利用分子機(jī)器的組裝與分解構(gòu)建pH敏感性谷胱甘肽過氧化物人工酶

安紹杰，許洪峰，李思，許遠(yuǎn)航，李佳錫

（沈陽化工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110142）

引 言

谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)是一種非常重要的抗氧化酶，在維持生物體內(nèi)活性氧(ROS)的平衡過程中起著無法替代的作用，對(duì)于預(yù)防和治療由于體內(nèi)活性氧含量過高而導(dǎo)致的疾病（如各種炎癥、心腦血管疾病、白內(nèi)障以及癌癥等）具有明顯的效果[1-4]。天然GPx 的催化中心是硒代半胱胺酸，由終止密碼子UGA 編碼，使其存在難以用基因工程方法進(jìn)行量產(chǎn)的缺點(diǎn)。因此，為了使GPx在體內(nèi)、體外的應(yīng)用獲得更加廣泛的拓展，人工模擬GPx 的研究引起了科學(xué)家們極大的興趣[5-6]。

對(duì)GPx 的人工模擬最早始于Mugesh 等[7-8]合成的一系列小分子有機(jī)硒化合物和有機(jī)碲化合物。其中最成功的是依布硒啉（2-苯基苯并異硒唑-3-酮），作為一種優(yōu)秀的抗氧化藥物，其在臨床試驗(yàn)中受到了廣泛關(guān)注[9]。之后，多種經(jīng)過化學(xué)修飾的含有GPx 催化中心的主體分子陸續(xù)開發(fā)出來，其中包括了環(huán)糊精分子[10]、抗體[11]以及天然酶[12]等。這些主體分子含有親水或者疏水的空腔結(jié)構(gòu)，具有特異性識(shí)別不同底物的功能，使其人工GPx 模擬酶的催化效率獲得了極大提高。近二十年來，隨著超分子科學(xué)以及納米科學(xué)的快速發(fā)展，研究者們發(fā)明了膠束、囊泡以及納米管等多種人工酶的優(yōu)良載體，并借此成功設(shè)計(jì)制備了多種超分子自組裝納米GPx人工酶[13-15]。這些納米人工酶所含有的疏水層與疏水底物之間具有疏水相互作用，使其具有一定的底物識(shí)別能力，從而展現(xiàn)出優(yōu)良的催化活性。與此同時(shí)，更多的手段也被科學(xué)家們所利用，例如，通過基因工程改造制備特異性識(shí)別能力更精確的硒酶和碲酶，使得催化活性能夠媲美甚至超過天然GPx 的人工酶成為可能[16]。

由于天然酶活性的展現(xiàn)受到了生命體內(nèi)不同環(huán)境的調(diào)控，隨著人工酶研究的不斷深入，科學(xué)家們的目光逐漸投向具有環(huán)境響應(yīng)性的智能人工酶模型[17]。天然酶的活性在生命體內(nèi)主要依靠非共價(jià)的弱相互作用來調(diào)控，因此包括主-客體、親-疏水、靜電、氫鍵、范德華力等非共價(jià)相互作用的超分子相互作用在構(gòu)建智能人工酶領(lǐng)域具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)[18]。在智能GPx 人工酶的研究中，Liu 等[19]做出了開創(chuàng)性的工作，他們利用一種經(jīng)典的超分子相互作用——偶氮苯衍生物與含碲環(huán)糊精分子之間的主-客體相互作用設(shè)計(jì)了光敏性的智能GPx 人工酶。此后，Yin 等[20-21]將溫敏性聚合物聚（N-異丙基丙烯酰胺）作為基元，通過超分子自組裝手段設(shè)計(jì)了一系列含硒/碲活性中心的溫敏性微凝膠，從而構(gòu)建了具有溫敏特性的智能GPx人工酶。

人體的胃液與體液之間以及癌細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在顯著的pH 差異，利用這種生命體內(nèi)天然的pH 差異實(shí)現(xiàn)響應(yīng)的智能人工酶，在藥物載體領(lǐng)域有著更廣泛的潛在應(yīng)用[22-23]。近些年來，基于準(zhǔn)輪烷分子且具有pH 響應(yīng)的分子機(jī)器得到了迅速發(fā)展，它們能夠響應(yīng)外界刺激信號(hào)產(chǎn)生可逆的往復(fù)運(yùn)動(dòng)從而實(shí)現(xiàn)開關(guān)效應(yīng)，為構(gòu)建pH 響應(yīng)性智能GPx人工酶提供了全新的方法和思路[24-29]。其中，科學(xué)家們以葫蘆脲系列分子家族中的葫蘆[6]脲分子（CB[6]）為主體分子，烷基二胺分子為客體分子，構(gòu)建了一系列基于準(zhǔn)輪烷分子的pH 響應(yīng)性分子機(jī)器[30]。CB[6]能夠與雙質(zhì)子化的二胺分子形成穩(wěn)定的1∶1 主客體復(fù)合物，但是當(dāng)烷基二胺分子中的兩個(gè)氮原子處于單質(zhì)子化和去質(zhì)子化狀態(tài)時(shí)，CB[6]與其的結(jié)合常數(shù)顯著下降。這就是這類分子機(jī)器具有pH響應(yīng)性質(zhì)的原因。

受到上述工作的啟發(fā)，本文希望利用含有高活性GPx 催化中心的有機(jī)碲化合物與CB[6]分子構(gòu)建具有pH 響應(yīng)的分子機(jī)器，從而獲得pH 敏感性GPx人工酶。合成了乙胺單碲醚（化合物I），當(dāng)兩個(gè)氨基均被質(zhì)子化時(shí)，乙胺單碲醚可以與CB[6]復(fù)合形成分子機(jī)器，此時(shí)催化中心被包埋在CB[6]的疏水空腔之中無法接觸到底物，因此不能充分展現(xiàn)GPx活力。當(dāng)兩個(gè)氨基隨著pH 的升高逐漸變?yōu)閱钨|(zhì)子化和去質(zhì)子化時(shí)，分子機(jī)器逐漸分解，活性中心逐漸從CB[6]的疏水空腔之中釋放出來，GPx 活力也隨之逐漸顯現(xiàn)（圖1）。通過調(diào)節(jié)體系的pH 來控制分子機(jī)器的形成與分解，可實(shí)現(xiàn)對(duì)人工酶活性的可逆調(diào)控，從而構(gòu)建高活性pH敏感性GPx人工酶。

圖1 利用分子機(jī)器的組裝與分解構(gòu)建pH敏感性谷胱甘肽過氧化物人工酶示意圖Fig.1 Schematic representation of pH sensitive artificial glutathione peroxidase based on the formation and dissociation of molecular machine

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

2-溴乙胺氫溴酸鹽（C2H6NH2Br·HBr，99%）、二氯甲烷（DCM，分析純）、乙酸乙酯（EAT，分析純）、硼氫化鈉（NaBH4，98%）、三氟乙酸（TFA，99%）、碲粉（Te，99.99%）購自安徽澤升科技有限公司，四氫呋喃（THF，分析純）、三乙胺（(C2H5)3N，99%）、無水甲醇（MAL，分析純）、乙醚（C4H10O，分析純）購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，二碳酸二叔丁酯（BOC，98%）購自北京百靈威科技有限公司，碳酸氫鈉（NaHCO3，分析純）、氯化鈉（NaCl，分析純）、無水硫酸鈉（Na2SO4，分析純）購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

BRUKERAM-500 核磁共振儀，德國Bruker 公司；SHIMADZU 2450 紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；C-MAGHS7digital 數(shù)顯型磁力攪拌器，廣州儀科實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司；N-1300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；CA-1116A 冷卻水循環(huán)裝置，上海愛朗儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；2XZ-4旋片真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 乙胺單碲醚（I）的合成

合成路線如圖2所示。向500 ml單口圓底燒瓶中依次加入2-溴乙胺氫溴酸鹽（Ⅱ, 20 g, 97.6 mmol）、三乙胺（70 ml）以及四氫呋喃（100 ml），將二碳酸二叔丁酯（23.5 g, 107.36 mmol）溶解于四氫呋喃（100 ml）并滴加至圓底燒瓶中，在室溫反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后減壓將體系中的四氫呋喃除去，之后將產(chǎn)物溶解于200 ml 二氯甲烷中，分別使用0.1 mol·L-1鹽酸、50 g·L-1的NaHCO3溶液以及飽和NaCl溶液各萃取二氯甲烷溶液三次，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)相，得到18.6 g 無色透明液體產(chǎn)物Ⅲ，產(chǎn)率85%。1H NMR(CDCl3;500 MHz),δ:1.46(s,9H,C(Me)3),3.46(t,2H,BrCH2),3.54(q,3H,NCH2)。

圖2 乙胺單碲醚（化合物I）的合成路線圖Fig.2 Synthesis procedures of compound I

使用無水甲醇（50 ml）將化合物Ⅲ（5.9 g, 26.4 mmol）溶解，通入氮?dú)?0 min 以除去體系中的氧氣。向250 ml圓底燒瓶中分別加入碲粉（3.7 g,29 mmol）以及硼氫化鈉（1 g,26.4 mmol），反復(fù)三次減壓并通入氮?dú)獬シ磻?yīng)體系中的氧氣，之后將不含氧氣的水（30 ml）加入體系中升溫至80℃反應(yīng)30 min 生成Na2Te2。反應(yīng)溶液冷卻至室溫后將化合物Ⅲ的甲醇溶液加入到體系中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后使用二氯甲烷萃取三次，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將二氯甲烷除去，通過柱色譜法將反應(yīng)產(chǎn)物提純[硅膠，二氯甲烷/乙酸乙酯=15/1(體積比)作為洗脫劑]，得到2.9 g 黃色粉末狀固體產(chǎn)物Ⅳ，產(chǎn)率40%。1H NMR(DMSO; 500 MHz; Me4Si),δ: 1.37 (s, 18H, 2C(Me)3),3.08 (t, 4H, TeCH2), 3.20 (t, 4H, NCH2);13C NMR(DMSO; 500 MHz),δ: 155.78, 78.13, 44.50, 40.03,28.74;ESI-MS,m/z:586.28[M+K]+。

分別使用無水甲醇（50 ml）將化合物Ⅲ（4.13 g,18.5 mmol）及化合物Ⅳ（2 g,3.7 mmol）溶解，通入氮?dú)?0 min 以除去體系中的氧氣。向250 ml 圓底燒瓶中加入硼氫化鈉（0.7 g, 18.5 mmol），反復(fù)三次減壓并通入氮?dú)獬シ磻?yīng)體系中的氧氣，之后將上述化合物Ⅳ甲醇溶液加入到圓底燒瓶中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30 min。之后將上述化合物Ⅲ甲醇溶液加入到圓底燒瓶中，室溫持續(xù)攪拌反應(yīng)12 h。待反應(yīng)結(jié)束后，加入100 ml 水并使用二氯甲烷萃取三次，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將二氯甲烷除去，通過柱色譜法將反應(yīng)產(chǎn)物提純(硅膠，二氯甲烷/乙酸乙酯= 15/1 作為洗脫劑)，得到2.2 g 無色透明液體產(chǎn)物V，產(chǎn)率70%。1H NMR(DMSO; 500MHz; Me4Si),δ: 1.37 (s, 18H, 2C(Me)3),2.61 (t, 4H, TeCH2), 3.20 (t, 4H, NCH2);13C NMR(DMSO; 500MHz),δ: 155.78, 78.07, 42.91, 39.95,28.70;ESI-MS,m/z:435.13[M+Na]+。

用10 ml 二氯甲烷將化合物Ⅴ（2.2 g,5.3 mmol）溶解后加入50ml圓底燒瓶中，冰浴保護(hù)下將三氟乙酸（5 ml,28.6 mmol）滴加到化合物Ⅴ的二氯甲烷溶液中，滴加完畢后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)溶液倒入50 ml 飽和碳酸鈉溶液中，使用二氯甲烷萃取三次，之后將二氯甲烷除去，得到580 mg 淡黃色液體產(chǎn)物I，產(chǎn)率50%。1H NMR(D2O;500 MHz; Me4Si),δ: 2.69 (t, 4H, TeCH2), 2.85 (t, 4H,NCH2);13C NMR (D2O; 500 MHz),δ: 42.12, 36.16;ESI-MS,m/z:217.95[M+H]+。

1.3 分子機(jī)器組裝與分解的表征

利用1H NMR 滴定實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分子機(jī)器的組裝：將化合物Ⅰ以5 mmol·L-1的濃度溶解在D2O 中，將CB[6]分別以1.25、2.5、3.75 和5 mmol·L-1的濃度溶解在1 mol·L-1KCl 的D2O 溶液中。將化合物Ⅰ與上述不同濃度CB[6]溶液以等比例混合，通過1H NMR測(cè)試驗(yàn)證分子機(jī)器的逐漸組裝。

利用1H NMR 研究分子機(jī)器在不同pH 條件下的分解情況：將化合物Ⅰ與CB[6]按照1∶1 的比例、5 mmol·L-1的濃度溶于D2O 組裝形成分子機(jī)器，利用DCl 和NaOD 調(diào)控分子機(jī)器溶液的pH 在6～9 范圍內(nèi)改變，測(cè)試不同pH 條件下溶液的1H NMR 譜，研究分子機(jī)器在不同pH條件下的分解情況。

1.4 GPx酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)試

1.4.1 TNB 法測(cè)試GPx 活性 TNB 法又稱為直接法，該測(cè)試方法將天然GPx 底物谷胱甘肽替換成TNB（3-羧基-4-硝基苯硫酚）作為反應(yīng)底物，式（1）為其反應(yīng)方程式。

測(cè)試體系總體積設(shè)定為500 μl，首先向比色皿中加入濃度為1 mmol·L-1、溶于對(duì)應(yīng)pH 緩沖液中的TNB 溶液50 μl，然后加入所需濃度溶于對(duì)應(yīng)pH 緩沖液中的酶50 μl，再加入200 mmol·L-1的磷酸緩沖液350 μl（pH=6～10）并在37℃下保溫5 min，最后加入50 μl 濃度為2.5 mmol·L-1的H2O2（溶解于去離子水中）啟動(dòng)反應(yīng)。通過觀察TNB 在410 nm 紫外-可見光譜吸收值的降低，計(jì)算TNB 被H2O2氧化的反應(yīng)速率。酶活力定義為每分鐘氧化1 μmol TNB 所需酶量，單位是μmol·min-1·μmol-1。

1.4.2 雙酶還原法測(cè)試GPx活性 雙酶還原法又稱為間接法，它的測(cè)試方法與天然GPx相同，即將谷胱甘肽（GSH）作為底物，并以GSH 還原酶消耗的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）偶聯(lián)分析酶學(xué)活性，式（2）、式（3）為其反應(yīng)方程式。

測(cè)試體系總體積定為500 μl，首先向比色皿中加入濃度為10 mmol·L-1的GSH 溶液50 μl，谷胱甘肽還原酶（GR，1U）50 μl，所需濃度的酶50 μl 以及50 mmol·L-1的磷酸緩沖液250 μl，在37℃下保溫5 min 后加入50 μl NADPH（溶解于1%的NaHCO3溶液中，濃度為2.5 mg·ml-1），在37℃下保溫5 min后加入50 μl 的H2O2（5 mmol·L-1）啟動(dòng)反應(yīng)。通過觀察NADPH 在340 nm 紫外-可見光譜吸收值的降低，計(jì)算GSH 被H2O2氧化的反應(yīng)速率。酶活力定義為每分 鐘 氧 化1 μmol·L-1NADPH 所 需 酶 量，單 位 是μmol·min-1·μmol-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物I的GPx活性與最適pH

在37℃、pH=7 的條件下，分別利用TNB 法及雙酶還原法對(duì)化合物I 的GPx 活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，兩種方法所得催化曲線的斜率均隨化合物Ⅰ濃度的增加而線性增加（圖3），這符合典型的酶促反應(yīng)規(guī)律。通過計(jì)算得到化合物Ⅰ的GPx 活力在TNB 測(cè)試法中為（1.46±0.02）μmol·min-1·μmol-1，雙酶還原測(cè)試法中為（1.97±0.08）μmol·min-1·μmol-1。經(jīng)典的有機(jī)碲化合物二苯二碲（PhTeTePh）通過TNB 測(cè)試法測(cè)得的活性為4.6 μmol·min-1·μmol-1，通過雙酶還原測(cè)試法測(cè)得的活性為0.9 μmol·min-1·μmol-1[15,31-32]。TNB 是一種疏水性較強(qiáng)的底物，二苯二碲帶有兩個(gè)疏水性的苯基，與疏水性底物之間具有一定的結(jié)合能力，因此在TNB 測(cè)試法中二苯二碲的活性比化合物I 高。雙酶還原測(cè)試法是最大程度還原生命體內(nèi)催化反應(yīng)的測(cè)試方法，此方法中的底物是具有良好水溶性的天然酶底物GSH。GSH 帶有羧基，與化合物I 的氨基之間具有靜電相互作用，因此雙酶還原法中化合物I 的活性較高。由于二苯二碲與化合物I 的催化中心相似，且兩種化合物均不具備精確的底物識(shí)別位點(diǎn)，僅與不同底物之間具有一定的弱相互作用，因此二者在不同測(cè)試體系中活力值的差別不大，均在1 個(gè)數(shù)量級(jí)之內(nèi)。天然GPx 的活性僅能夠通過雙酶還原法測(cè)試，這是由于天然GPx具有底物專一性，僅能夠識(shí)別GSH，也正是這種精確識(shí)別并結(jié)合底物的能力賦予了天然酶極高的催化效率，其比活力高達(dá)103μmol·min-1·μmol-1數(shù)量級(jí)[32-34]。

圖3 化合物Ⅰ濃度分別為0、1、2、4 μmol·L-1條件下的催化曲線Fig.3 Catalytic curves of different concentrations of compound Ⅰby TNB assay system and GSH reductase-reduced NADPH coupled catalytic activity assay system at pH=7 concentrations of compound Ⅰ/(μmol·L-1):a—0;b—1;c—2;d—4

為了進(jìn)一步研究化合物I 的催化性質(zhì)，利用TNB 法測(cè)試了化合物Ⅰ在不同pH 下的GPx 活性。結(jié)果表明，化合物Ⅰ的活性在pH=6、7、8和9時(shí)分別為(1.36±0.03)、(1.46±0.02)、(0.68±0.06)和(0.34±0.02)μmol·min-1·μmol-1（圖4）。圖4 直觀地表明了化合物Ⅰ在pH=7時(shí)能夠展現(xiàn)出最高的GPx活性。

圖4 化合物Ⅰ在不同pH下的GPx活性Fig.4 Catalytic activities of compound Ⅰat different pHs

2.2 化合物I催化機(jī)理及動(dòng)力學(xué)

2.2.1 化合物I 催化雙倒數(shù)曲線的測(cè)定 為了進(jìn)一步研究有機(jī)化合物Ⅰ的催化機(jī)理及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，通過雙酶還原法測(cè)定了其催化雙倒數(shù)曲線。測(cè)試體系中含有H2O2和GSH 兩種底物，通過固定其中一種底物的濃度，改變另一種底物的濃度，來檢測(cè)催化反應(yīng)對(duì)底物濃度的依賴性，進(jìn)而闡明它的催化動(dòng)力學(xué)機(jī)制。將GSH 的濃度分別固定為1.5、2 和4 mmol·L-1，測(cè)定H2O2的濃度分別為0.33、0.5 和0.75 mmol·L-1時(shí)化合物Ⅰ的GPx 活性，以化合物Ⅰ催化速率的倒數(shù)對(duì)GSH 濃度的倒數(shù)作圖，得到一組相交直線[圖5(a)]。再以化合物Ⅰ催化速率的倒數(shù)對(duì)H2O2濃度的倒數(shù)作圖，同樣得到一組相交直線[圖5(b)]。

圖5 化合物Ⅰ催化GSH還原H2O2的雙倒數(shù)曲線Fig.5 Double-reciprocal plots of the reduction of H2O2 by GSH under the catalysis of compound Ⅰ

2.2.2 化合物I 的催化反應(yīng)機(jī)理分析 通過以上研究發(fā)現(xiàn)化合物Ⅰ的雙倒數(shù)曲線是一系列相交于一點(diǎn)的直線，說明其催化遵循順序機(jī)制。順序機(jī)制中在最后一步釋放單一產(chǎn)物（GSSG），在釋放產(chǎn)物之前，兩種底物都與酶形成酶-底物復(fù)合物[35]。Engman 等[36]推測(cè)有機(jī)碲化物在催化循環(huán)過程中處于氧化態(tài)(RTe(OH)2R)。結(jié)合文獻(xiàn)[35-36]的研究，推測(cè)化合物I的催化反應(yīng)遵循圖6所示的循環(huán)機(jī)理。

圖6 化合物Ⅰ可能的催化循環(huán)示意圖Fig.6 Proposed catalytic mechanism of compound Ⅰ

2.2.3 化合物I 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算 GPx

催化GSH 與H2O2反應(yīng)的相關(guān)穩(wěn)態(tài)方程如式（4）所示：

其中，v0為初始反應(yīng)速率;[E0]為初始模擬酶濃度；kcat為一級(jí)反應(yīng)速率；KmGSH和KmH2O2分別為GSH 和H2O2的Michaelis-Menten 常數(shù)。根據(jù)穩(wěn)態(tài)方程和雙倒數(shù)曲線計(jì)算的化合物Ⅰ的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1所示。結(jié)果表明，化合物I的二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)（kcat/Km）在101L·mol-1·min-1數(shù)量級(jí)，包括依布硒啉、二苯二硒等在內(nèi)的經(jīng)典小分子GPx 人工酶的二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)通常在10-2～10-3L·mol-1·min-1數(shù)量級(jí)[22-23,37]，即化合物I 的二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)相較于經(jīng)典小分子GPx 人工酶提高了2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。這是因?yàn)榻?jīng)典小分子GPx人工酶的催化中心通常是硒醚結(jié)構(gòu)，跟硒相比碲具有更強(qiáng)的氧化還原能力，在圖6所示催化循環(huán)中，碲醚更易被H2O2氧化形成碲醇從而開啟催化循環(huán)[31-32,38]。

表1 化合物Ⅰ的表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 The apparent kinetic parameters of compound Ⅰ

2.3 分子機(jī)器的組裝及其pH敏感性

2.3.1 分子機(jī)器的組裝 通過1H NMR 滴定實(shí)驗(yàn)測(cè)試化合物Ⅰ與CB[6]能否復(fù)合形成分子機(jī)器。在pH=6時(shí)，將CB[6]逐漸加入化合物Ⅰ的溶液中，H1和H2對(duì)應(yīng)的1H NMR 信號(hào)峰逐漸消失，隨后出現(xiàn)一組新峰，這組新峰的增長(zhǎng)是由于化合物I 的H1和H2被包埋在CB[6]的疏水空腔之中。隨著CB[6]加入量的加大，化合物I 中原有的H1和H2對(duì)應(yīng)的1H NMR 信號(hào)峰幾乎完全消失，H1和H2在1H NMR 譜中表現(xiàn)出不同程度的峰移動(dòng)（圖7）。其中，H1的化學(xué)位移從

圖7 化合物Ⅰ(5 mmol·L-1)在pH=6時(shí)與不同濃度CB[6]混合物的部分1H NMR譜圖Fig.7 Partial1H NMR spectra of mixtures of compound Ⅰ(5 mmol·L-1)with different amounts of CB[6]at pH=6 concentration of CB[6]/(mmol·L-1):a—5;b—3.75;c—2.5;d—1.25

2.83 移動(dòng)到1.98，H2的化學(xué)位移從3.32 移動(dòng)到3.07。烷基二胺分子被包埋于CB[6]的疏水空腔中時(shí)，限域疏水環(huán)境會(huì)使亞甲基中H 的化學(xué)位移降低?？拷杷涨欢丝诘膩喖谆蠬 的化學(xué)位移降低幅度較小，而深入疏水空腔內(nèi)部的亞甲基中H 的化學(xué)位移降低幅度較大[39]。圖7 中的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合，由此可以推斷在pH=6 時(shí)，化合物I 的兩個(gè)氨基均處于質(zhì)子化狀態(tài)，能夠與CB[6]形成穩(wěn)定的1∶1 復(fù)合物，從而組裝形成分子機(jī)器。根據(jù)1H NMR 數(shù)據(jù)計(jì)算出它們之間的結(jié)合常數(shù)為(4.62±0.24)×103L·mol-1。戊二胺分子含有5 個(gè)亞甲基，在尺寸上與CB[6]疏水空腔的匹配度最高，二者的結(jié)合常數(shù)高達(dá)2.40×106L·mol-1[40]。當(dāng)中間的碳原子被硫原子取代后，硫原子半徑較碳原子的大，與CB[6]疏水空腔的匹配度降低，因此H2N(CH2)2S(CH2)2NH2分子與CB[6]的結(jié)合常數(shù)下降了1 個(gè)數(shù)量級(jí)至4.2×105L·mol-1[40]。當(dāng)硫原子進(jìn)一步被同主族尺寸更大的硒原子取代后，與CB[6]疏水空腔的匹配度再次降低，根據(jù)文獻(xiàn)[23]報(bào)道，H2N(CH2)2Se(CH2)2NH2分子與CB[6]的結(jié)合常數(shù)下降1 個(gè)數(shù)量級(jí)至2.5×104L·mol-1。當(dāng)硒原子被同主族尺寸更大的碲原子取代后，與CB[6]疏水空腔的匹配度進(jìn)一步降低，因此化合物I 與CB[6]的結(jié)合常數(shù)進(jìn)一步下降1 個(gè)數(shù)量級(jí)。但是化合物I 與CB[6]的結(jié)合常數(shù)依然處于103L·mol-1數(shù)量級(jí)，足以保證與CB[6]形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

2.3.2 分子機(jī)器的pH 敏感性 隨著pH 的升高，化合物Ⅰ的兩個(gè)氨基逐漸由雙質(zhì)子化轉(zhuǎn)變?yōu)閱钨|(zhì)子化甚至是去質(zhì)子化，因而與CB[6]的結(jié)合能力也逐漸降低，分子機(jī)器會(huì)逐漸分解。通過1H NMR 滴定實(shí)驗(yàn)對(duì)分子機(jī)器的分解進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，隨著體系pH 的升高，分子機(jī)器形態(tài)的化合物Ⅰ的1H NMR 信號(hào)峰逐漸降低，隨后游離態(tài)化合物Ⅰ的峰增加，說明分子機(jī)器隨著pH 的升高逐漸分解（圖8）。分析1H NMR 譜中剩余分子機(jī)器和從分子機(jī)器中解離下來的H1和H2信號(hào)峰的積分比，得到pH 為7 和9時(shí)分別有約24%和65%的分子機(jī)器發(fā)生了分解。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物Ⅰ與CB[6]分子構(gòu)建的分子機(jī)器具有一定的pH 敏感性，可以利用pH 調(diào)控其形成與分解。

圖8 化合物Ⅰ(5 mmol·L-1)與CB[6](5 mmol·L-1)在不同pH下的部分1 H NMR 譜圖(500 MHz)Fig.8 Partial1H NMR spectra(500 MHz)of mixtures of compound Ⅰ(5 mmol·L-1)with CB[6](5 mmol·L-1)at different pH

2.4 智能GPx人工酶的構(gòu)建及其pH敏感性

2.4.1 分子機(jī)器的組裝對(duì)GPx 活性的影響 pH=6時(shí)，化合物Ⅰ與CB[6]分子能夠組裝形成分子機(jī)器，通過TNB 測(cè)試體系研究了分子機(jī)器的組裝過程對(duì)GPx 活性的影響。將化合物Ⅰ的濃度固定為4 μmol·L-1，分別將1、2、3 和4 μmol·L-1的CB[6]加入到體系之中。結(jié)果表明，隨著CB[6]加入量的增大，催化曲線的斜率逐漸減小，即GPx活性逐漸減?。▓D9）。當(dāng)加入1∶1 的CB[6]時(shí)，化合物Ⅰ與CB[6]分子完全組裝形成分子機(jī)器，此時(shí)幾乎無法展現(xiàn)GPx 活性[僅為(0.04±0.02)μmol·min-1·μmol-1]，相比未加入CB[6]時(shí)下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)。這是因?yàn)殡S著分子機(jī)器的組裝，單碲醚活性中心被包埋在CB[6]的空腔之中，無法接觸到溶液中的反應(yīng)物，從而無法展現(xiàn)其催化活性。

圖9 pH=6時(shí)4 μmol·L-1化合物Ⅰ與空白（a）,及濃度分別為4 μmol·L-1（b）、3 μmol·L-1（c）、2 μmol·L-1（d）、1 μmol·L-1（e）、0 μmol·L-1（f）的CB[6]混合物的催化曲線Fig.9 Catalytic curves of mixture of 4 μmol·L-1 compound Ⅰand blank(a),4 μmol·L-1(b),3 μmol·L-1(c),2 μmol·L-1(d),1 μmol·L-1(e),0 μmol·L-1(f)CB[6]at pH=6

2.4.2 不同pH 下分子機(jī)器的GPx 活性 化合物Ⅰ與CB[6]分子組裝形成分子機(jī)器后，通過TNB 體系測(cè)試了不同pH 下分子機(jī)器的催化曲線（圖10）。結(jié)果表明，當(dāng)pH=6 時(shí)，分子機(jī)器幾乎無法展現(xiàn)GPx 活性[圖10(a)]，這是因?yàn)榘被幱谫|(zhì)子化狀態(tài)，CB[6]與其結(jié)合能力較強(qiáng)，單碲醚活性中心被包埋在CB[6]的空腔之中。隨著體系pH 的升高，由于氨基的去質(zhì)子化，化合物Ⅰ與CB[6]分子的結(jié)合能力下降，分子機(jī)器逐漸分解。pH=7 時(shí)[圖10(b)]，隨著分子機(jī)器逐漸開始分解，單碲醚活性中心開始暴露于溶液底物之中，能夠展現(xiàn)出24%的GPx 活性[(0.35±0.06)μmol·min-1·μmol-1]。pH=8 時(shí)[圖10(c)]，分子機(jī)器進(jìn)一步分解，已經(jīng)能夠展現(xiàn)出40%的GPx 活性（0.26 μmol·min-1·μmol-1），雖然較pH=7 時(shí)展現(xiàn)出更高百分比的活性，但是活性的絕對(duì)值較pH=7 時(shí)稍低，這是因?yàn)榛衔铫竦淖钸mpH 為7，pH=8 時(shí)的活性較pH=7 時(shí)有明顯下降。pH=9 時(shí)[圖10(d)]，分子機(jī)器更進(jìn)一步分解，能夠展現(xiàn)出65%的GPx 活性（0.21 μmol·min-1·μmol-1），雖然展現(xiàn)出活性的百分比進(jìn)一步提高，但是由于pH=9 時(shí)化合物Ⅰ活性進(jìn)一步下降，導(dǎo)致活性的絕對(duì)值較pH=8時(shí)進(jìn)一步降低。

圖10 分子機(jī)器的催化曲線Fig.10 Catalytic curves of molecular machine

將不同pH 下分子機(jī)器催化活性的相對(duì)值與絕對(duì)值整理為柱狀圖示于圖11。由圖11可以看出，利用分子機(jī)器的形成與分解，人工酶的活性能夠可控地在pH=6 時(shí)關(guān)閉，在pH=7 時(shí)開啟。目前pH 敏感性GPx人工酶在可控開啟時(shí)展現(xiàn)出的活性僅能達(dá)到10-3μmol·min-1·μmol-1數(shù)量級(jí)[22-23]，而本文成功構(gòu)建了高活性的pH敏感性GPx人工酶，可控開啟時(shí)能夠展現(xiàn)出10-1μmol·min-1·μmol-1數(shù)量級(jí)的活性，較文獻(xiàn)報(bào)道中的活性提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文基于含碲醚催化中心的分子機(jī)器，構(gòu)建了高活性的pH敏感性GPx人工酶，且能夠在接近生命體內(nèi)pH 水平的范圍內(nèi)調(diào)控人工酶活性的關(guān)閉與開啟，為構(gòu)建pH敏感性GPx人工酶提供了新的方法和思路。

圖11 pH在6～9時(shí)分子機(jī)器催化活性的相對(duì)值(a)及分子機(jī)器催化活性的絕對(duì)值(b)Fig.11 Relative catalytic activities(a)and catalytic activities(b)of the molecular machine at a range of pH from 6 to 9

3 結(jié) 論

(1)設(shè)計(jì)并合成了含有單碲醚活性中心的乙胺單碲醚分子（化合物Ⅰ），測(cè)定了其GPx 催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)，推測(cè)出其催化機(jī)理為順序機(jī)制。

(2)利用1H NMR 證明了pH≤6 時(shí)乙胺單碲醚可以與CB[6]分子組裝形成分子機(jī)器，pH≥7時(shí)，分子機(jī)器會(huì)逐漸分解，其分解比例在pH 為7 和9 時(shí)分別為24%和65%。

(3)組裝形成分子機(jī)器后，乙胺單碲醚分子的活性中心被包埋在CB[6]的疏水空腔中，幾乎無法展現(xiàn)活性[（0.04±0.02）μmol·min-1·μmol-1]，升高pH 使得分子機(jī)器部分分解后，活性中心被釋放到溶液之中，能 夠 展 現(xiàn) 部 分 活 性[（0.35±0.06）μmol·min-1·μmol-1]。通過調(diào)控分子機(jī)器在pH為6和7之間的形成與分解，可以調(diào)控人工酶的關(guān)閉與開啟，從而成功構(gòu)建了pH敏感性GPx人工酶。

(4)大幅提高了pH 敏感性GPx 人工酶可控開啟時(shí)展現(xiàn)出的活性，拓展了GPx人工酶的潛在應(yīng)用，并且為構(gòu)建pH敏感性人工酶提供了新的思路。

符 號(hào) 說 明