微滴式數(shù)字PCR定量檢測(cè)雞毒支原體方法的建立

謝志勤，謝芝勛，張艷芳，范 晴，謝麗基，萬(wàn)麗軍，羅思思，李 孟，張民秀，曾婷婷，黃嬌玲，王 盛，李 丹，韋 悠，李小鳳，任紅玉，阮志華

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）主要侵害雞，引起不同日齡、不同品種雞發(fā)生慢性呼吸道病，輕者咳嗽、流鼻液，重者竇部腫脹、呼吸困難。MG 對(duì)雛雞危害極大，除可導(dǎo)致呼吸道疾病外，還可引起雛雞生長(zhǎng)遲緩，發(fā)育不全，淘汰率非常高。MG 可引起蛋雞產(chǎn)蛋減少[1-2]。種雞感染MG 后可在體內(nèi)長(zhǎng)期帶有病原。MG 一旦感染雞群就很難被徹底清除[3-4]，可在雞群中長(zhǎng)期存在并可擴(kuò)散至其他雞群，極易繼發(fā)或并發(fā)大腸桿菌、傳染性支氣管炎病毒等病原體感染，導(dǎo)致雞群死亡，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。

雞MG 感染很普遍，正呈世界性流行態(tài)勢(shì)。MG 引發(fā)的癥狀與其他病原如H9N2 亞型禽流感病毒、雞新城疫病毒引起的癥狀很相似，臨床上很難區(qū)分，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行診斷。常用的實(shí)驗(yàn)室鑒別MG 方法有病原分離鑒定[7]、PCR 方法[8]、熒光定量PCR 方法[9-10]、LAMP 方法[11]等。但這些方法都或多或少存在不足，不能滿足低拷貝數(shù)MG，如MG 感染早期的定量檢測(cè)需求。例如：病原分離鑒定方法雖準(zhǔn)確，但操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；普通PCR 方法檢測(cè)不夠靈敏，且需要電泳；熒光定量PCR 方法能進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，檢測(cè)MG 的靈敏度達(dá)100 拷貝/μL，但每次檢測(cè)結(jié)果會(huì)因熒光定量PCR 內(nèi)參的穩(wěn)定性及擴(kuò)增Ct 值的變化而變化；LAMP 方法雖敏感，但操作中易受污染，假陽(yáng)性較多。目前缺乏絕對(duì)定量檢測(cè)MG 的方法，需要建立一種更敏感的絕對(duì)定量檢測(cè)方法，特別是針低拷貝數(shù)樣品，如MG 早期感染的絕對(duì)定量檢測(cè)，這對(duì)準(zhǔn)確診斷防控MG 感染有重要意義。

微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近幾年發(fā)展應(yīng)用起來(lái)的一種新技術(shù)，其將反應(yīng)液通過(guò)油包水方式、分為數(shù)萬(wàn)個(gè)獨(dú)立的納米反應(yīng)微滴，根據(jù)每個(gè)反應(yīng)微滴信號(hào)統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性拷貝數(shù)。目前該技術(shù)在很多領(lǐng)域包括動(dòng)物疫病病原檢測(cè)方面已有成功應(yīng)用，證明其在動(dòng)物疫病病原檢測(cè)方面敏感性好，能實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量檢測(cè)[12-13]。目前還沒有建立ddPCR 檢測(cè)MG 方法的報(bào)道。本研究以MGmgpc基因?yàn)榘谢?，建立ddPCR 定量檢測(cè)MG 方法，旨在為更加準(zhǔn)確定量檢測(cè)MG 提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病原及臨床樣品

MG 株（MG S6、MG K2221、MG A5969）、雞滑液囊支原體（MS）K1415 株、禽衣阿華支原體（MI）K-1805 株、禽腦脊髓炎病毒（AEV）Van 株，由美國(guó)康涅狄格洲州立大學(xué)Khan Mazhar I.教授惠贈(zèng)；禽偏肺炎病毒（APV）MN-10 株，由美國(guó)濱夕法尼亞州立大學(xué)Lu Huagang 教授惠贈(zèng)；雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）Mass 41 株、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）BJ 株、雞新城疫病毒（NDV）LaSota 株、禽呼腸孤病毒（ARV）S1133株、H9N2 亞型禽流感病毒（H9N2 AIV）066C 株，由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室鑒定保存；雞白痢沙門氏菌（SP）C79-13 株和雞大腸桿菌（E.coli）O2 株，購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌株保藏管理中心；60 份病雞喉拭子、氣囊拭子及肺樣品，于2021 年1—12 月從廣西7 個(gè)雞場(chǎng)采集并保存于-80 ℃。

1.2 主要試劑及儀器

Supermix for Probe ddPCR（No dUTP，貨號(hào)1863024）、Droplet generation oil for Probes ddPCR（貨號(hào)1863005）、Droplet Reader Oil（貨號(hào)1863004）、DG8 Cartridges（貨號(hào)1863008）、DG8 Gaskets（貨號(hào)1863009）、Pierceable Foil Heat Seal（貨號(hào)1814040），購(gòu)自美國(guó)Bio-rad 公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit（貨號(hào)N20527），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒、Premix ExTaq試劑盒、100 bp DNA Ladder、pMD18-T 載體、大腸桿菌DH5α、T4 連接試劑盒、凝膠回收試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；微滴生成儀（QX200 Droplet generator）、熱封儀（PX1）、微滴數(shù)字讀取儀（QX200 Droplet Reader）、梯度PCR 擴(kuò)增儀（T-100），購(gòu)自美國(guó)Bio-rad 公司；熒光PCR 儀（quantStudio 5）、分光光度計(jì)（Nanodrop 2000），購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已發(fā)表的MGmgpc基因（No.JX869132.1）序列，利用在線https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/軟件，設(shè)計(jì)ddPCR 特異性引物和探針，并在線進(jìn)行BLAST 分析。在探針序列5'端添加FAM 熒光基團(tuán)，3'端添加BHQ1 淬滅基團(tuán)。引物及探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并經(jīng)HPLC 純化。所設(shè)計(jì)的引物和探針序列見表1。

表1 所用的引物和探針序列

1.4 病原核酸提取

按EasyPure Viral DNA/RNA Kit 說(shuō)明書提取1.1 中的病毒株DNA/RNA，按TIANamp Bacteria DNA Kit 說(shuō)明書提取MG S6、MG K2221、MG A5969 以及MS、MI、ILTV、SP 及E.coli等菌株的DNA，提取的DNA/RNA 直接用于擴(kuò)增或于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板構(gòu)建與鑒定

提取MG S6 總DNA 后作為模板，用引物MG F/MG R 擴(kuò)增后，克隆至與pMD18-T 載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-MG，經(jīng)PCR 鑒定后由寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒DNA用分光光度儀測(cè)定D260nm/D280nm值，并按公式計(jì)算拷貝數(shù)?？截悢?shù)=（濃度×阿伏加德羅常數(shù)）/（1 個(gè)堿基對(duì)的平均相對(duì)分子質(zhì)量×總長(zhǎng)度）。

1.6 ddPCR 反應(yīng)體系建立及條件優(yōu)化

20 μL 反應(yīng)體系：2×Supermix 10 μL，5～40 μmol/μL 的 MG F/MG R 各 1 μL，2.5～40.0 μmol/μL MG Pro 1 μL，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板2 μL，加滅菌 ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。微滴生成：在DG8 Cartridges 的第二排孔分別加入上述反應(yīng)液20 μL，第三排孔每孔加入droplet generation oil 70 μL，蓋上DG8 Gaskets，置微滴生成儀上自動(dòng)生成微滴于第一排孔。封膜：吸取生成的微滴至96 孔板內(nèi)，加鋁膜Pierceable Foil Heat Seal 置PX1熱封儀上，程序設(shè)置為180 ℃ 10 s 進(jìn)行封膜。PCR擴(kuò)增：封膜的96 孔板放入PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)計(jì)反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火溫度設(shè)置50～60 ℃ 1 min（2 ℃/s），共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束。數(shù)據(jù)讀取及分析：反應(yīng)結(jié)束后，將96 孔板置QX200 Droplet Reader上讀取信號(hào)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 ddPCR 特異性測(cè)定

提取NDV、H9N2 AIV、IBV、ARV、AEV、APV 的總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，提取MG S6、MG K2221、MG A5969 以及MS、MI、ILTV、SP 及E.coli的DNA 分別作為模板，按照優(yōu)化的ddPCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估該方法的特異性。

1.8 ddPCR 靈敏度測(cè)定

測(cè)定重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度并進(jìn)行10 倍倍比稀釋（10-4～10-11）后作為模板，按照優(yōu)化的ddPCR方法檢測(cè)，評(píng)估該ddPCR 方法的敏感性。同時(shí)采用熒光定量PCR 方法，用同樣的引物探針，對(duì)相同質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行平行檢測(cè)，比較兩種方法的靈敏度。同時(shí)取5 個(gè)稀釋度進(jìn)行4 次平行試驗(yàn)，分析ddPCR 檢測(cè)的線性區(qū)間。

1.9 ddPCR 重復(fù)性測(cè)定

取10-5～10-73 個(gè)連續(xù)稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行3 次ddPCR 擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)計(jì)算3 次反應(yīng)結(jié)果的變異系數(shù)來(lái)驗(yàn)證ddPCR 的重復(fù)性。

科學(xué)技術(shù)是經(jīng)濟(jì)發(fā)展的第一生產(chǎn)力，也是推動(dòng)實(shí)現(xiàn)全面持續(xù)發(fā)展的必然要求，人才是發(fā)展科學(xué)技術(shù)不可或缺的部分，因此必須注重對(duì)人才的培養(yǎng)，尤其是對(duì)企業(yè)內(nèi)部高層管理人員素質(zhì)的培養(yǎng)，通過(guò)這種方法使得企業(yè)能夠在面對(duì)各種情況時(shí)更好地決策，更好地發(fā)揮產(chǎn)業(yè)園區(qū)的內(nèi)部?jī)?yōu)勢(shì)，為企業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展做出貢獻(xiàn)，從而促進(jìn)當(dāng)?shù)氐漠a(chǎn)業(yè)發(fā)展，推動(dòng)經(jīng)濟(jì)向著更加合理、穩(wěn)定、高效的方向發(fā)展。

1.10 臨床樣品檢測(cè)

取約5 g 肺樣品，按質(zhì)量比1:8 加入無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液研磨，在喉及氣囊拭子中，分別加入2 mL 無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液混勻，-70 ℃反復(fù)凍融3 次，4 000 r/min 離心5 min，取上清，14 000 r/min 離心10 min，棄上清，按TIANamp Bacteria DNA Kit 說(shuō)明書步驟提取沉淀中的總DNA。用建立的ddPCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用文獻(xiàn)[10]中的熒光定量PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法檢測(cè)效果的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品鑒定

挑取重組質(zhì)粒pMD18-MG 進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果擴(kuò)增出大小約198 bp 的明亮條帶；送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序，用MegAlign 軟件將測(cè)定的序列與MGmgpc基因（No.JX869132.1）序列進(jìn)行Clustal W Method 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)測(cè)定的序列與MGmgpc基因100%同源，序列正確；用分光光度儀測(cè)定的重組質(zhì)粒pMD18-MG 標(biāo)準(zhǔn)品D260nm/D280nm值為1.90，按公式計(jì)算的拷貝濃度為1.35×1010拷貝/μL。

2.2 ddPCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

ddPCR 反應(yīng)中，對(duì)不同引物濃度和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)MG F/MG R 引物濃度和MG Pro 濃度分別為20 和10 μmol/μL 時(shí)，即MG F 和MG R終濃度為1 μmol/μL，MG Pro 為0.5 μmol/μL 時(shí)，陽(yáng)性微滴信號(hào)高，陽(yáng)性微滴與陰性微滴之間的熒光信號(hào)區(qū)分明顯，此時(shí)的引物、探針濃度為最佳反應(yīng)濃度。用最佳引物濃度和探針濃度，退火溫度設(shè)50、51、52、54、55、56、58、60 ℃共8 個(gè)不同梯度，對(duì)相同模板濃度進(jìn)行ddPCR 反應(yīng)擴(kuò)增，結(jié)果退火溫度為55 ℃時(shí)，陽(yáng)性微滴信號(hào)（顯示為藍(lán)色）和陰性微滴信號(hào)（顯示為黑色）之間的熒光信號(hào)區(qū)分明顯，擴(kuò)增獲得的陽(yáng)性微滴數(shù)最高，此時(shí)的退火溫度55 ℃即為最佳退火溫度。

2.3 優(yōu)化后的ddPCR 反應(yīng)體系及程序

20 μL 反應(yīng)體系：2×Supermix for probe（No dUTP）10 μL，20 μmol/μLMG F/MG R 引物各1 μL，10 μmol/μLMG Pro 1 μL，DNA/RNA 模板2 μL，用 ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，設(shè)置退火溫度55 ℃1 min（2 ℃/s），40 個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束。

2.4 ddPCR 反應(yīng)特異性測(cè)試

將NDV、H9N2 AIV、IBV、ARV、AEV、APV 的總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后與MG S6、MG K2221、MG A5969 以 及MS、MI、ILTV、SP 及E.coli的DNA 一起分別加入已優(yōu)化好的ddPCR 反應(yīng)體系中進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示，每孔擴(kuò)增總微滴的生成量均達(dá)1 萬(wàn)以上，且較均衡，說(shuō)明微滴擴(kuò)增反應(yīng)成立。出現(xiàn)陽(yáng)性微滴的病原有MG S6、K2221、A5969，其他病原無(wú)陽(yáng)性微滴出現(xiàn)，與MG 株也沒有出現(xiàn)交叉反應(yīng)（圖1），表明該方法的特異性強(qiáng)。

2.5 ddPCR 靈敏度測(cè)定

取10-4～10-11稀釋的pMD18-MG 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品各2 μL 作為模板，分別按照優(yōu)化的ddPCR 和熒光定量PCR 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，ddPCR 對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)限為3.9 拷貝/μL（10-8稀釋，圖2-A），而熒光定量PCR 只檢測(cè)到10-7稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（40.6 拷貝/μL，圖2-B），10-8稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品沒有被檢出。用5 個(gè)連續(xù)稀釋的MG重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及檢測(cè)陽(yáng)性拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，繪制ddPCR 絕對(duì)定量曲線，結(jié)果為線性。線性方程為y=-1.007x+8.63，斜率為-1.007，R2為0.999（圖3）。

2.6 ddPCR 重復(fù)性測(cè)定

表2 ddPCR 重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

2.7 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)60 份病雞喉拭子、氣囊拭子及肺樣品進(jìn)行檢測(cè)，ddPCR 檢測(cè)結(jié)果為MG 陽(yáng)性9 份，分別為喉拭子樣品2 份、氣囊拭子樣品6 份及肺樣品1 份，樣品中檢出的MG 拷貝數(shù)濃度為12.2～972.0 拷貝/μL，陽(yáng)性檢出率為15.0%（9/60）；熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果為MG 陽(yáng)性8 份，分別為喉拭子樣品2 份及氣囊拭子樣品6 份，陽(yáng)性檢出率為13.3%（8/60）。從檢測(cè)結(jié)果看出，ddPCR 檢出率高于熒光定量PCR。部分樣品檢測(cè)結(jié)果見圖4 和表3。

表3 60 份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 單位：份

3 討論

雞MG 感染較為普遍，感染率高，難以清除。準(zhǔn)確診斷是防控MG 感染的重要手段。目前在眾多的檢測(cè)診斷方法中，沒有一種方法能及時(shí)準(zhǔn)確對(duì)MG 早期感染進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)。本ddPCR 檢測(cè)方法的建立，實(shí)現(xiàn)了對(duì)低拷貝數(shù)MG，如MG 早期感染的準(zhǔn)確絕對(duì)定量檢測(cè)。經(jīng)特異性檢測(cè)驗(yàn)證，本方法只檢出MG，沒有檢出其他常見禽病病原，也沒有發(fā)生交叉反應(yīng)，說(shuō)明本方法具有很好的特異性。

dPCR 方法雖然是在熒光定量PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的，但這兩種檢測(cè)方法有所不同。ddPCR方法是通過(guò)直接計(jì)算反應(yīng)的微滴數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)拷貝數(shù)的絕對(duì)定量檢測(cè)，受擴(kuò)增效率影響較小[11]，可直接讀取結(jié)果且結(jié)果直觀準(zhǔn)確；而熒光定量PCR 需要通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增的Ct 值來(lái)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，常因檢測(cè)的內(nèi)參穩(wěn)定性及Ct 值變化而影響結(jié)果。在敏感性檢測(cè)方面，已有報(bào)道認(rèn)為ddPCR方法比熒光定量PCR 方法敏感，如劉洋等[14]建立的ddPCR 檢測(cè)方法比熒光定量PCR 方法靈敏度高10 倍。本研究建立的方法經(jīng)靈敏度檢測(cè)，證明檢測(cè)限為3.9 拷貝/μL 的MG 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板，而熒光定量PCR 方法只檢測(cè)到40.6 拷貝/μL。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了ddPCR 檢測(cè)方法比熒光定量PCR 方法靈敏度高10 倍。由此表明，本研究建立的方法靈敏度，可實(shí)現(xiàn)個(gè)位拷貝數(shù)的絕對(duì)定量檢測(cè)，這將有助于對(duì)低拷貝數(shù)MG 的定量檢測(cè)。

用本研究建立的方法，對(duì)采集的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用ddPCR 方法檢出MG 陽(yáng)性9 份，陽(yáng)性檢出率為15%，熒光定量PCR 方法檢出MG 陽(yáng)性8 份，拷貝數(shù)濃度為12.2 拷貝/μL 的樣品沒有檢出，陽(yáng)性檢出率為13%。從檢測(cè)樣品的結(jié)果分析，ddPCR 方法的陽(yáng)性檢出率高于熒光定量PCR 方法，而且ddPCR 方法可以直接顯示檢測(cè)出的拷貝數(shù)，結(jié)果直觀準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)了對(duì)低拷貝數(shù)MG 或需要絕對(duì)定量樣品的檢測(cè)，為定量檢測(cè)MG 提供了更加準(zhǔn)確的方法。

目前ddPCR 技術(shù)在各領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，在動(dòng)物疫病檢測(cè)方面也發(fā)揮了重要作用[15-16]。目前制約國(guó)內(nèi)ddPCR 技術(shù)廣泛應(yīng)用的主要問(wèn)題是儀器設(shè)備需要進(jìn)口，試劑昂貴，且操作步驟復(fù)雜，要求高。相信不久的將來(lái)，會(huì)實(shí)現(xiàn)儀器及試劑的國(guó)產(chǎn)化，這樣ddPCR 技術(shù)將隨著檢測(cè)成本的大幅降低而得到更廣泛應(yīng)用。