耶爾森菌、志賀桿菌及陰性對照均沒有擴增，均為陰性。RAA?LFD法顯示（圖4B），只有EHEC O157：H7出現(xiàn)紅色檢測線，為陽性，其他樣本及陰性對照僅出現(xiàn)藍色質(zhì)控線，均為陰性結(jié)果。表明本研究建立的RAA 熒光法和RAA?LFD 法特異性較高，不會發(fā)生交叉反應(yīng)。

圖4 EHEC O157：H7特異性試驗Figure 4 Specific test of EHEC O157：H7

3 討論

本研究結(jié)合RAA 技術(shù)建立EHEC O157：H7 的兩種快速檢測方法，操作簡便，無須特殊學(xué)習(xí)和培訓(xùn)，與普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reac?tion，PCR）、熒光定量PCR 技術(shù)相比，無需高溫條件及昂貴的儀器，與其他檢測技術(shù)如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)（loop?mediated isothermal amplification，LAMP）等相比，可以大大縮短反應(yīng)時間［17-21］，只需在恒溫39 ℃條件下16 min 即可完成檢測?？蛇m用于現(xiàn)場快速檢測，尤其在海關(guān)、機場及基層偏遠地區(qū)，具有較好的發(fā)展前景。

根據(jù)已有的研究，比較了本方法與其他檢測方法的靈敏性和特異性，與普通PCR方法相比，本研究采用的RAA 熒光法及RAA?LFD 法靈敏性均較高［22］，但與LAMP 法相比，靈敏性較低［23］，原因可能是LAMP法較多的引物對組成可以提高檢測方法的靈敏性。特異性方面，幾種檢測方法均有較好的特異性。RAA 熒光法及RAA?LFD 法在靈敏性方面介于普通PCR方法與LAMP法，但檢測時間更短，所需條件更簡便。

本研究同時也具有一定局限性，首先，針對RAA?LFD 法，由于需要打開試驗管進行操作，具有污染的可能性，目前研究人員在超凈臺完成試劑配制，在獨立房間進行實驗，并在實驗完成后用核酸清除劑處理，最大限度減少核酸污染情況。本研究所采用的RAA?LFD 方法靈敏度沒有達到其他研究所報道的1×102～1×103拷貝數(shù)［19］，原因可能是引物及反應(yīng)體系的優(yōu)化仍有待進一步研究。其次，由于條件所限，本研究沒有使用臨床樣本進行實驗，而是使用人工合成的質(zhì)粒作為樣本進行驗證，后期將收集臨床樣本，完善該方面研究，使用臨床樣本進行靈敏性和特異性的驗證和改善。