金霉素分子印跡電化學傳感器的制備與應用

韓雙，張楠，王慧，張璇，楊金欒，張蔓琳，張志超

（沈陽化工大學理學院，遼寧 沈陽 110142）

引 言

金霉素（CTC）是一種四環(huán)素類抗生素，可以保護動物及促進其生長或預防動物的寄生蟲、細菌感染，曾作為獸藥被廣泛添加到動物飼料中[1-8]。然而，大多數(shù)動物不能完全代謝CTC,部分CTC殘留在動物體內(nèi)或通過動物尿液和糞便被排出體外。這給自然環(huán)境和人類健康造成嚴重的不良影響[9-10]。雖然一些國家和地區(qū)已經(jīng)通過立法規(guī)范了CTC 的使用，但仍需要一種可靠、高效、簡單的方法來檢測食品和環(huán)境中的CTC殘留。

目前已有多種方法和技術(shù)來測定CTC，包括高效液相色譜-熒光檢測法[11-13]、高效液相色譜-紫外可見光譜檢測法[11]、高效液相色譜-化學發(fā)光檢測法[14]、液相色譜-質(zhì)譜檢測法[15-19]、液相色譜-二極管陣列檢測法[20-23]、液相色譜-電化學檢測法[24]、毛細管電泳法或毛細管電色譜-紫外可見光譜檢測法[25-26]、流動注射-安培檢測法[27]，以及熒光方法等[8,28]。雖然這些方法的檢出限較低，但它們通常需要大型儀器和復雜操作，對樣品的處理和對結(jié)果的分析需要很好的知識技能。鑒于電分析方法具有儀器小型、操作簡單、靈敏度高、成本低廉等優(yōu)點，研究人員設計了檢測CTC 的電化學傳感器，如氧化釕-氰化釕修飾玻碳電極(GCE)[24]、陽極化硼摻雜金剛石薄膜電極[27]、核殼結(jié)構(gòu)碳球@二氧化錳修飾GCE[29]、滴汞電極[30]等。但電化學傳感器對CTC 的選擇性檢測結(jié)果不是很令人滿意。

分子印跡技術(shù)對模板分子的形狀、大小和官能團的記憶具有高度的選擇性與親和性[31-33]。合成分子印跡聚合物(MIPs)的方法有電聚合[34-35]、自組裝[36-37]、化學接枝[38-39]和光化學聚合等[40]。電化學分子印跡傳感器中分子印跡膜的構(gòu)建主要采用電聚合方法[41]。為了提高電化學傳感器的靈敏度，具有高電子遷移率和大比表面積的石墨烯及其復合材料被廣泛應用于電化學傳感器[42-46]。Atar 等[47]在還原型氧化石墨烯-金屬氧酸鹽-Pt 納米粒子復合材料修飾電極上，利用吡咯為功能單體，電聚合制備了桔青霉素分子印跡電化學傳感器。Yola 等[48]制備了Ag 納米粒子-2-氨基乙烷硫醇氧化石墨烯修飾電極，利用苯酚為功能單體，開發(fā)了酪氨酸分子印跡電化學傳感器。

本研究將構(gòu)建一種電化學分子印跡傳感器用于CTC 的檢測。以CTC 為模板分子，將鄰苯二胺電聚合在還原型氧化石墨烯-聚乙烯亞胺復合物(RGO-PEI)修飾的GCE 上，后將聚鄰苯二胺薄膜修飾電極浸入乙醇中洗脫除去模板分子CTC (圖1)。含有大量富電子氨基的支化PEI將通過共價鍵或物理吸附作用附著在氧化石墨烯上形成RGO-PEI 復合材料[49]。由于RGO-PEI 具有良好的電導率、高比表面積和富含電子的氨基，為聚鄰苯二胺分子印跡膜的穩(wěn)定性提供了強有力的平臺，提高了檢測CTC的靈敏度，將能快速高效地實現(xiàn)樣品中CTC 含量的測定。

圖1 CTC分子印跡電化學傳感器的構(gòu)建過程（鄰苯二胺電聚合反應式和RGO-PEI反應式）Fig.1 Schematic representation of the fabrication procedures of the CTC MIP sensor

1 實驗材料和方法

1.1 材料

石墨粉(質(zhì)量分數(shù)為99%)購自Sigma-Aldrich 公司。聚乙烯亞胺(PEI，30%，樹枝狀，MW70000)購自阿法埃莎。鹽酸金霉素(CTC)、鹽酸多西環(huán)素(DOC)和鹽酸土霉素(OTC)購自阿拉丁實業(yè)有限公司。卡那霉素(Kana)購自西亞試劑公司。鄰苯二胺(o-PD)、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和氯化鉀購自國藥化學試劑有限公司。醋酸和無水醋酸鈉購自天津博迪化工有限公司。所有試劑均為分析純。利用磷酸、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制磷酸鹽緩沖溶液。利用醋酸和無水醋酸鈉配制醋酸鹽緩沖溶液。所有溶液均用二次蒸餾水配制。

1.2 儀器

CHI660E 電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）。三電極系統(tǒng)：工作電極為玻碳電極（GCE，直徑5 mm），對電極為鉑片電極，參比電極為飽和甘汞電極。紅外光譜，NEXUS 470 紅外光譜儀(美國)；紫外可見光譜，UV-2550 分光光度計(日本島津公司)；掃描電子顯微鏡，XL-30 ESEM FEG(FEI COMPANYS,USA)；能 量 色 散X 射 線 光 譜 儀(EDX)，Oxfordinstruments X-Max(UK)。

1.3 RGO-PEI的制備

根據(jù)文獻[50]方法合成了高純度的氧化石墨烯(GO)。為了合成RGO-PEI復合物，將1 ml 30%(質(zhì)量分數(shù))的PEI 水溶液與2 ml 水混合。向20 ml 水中加入2 mg GO，超聲混合30 min，得到均勻的黃褐色GO 溶液。將稀釋后的PEI溶液1 ml與上述GO 溶液混合，室溫下超聲30 min。然后在95℃下加熱攪拌2 h，離心，保留下層固體，干燥，得到RGO-PEI 復合物。

1.4 RGO-PEI復合物修飾電極的制備

先后用1.00、0.30、0.05 μm 氧化鋁粉末將GCE拋光至鏡面，分別在乙醇和水中超聲清洗電極，氮氣吹干。用移液槍移取10 μl 1 mg/ml RGO-PEI 溶液滴加在上述GCE 表面，室溫下晾干，得到RGOPEI復合物修飾電極(GCE/RGO-PEI)。

1.5 分子印跡傳感器和非分子印跡傳感器的制備

在GCE/RGO-PEI 表面電聚合分子印跡單體o-PD，生成聚鄰苯二胺(PPD)。具體做法如下：在含有5.0 mmol/Lo-PD 和1.0 mmol/L CTC 的醋酸鹽緩沖液(pH 4.8)中，以0.05 V/s的掃描速率，在0～0.8 V之間循環(huán)伏安掃描30 圈，制備分子印跡傳感器MIP GCE/RGO-PEI/PPD。電聚合后，MIP GCE/RGOPEI/PPD 在乙醇中浸泡10 min，從MIP 膜上洗脫除去CTC。

在不含有CTC 的5.0 mmol/Lo-PD 溶液中，相同電聚合條件下，制備非分子印跡傳感器NMIP GCE/RGO-PEI/PPD。

1.6 CTC的檢測

將洗脫后的MIP GCE/RGO-PEI/PPD 在不同濃度的CTC 標準溶液中吸附10 min，取出電極并沖洗干凈，將電極浸入5.0 mmol/L K3Fe(CN)6/0.1 mol/L KCl 的探針溶液中進行循環(huán)伏安掃描，掃描速率為0.05 V/s。掃描結(jié)束后，該電極在乙醇中洗脫10 min以去除CTC，此后重復使用。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 GO和RGO-PEI的表征

2.1.1 SEM 表征 圖2 顯示了GO 和RGO-PEI 的SEM 圖像?？梢钥闯觯珿O 在結(jié)構(gòu)上是分層的。RGO-PEI 在結(jié)構(gòu)上也是分層的，片層上存在一些微小的顆粒，可能是附著的PEI。RGO-PEI 的EDX 光譜表明，在0.39 keV處存在對應于N元素的Kα峰，這正是PEI的氨基對應的N元素。

圖2 GO和RGO-PEI的SEM圖像及RGO-PEI的EDX圖像Fig.2 SEM images of GO and RGO-PEI and EDX image of RGO-PEI

2.1.2 紅外吸收光譜表征 圖3 為GO 和RGO-PEI的紅外吸收光譜圖。GO 具有高度的親水性，在3415 cm-1附近出現(xiàn)一個GO 醇羥基O—H 伸縮振動峰。GO 與PEI 反應后，3415 cm-1附近的峰值明顯減弱，說明GO 被PEI 部分還原，PEI 分子覆蓋在還原后生成的RGO 表面。對于GO 來說，1721 cm-1、1374 cm-1和1165 cm-1處的幾個吸收帶可以分別歸屬于羧酸（或羰基）的C O 伸縮振動、羧酸的O—H變形振動和環(huán)氧基的C—O 伸縮振動[51-52]。GO 與PEI 反應后，1721 cm-1處的特征帶幾乎完全消失，同時1374 cm-1（O—H）和1165 cm-1（C—O）處的兩個峰明顯減弱。GO 中1622 cm-1的強帶與未氧化的石墨骨架振動有關，它被1650 cm-1的強帶所取代，該強帶證明了酰胺的形成[50,53]。此外，RGO-PEI 出現(xiàn)了一個1561 cm-1的新帶（C—N 拉伸振動），證明了PEI與GO 形成共價鍵。紅外光譜的這些變化證實了PEI 存在于RGO 表面，其中一些是通過酰胺鍵與RGO表面共價連接的。

圖3 GO和RGO-PEI的紅外吸收光譜圖Fig.3 FTIR spectra of GO and RGO-PEI

2.1.3 紫外可見吸收光譜表征 如圖4 所示，GO 在231 nm處有一個特征吸收峰，為芳香族C C的π→π*躍遷；300 nm 處有一個弱的吸收峰，為C O 的n→π*躍遷。而RGO-PEI 的特征吸收峰則紅移到260 nm。這表明GO 被PEI 還原和共軛結(jié)構(gòu)的恢復[54-55]，與紅外的結(jié)果一致。

圖4 GO和RGO-PEI的紫外可見吸收光譜圖Fig.4 UV-Vis spectra of GO and RGO-PEI

2.2 在GCE/RGO-PEI 上電聚合o-PD 形成PPD薄膜

在含有CTC 模板劑和不含CTC 的條件下，采取o-PD 單體電聚合方法在pH4.8 的醋酸鹽緩沖溶液中分別制備了PPD 薄膜（圖5）。由于o-PD 的電氧化具有完全不可逆性，其氧化峰電流隨著循環(huán)伏安掃描圈數(shù)的增加而減少，表明電極表面形成了不良導電性的PPD 薄膜,即成功制備了MIP GCE/PEIRGO/PPD 傳感電極。當掃描圈數(shù)接近30 圈時，o-PD氧化峰電流幾乎消失。研究表明，在不含CTC模板分子的情況下得到的循環(huán)伏安曲線與含有CTC模板分子的情況下的電聚合過程相似。

圖5 5.0 mmol/L o-PD在GCE/RGO-PEI修飾電極表面電聚合的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammograms for the electropolymerization of 5.0 mmol/L o-PD on GCE/RGO-PEI in the presence(a)and in the absence(b)of CTC in pH4.8 acetate buffer(scan rate:0.050 V/s)

2.3 MIP GCE/PEI-RGO/PPD 的電化學表征

圖6 顯示了不同電極在5.0 mmol/L K3Fe(CN)6/0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安曲線。在GCE上觀察到一對明顯的K3[Fe(CN)6]可逆氧化還原峰(圖6a)。當RGO-PEI 被修飾在GCE 表面后，由于RGO-PEI具有良好的導電性和較大的比表面積，K3[Fe(CN)6]的氧化還原峰電流增加(圖6b)。然而，在o-PD 電聚合到GCE/RGO-PEI 電極表面后，K3[Fe(CN)6]的氧化還原峰完全消失了(圖6c），表明通過電聚合形成了PPD 薄膜，這種薄膜阻止了K3[Fe(CN)6]擴散到電極表面，阻礙了K3[Fe(CN)6]與電極表面的電子轉(zhuǎn)移。然而，在乙醇溶液中清洗MIP GCE/RGO-PEI/PPD后，K3[Fe(CN)6]峰電流強度增加了(圖6d），說明PPD薄膜中的模板分子CTC 被成功去除，形成了多孔薄膜，有利于K3[Fe(CN)6]的擴散和隨后與底層電極的電子轉(zhuǎn)移。研究表明，將洗脫后的MIP GCE/RGOPEI/PPD 浸入CTC 溶液中，K3[Fe(CN)6]峰電流信號下降(圖6e）。這是因為CTC 進入PPD MIP 薄膜中的空穴位置，阻礙了K3[Fe(CN)6]與電極表面的電子轉(zhuǎn)移從而導致K3[Fe(CN)6]峰電流下降。

圖6 不同電極在5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl中的循環(huán)伏安圖Fig.6 Cyclic voltammograms of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl on the bare GCE(a),GCE/RGO-PEI(b),GCE/RGO-

同時，研究了掃描速率對MIP GCE/RGO-PEI/PPD 的影響。如圖7 所示，隨著掃描速率從0.050 V/s 增大到0.50 V/s，K3[Fe(CN)6]的峰電流也隨之增加。如圖8所示，K3[Fe(CN)6]的峰電流與掃描速率成線性關系，線性回歸方程表示為I= - 292.38ν- 68.38（R=0.9981），表明這是一種典型的表面控制電化學行為。然而，K3[Fe(CN)6]的峰電位隨著掃描速率的增大而發(fā)生負向或正向移動。因此，在隨后的實驗中選擇0.050 V/s作為后續(xù)研究的掃描速率。

圖7 不同掃描速率下MIP GCE/RGO-PEI/PPD 在5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl中的循環(huán)伏安圖Fig.7 Cyclic voltammograms of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl on the MIP GCE/RGO-PEI/PPD at different scan rates

圖8 不同掃描速率與K3[Fe(CN)6]在MIP GCE/RGO-PEI/PPD上峰電流的關系曲線Fig.8 Relationship between the scan rate and peak currents

2.4 實驗條件優(yōu)化

2.4.1 電聚合圈數(shù)優(yōu)化 在制備MIP GCE/RGOPEI/PPD 的過程中，電聚合o-PD 循環(huán)伏安掃描圈數(shù)影響了電化學傳感器的靈敏度。為了獲得最優(yōu)電聚合掃描圈數(shù)，以不同的循環(huán)伏安掃描圈數(shù)制作電極。如圖9所示，響應電流比值在30個圈數(shù)時達到最小。進一步增加掃描圈數(shù)會導致過厚的PPD膜，影響電子轉(zhuǎn)移。因此，30 被選為后續(xù)電聚合的最佳圈數(shù)。

圖9 電聚合圈數(shù)的優(yōu)化Fig.9 Effect of the electropolymerization cycles on the peak

2.4.2 pH 優(yōu)化 磷酸鹽緩沖液的pH 對該傳感器檢測CTC有顯著影響。為了優(yōu)化pH，將該傳感器置于一系列pH 從4.0 到10.0 的磷酸鹽緩沖液中進行測試。如圖10所示，傳感器對CTC 的響應電流比值隨著pH 的增加而顯著增大，pH8.0 時達到最大，然后從pH8.0 到10.0 略有下降。這可能是由于在較低pH 時，CTC 和PPD 薄膜的氨基被酸化，導致它們之間靜電排斥，從而產(chǎn)生較小的電流響應。在pH8.0時，CTC和PPD薄膜酸化強度減弱，這使靜電排斥力降到最低，導致了大的電流響應。因此，在隨后的實驗中選擇了緩沖溶液pH 為8.0。

圖10 pH的優(yōu)化Fig.10 Effect of pH on the peak current of CV response in the presence of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl(ΔI=I0-I)

2.4.3 洗脫時間優(yōu)化 為了獲得理想的靈敏度、選擇性和重現(xiàn)性，完全洗脫模板是非常重要的。圖11顯示了洗脫時間和響應電流比值之間的關系。響應電流比值隨著洗脫時間的延長而增加，并在洗脫時間超過10 min 后逐漸接近一個穩(wěn)定狀態(tài)。為了獲得更高的洗脫效率，選擇10 min 作為洗脫模板分子CTC的最佳時間。

圖11 洗脫時間的優(yōu)化Fig.11 Effect of elution time on the peak current of CV response in the presence of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl(I′is the current of the GCE/RGO-PEI/PPD after electropolymerization)

2.4.4 吸附時間優(yōu)化 CTC的吸附時間也是該傳感器檢測的一個重要參數(shù)。將模板分子CTC 從PPD薄膜上洗脫之后，將MIP GCE/RGO-PEI/PPD 浸泡在待測CTC 溶液中吸附0 ～ 10 min。如圖12 所示，隨著吸附時間的延長，探針分子K3[Fe(CN)6]在MIP GCE/RGO-PEI/PPD 上的峰電流比值急劇下降，10 min 后趨于平穩(wěn)。這表明PPD 薄膜對CTC 分子的快速識別能力和高親和力。因此，選擇10 min 作為測定CTC的最佳吸附時間。

圖12 吸附時間的優(yōu)化Fig.12 Effect of incubation time on the peak current of CV response in the presence of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl

2.5 MIP GCE/RGO-PEI/PPD 檢 測CTC 過 程分析

在優(yōu)化條件下，洗脫后的MIP GCE/RGO-PEI/PPD在不同濃度CTC標準溶液中進行了吸附。如圖13所示，在0～100.0 μmol/L范圍內(nèi)，I隨著CTC濃度的增加而減小。圖14 顯示了ΔI與CTC 濃度的線性關系。這里，ΔI=I0-Ic，I0和Ic分別是CTC 濃度為0和c(μmol/L)時的電流。CTC 的線性回歸方程為ΔI=-9.32853-0.24939c（c的單位是μmol/L），回歸系 數(shù)（R）為0.99609。 CTC 的 檢 測 限 為0.167 μmol/L。

圖13 MIP GCE/RGO-PEI/PPD 在不同濃度CTC標準溶液中的線性掃描伏安圖Fig.13 Linear sweep voltammograms of 5.0 mmol/L

圖14 MIP GCE/RGO-PEI/PPD 檢測CTC的標準曲線Fig.14 Linear calibration curve of ΔI with CTC concentrations

為了評估該分子印跡傳感器對CTC 的選擇性檢測和對其他抗生素的抗干擾能力，測試MIP GCE/RGO-PEI/PPD 對CTC、Kana、OTC 和DOC 存在下的響應。如圖15所示，100.0 μmol/L Kana、100.0 μmol/L OTC 和100.0 μmol/L DOC 對25 μmol/L CTC 的測定影響不大。表明該傳感器對CTC 具有較好的選擇性，可以實現(xiàn)對CTC的特異性識別。

圖15 MIP GCE/RGO-PEI/PPD 對其他抗生素的抗干擾能力檢驗Fig.15 The the current change of MIP GCE/RGO-PEI/PPD in the presence of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl after incubation in 25.0 μmol/L CTC,25.0 μmol/L CTC+100.0 μmol/L kanamycin,25.0 μmol/L CTC+100.0 μmol/L DOC,25.0 μmol/L CTC+100.0 μmol/L OTC(ΔI0=I0-ICTC;ΔI=I0-ICTC+others)

在最優(yōu)條件下，取一支MIP GCE/RGO-PEI/PPD電極對100.0 μmol/L CTC 溶液測定6 次，電流響應的標準偏差(RSD)約為2.78%。取8 支MIP GCE/RGO-PEI/PPD 電極檢測100.0 μmol/L CTC 溶液，結(jié)果顯示RSD 約為2.52%。這說明該印跡傳感器具有較好的重復使用性和制備重現(xiàn)性。

2.6 實際樣品檢測

為檢驗分子印跡傳感器在實際樣品中的應用，對湖水進行了CTC 加標回收實驗。取湖水樣品，過濾，用0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液調(diào)至pH8.0。用該湖水分別配制濃度為10.0 μmol/L 和50.0 μmol/L CTC 溶液進行實驗。如表1 所示，實驗得到的回收率為102.7% ～ 104.7%，RSD 為1.22% ～ 2.49%。實驗表明，該分子印跡電化學傳感器對實際樣品中CTC的檢測是可行的。

表1 湖水樣品中CTC的回收實驗Table 1 Recoveries for CTC detection in lake samples

3 結(jié) 論

提出了利用分子印跡電化學方法對CTC 進行高靈敏和選擇性檢測。電極最初由RGO-PEI 復合材料修飾，使電極具有良好的導電性、高表面積和豐富的氨基基團。隨后，在模板分子CTC 存在下，通過電聚合在修飾電極上形成分子印跡聚合物PPD薄膜，制備了選擇性檢測CTC 的分子印跡電化學傳感器。所制備的傳感器對CTC 的檢測具有很好的線性范圍，對其他抗生素有很強的抗干擾能力，重現(xiàn)性好，能夠?qū)崿F(xiàn)對實際樣品的高靈敏高選擇性檢測。