基于PI3K/AKT 信號(hào)通路探討表兒茶素對(duì)口腔癌細(xì)胞的作用

謝明杰，陳穗保

（廣東省第二人民醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510317）

口腔癌（oral cancer）是一種世界范圍內(nèi)的高發(fā)病率癌癥，死亡率較高[1-3]。隨著咀嚼檳榔、飲酒和吸煙的人群逐漸增多，口腔癌在多個(gè)國家的發(fā)病率和死亡率逐年增加[4，5]。因此，通過開發(fā)更有效的治療方法來治愈口腔癌至關(guān)重要。抗癌藥物與放療聯(lián)合是治療口腔癌的常見策略[6，7]。然而，這種聯(lián)合治療通常會(huì)對(duì)正常組織產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，患者依從性和預(yù)后較差。表兒茶素（Epicatechin）作為茶多酚中主要的活性單體，藥理作用廣泛，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、預(yù)防心血管疾病、改善糖尿病和免疫調(diào)節(jié)等作用[8-10]。研究表明[11]，PI3K/AKT 信號(hào)通路對(duì)口腔癌細(xì)胞增殖、侵襲、抑制凋亡和血管生成均起著重要作用。本研究旨在通過PI3K/AKT 信號(hào)通路探討表兒茶素對(duì)口腔癌細(xì)胞的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 藥物與試劑 表兒茶素，純度＞98%，批號(hào)：SE8100，購于上海脈鉑醫(yī)藥科技有限公司；TNF-α和IL-1β ELISA 試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；人口腔癌KB 細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫；CCK-8 購于上海碧云天生物技術(shù)公司；RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購于美國gibco公司；PI3K 和AKT 單抗和GAPDH 二抗購于英國Abcam 公司。

1.2 主要儀器 DYCZ-24DN 迷你雙垂直電泳儀電泳槽蛋白凝膠電泳儀、WD-9413A 凝膠成像分析系統(tǒng)和WD-9402D 型梯度PCR 儀購于北京六一儀器廠；二氧化碳培養(yǎng)箱購于Thermo Fisher Scientific 公司；SKSW-KC-100 型酶標(biāo)儀購于北京海富達(dá)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 37 ℃孵育復(fù)蘇人口腔癌KB 細(xì)胞后，使用1%雙抗RMPI-1640 培養(yǎng)液（含10%FBS），于5% CO2和37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞增殖抑制率（CCK-8 法）選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人口腔癌KB 細(xì)胞，采用0.25%胰酶-EDTA 消化貼壁細(xì)胞，新鮮完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)、1000 rpm離心5 min，稀釋為1×104個(gè)細(xì)胞，100 μl/孔接種于96 孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h，分別加入濃度為20、40、80、160 nmol/L 的表兒茶素處理，0 nmol/L 為空白對(duì)照組，每組設(shè)定6 個(gè)復(fù)孔。放回細(xì)胞培養(yǎng)箱分別再培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入10 μl的CCK8 試劑并放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，在450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔OD 值，分析各組細(xì)胞的增殖抑制率。其中，增殖抑制率（%）=[1－OD（λ）藥物處理組/OD（λ）空白對(duì)照組]×100%

1.3.3 細(xì)胞TNF-α 和IL-1β 水平（ELISA 法）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人口腔癌KB 細(xì)胞，稀釋成1×105個(gè)后，1 ml/孔接種于24 孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入表兒茶素處理，其終濃度分別為20、40、80、160 nmol/L，0 nmol/L 為空白對(duì)照組，每組設(shè)定6 個(gè)重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞上清，按試劑盒說明書操作步驟，檢測(cè)細(xì)胞上清TNF-α 和IL-1β 水平。

1.3.4 細(xì)胞Bax 和Bcl-2 基因表達(dá)水平（RT-PCR法）按1.3.3 方法處理細(xì)胞后，PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞3 次，提取細(xì)胞總RNA，使用PCR 儀檢測(cè)Bax 和Bcl-2 基因的表達(dá)水平。Bax 和Bcl-2 的引物序列見表1。

表1 Bax 和Bcl-2 的引物序列

1.3.5 細(xì)胞PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)水平（Western blot法）按1.3.3 方法處理細(xì)胞后，裂解細(xì)胞和檢測(cè)細(xì)胞蛋白。配制電泳凝膠（12%分離膠和5%濃縮膠），每孔30 μg/孔上樣，SDS-PAGE 電泳分離（120 V）、轉(zhuǎn)膜（80 V）、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入PI3K（1∶1000）和AKT（1∶1000）一抗4 ℃冰箱孵育過夜。洗膜5 次后，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜5 次，專用儀器自動(dòng)曝光。分析圖像的灰度值（Image J 軟件）。目的蛋白表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t法，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組增殖抑制率比較 表兒茶素處理組24、48、72 h 增殖抑制率高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L表兒茶素組24、48、72 h 增殖抑制率均高于20 nmol/L表兒茶素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 表兒茶素對(duì)人口腔癌KB 細(xì)胞的增殖抑制率的影響

2.2 各組TNF-α 和IL-1β 水平比較 表兒茶素處理組TNF-α 和IL-1β 水平低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組TNF-α 和IL-1β 水平低于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 表兒茶素對(duì)人口腔癌KB 細(xì)胞TNF-α 和IL-1β 水平的影響

2.3 各組Bcl-2 和Bax mRNA 表達(dá)比較 表兒茶素處理組Bcl-2 mRNA 表達(dá)量低于空白對(duì)照組，而Bax mRNA 表達(dá)量高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組Bcl-2 mRNA 表達(dá)量低于20 nmol/L 表兒茶素組，而Bax mRNA 表達(dá)量高于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 表兒茶素對(duì)人口腔癌KB 細(xì)胞Bcl-2 和Bax mRNA 表達(dá)的影響

2.4 各組PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)比較 表兒茶素處理組PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)水平低于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 表兒茶素對(duì)人口腔癌KB 細(xì)胞PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

口腔癌是世界上最常見癌癥之一，其5 年生存率較低，不超過50%[12]?？谇话┑闹委煱ㄊ中g(shù)、放療、化療和靶向治療等。最常用的化療藥物有5-氟尿嘧啶、卡鉑、順鉑和紫杉醇[13]。然而，耐藥性和副作用大仍然是化療的重要障礙。因此，開發(fā)更有效以及更安全的抗口腔癌藥物極為重要。

腫瘤細(xì)胞一般呈現(xiàn)出增殖和分化異常的基本特征，如控制腫瘤細(xì)胞增殖和分化可作為初步判斷藥物有效性的依據(jù)之一[14]。本研究結(jié)果顯示，表兒茶素處理組24、48、72 h 增殖抑制率高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組24、48、72 h 增殖抑制率均高于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示表兒茶素可明顯抑制人口腔癌KB細(xì)胞的增殖，呈濃度和時(shí)間依賴性。多種炎癥因子與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究顯示[15，16]，高水平的TNF-α 可明顯促進(jìn)腫瘤惡化，而IL-1β 參與了腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，表兒茶素處理組TNF-α 和IL-1β 水平低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組TNF-α 和IL-1β 水平低于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明表兒茶素可降低人口腔癌KB 細(xì)胞TNF-α 和IL-1β 的水平，提示表兒茶素可能通過抑制炎癥，進(jìn)而抑制口腔癌細(xì)胞的過度增殖。此外，促進(jìn)異常細(xì)胞的凋亡也是抗癌的重要策略，而線粒體凋亡途徑是細(xì)胞重要的凋亡途徑，Bcl-2 和Bax 是線粒體凋亡途徑中重要的調(diào)控因子[17]。本研究結(jié)果表明，表兒茶素處理組Bcl-2 mRNA 表達(dá)量低于空白對(duì)照組，而Bax mRNA 表達(dá)量高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組Bcl-2 mRNA 表達(dá)量低于20 nmol/L 表兒茶素組，而Bax mRNA 表達(dá)量高于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明表兒茶素上調(diào)人口腔癌KB 細(xì)胞Bax mRNA 的表達(dá)水平，而下調(diào)Bcl-2 mRNA 的表達(dá)水平，呈濃度依賴性，提示表兒茶素可能通過影響線粒體凋亡途徑，促進(jìn)人口腔癌KB 細(xì)胞的凋亡。研究顯示[18-20]，PI3K/AKT 信號(hào)通路參與調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、分化和侵襲等。本研究結(jié)果表明，表兒茶素處理組PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)水平低于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示表兒茶素通過抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路PI3K 和AKT 蛋白的表達(dá)水平，從而抑制人口腔癌KB 細(xì)胞的過度增殖。

綜上所述，表兒茶素可抑制人口腔癌KB 細(xì)胞的過度增殖，促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)。