對蝦急性肝胰腺壞死病病原菌RAA 檢測方法的建立

陳平亞，吳山楠，何翠華，張亮亮，吳少榮，王綏家，吳毓浪

（?？诤ｊP(guān)技術(shù)中心，海南海口 570311）

對蝦急性肝胰腺壞死?。╝cute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）是由攜帶毒力質(zhì)?；【鷮?dǎo)致的水產(chǎn)病害，2010 年首次發(fā)現(xiàn)于我國和越南境內(nèi)，隨后相繼出現(xiàn)于馬來西亞、泰國、墨西哥和菲律賓等國，曾在我國南方地區(qū)的對蝦養(yǎng)殖場大面積暴發(fā)[1]。斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）均可患病。通常在放苗后7～35 d 內(nèi)大規(guī)模發(fā)病，死亡率高達100%。患病對蝦肝胰腺萎縮且表面出現(xiàn)黑色斑點和條紋，甲殼變軟，尾扇及附肢變?yōu)榈{色，空腸、空胃或腸道內(nèi)食物不連續(xù)，在肝胰腺、腮、腸道、肌肉等組織中均能檢測到病原[2]。

AHPND 最初由副溶血弧菌的特定毒力株（VpAHPND）引起。與普通的副溶血弧菌基因相比，該類菌株攜帶了數(shù)個69 kb 的毒力編碼質(zhì)粒pVA1。該質(zhì)粒攜帶的致病基因能編碼PirA、PirB毒素蛋白，而PirB 毒素決定菌株致病力，PirA 相對較弱[3]。有研究[4]將含pirA和pirB基因的pVA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到非致病的弧菌中，證實該弧菌也能夠引起AHPND，而自然缺失pirA和pirB基因的VpAHPND突變菌株不能導(dǎo)致對蝦患病。敲除Pir 毒素基因后，致病菌失去致病力，而基因回補后，可再次獲得致病力[5]，因此推斷Pir 毒素是AHPND 的主要致病因子。根據(jù)目前的報道[6]，弧菌屬中的歐文氏弧菌（V.owensii）、哈維氏弧菌（V.harveyi）和坎貝氏弧菌（V.cambellii）均可攜帶pVA1 質(zhì)粒，并引起對蝦患AHPND。因此，根據(jù)pVA1 質(zhì)粒中pirB基因設(shè)計探針和引物，對VpAHPND進行檢測具有特異性。

重組酶介導(dǎo)等溫擴增（recombinase acid amplification，RAA）是利用重組酶以及DNA 聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白（SSB）進行恒溫核酸擴增的技術(shù)，不需要熱循環(huán)過程。首先引物與重組酶結(jié)合形成復(fù)合體，在SSB 的參與下，在與引物同源的序列處使雙鏈DNA 解旋，SSB 防止單鏈DNA 復(fù)性，模板DNA 解鏈并使引物與模板配對，然后在DNA聚合酶的作用下，完成鏈的延伸，整個反應(yīng)可在35 min 內(nèi)完成。重組酶在常溫下就能打開DNA 雙鏈，若在熒光RAA 反應(yīng)體系中加入熒光探針，即可實現(xiàn)熒光信號的實時監(jiān)測，使檢測結(jié)果可視化。此外，RAA 技術(shù)還能夠完成多重實時擴增，在同一個反應(yīng)體系里檢測多個目的基因[7]。

本研究針對pVA1 質(zhì)粒pirB基因設(shè)計特異性引物和探針，建立了快速、靈敏的熒光RAA 檢測方法，并應(yīng)用于對蝦組織器官樣本中AHPND 病原菌檢測，以期為AHPND 病原菌的快速檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株包括VpAHPNDHK190423 株、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、大腸埃希氏菌（Escherichia colt）、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）、傷寒沙門氏菌（Salmonella enteritidis）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、河流弧菌（Vibrio fluvialis）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus），由海口海關(guān)技術(shù)中心動物實驗室分離保存。

1.1.2 對蝦樣品 從?？谑?、文昌市及周邊對蝦養(yǎng)殖場采集樣品，包括42 份凡納濱對蝦、36 份斑節(jié)對蝦和48 份中國明對蝦。

1.1.3 主要試劑 引物及探針，由上海生工公司合成；熒光型核酸擴增試劑（RAA 法），購自杭州眾測生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器 ZB-32-1 實時熒光恒溫檢測儀，購自南寧壯博生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1pirB基因特異性引物、探針設(shè)計 從GenBank 上獲得pirB基因序列，應(yīng)用Primer 6.0 軟件設(shè)計引物和探針。引物 pirB F：5'-CGAGCATTACCAATCTATTGAGT-3'；pirB R：5'-ACAACAAATGTTCGATCATCTG-3'。探針：5'-CGCTTACATTAAATATGTTGATGTTATTGCCAA（FAM-dT）GG（THF）CC（BHQ1-dT）GAAGCAATTGATCG-3'（其中FAM 為熒光報告基團，THF 為四氫呋喃殘基，BHQ1 為熒光淬滅基團，序列3'端加上C3 spacer 修飾）。引物和探針，由上海生工公司合成。

1.2.2 熒光PCR 擴增 PCR 擴增使用水產(chǎn)行業(yè)標準《急性肝胰腺壞死病診斷規(guī)程》（SC/T 7233—2020）推薦引物和方法。引物F：5'-TTGGACTGTCGAACCAAACG-3'；R：5'-CGACCCCATTGGTATTGAATG-3'。TaqMan探針：5'-FAM-AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGATAMRA-3'。熒光PCR 反應(yīng)體系（25.0 μL）：Probe qPCR Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.75 μL，探針（10 μmol/L）0.25 μL，模板（100 ng/μL）1.0 μL，用滅菌水補足至25.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s、60℃30 s，45 個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號。

1.2.3pirB基因質(zhì)粒載體構(gòu)建 采用 Primer 6.0引物設(shè)計軟件，設(shè)計帶酶切位點的特異性引物。F：5'-CGGGATCCATGACTAACGAATACGTTGTAAC-3'（劃線部分為BamHI 酶切位點）；R：5'-CCGCTCGAGCTACTTTTCTGTACCAAATTCATCG-3'（劃線部分為XhoI 酶切位點）。以VpAHPNDHK190423 株DNA 為模板進行PCR 擴增。反應(yīng)體系（25.0 μL）：2×PremixTaq12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃30 s，72 ℃15 s，40 個循環(huán)；72 ℃ 3 min。將含有目的基因的PCR 擴增產(chǎn)物和pMD18-T 質(zhì)粒載體，同時用限制性內(nèi)切酶XhoI 和BamHI 酶切，再用T4 連接酶連接到pMD18-T 質(zhì)粒載體中連接成重組質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α 中，涂在含氨芐青霉素鈉的LB 瓊脂平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h 后挑單菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基中，置搖床震蕩培養(yǎng)16 h，經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒回收、純化后測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒作為陽性對照。按照重組質(zhì)?？截悵舛扔嬎愎?，拷貝濃度（copies/μL）=質(zhì)粒質(zhì)量濃度（g/μL）×6.02×1023/質(zhì)粒相對分子質(zhì)量，質(zhì)粒相對分子質(zhì)量=堿基對的平均相對分子質(zhì)量（660）×重組質(zhì)?？倝A基對數(shù)（3 864），測得拷貝濃度為8.2×107copies/μL。將其進行10 倍梯度稀釋，即8.2×（107～101）copies/μL，以此為模板分別進行RAA 擴增和PCR 擴增，檢測熒光信號。

1.2.4pirB基因?qū)崟r熒光RAA 反應(yīng)條件 以8.2×107copies/μL 克隆質(zhì)粒為模板，參照商品化熒光RAA 試劑盒說明書，建立VpAHPND的RAA檢測體系。反應(yīng)體系為50.0 μL：加入A 緩沖液（PEG35000 水溶液）40.9 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，探 針（10 μmol/L）0.6 μL，B 緩沖液（乙酸鎂水溶液）2.5 μL，DNA 模板2.0 μL。配置好反應(yīng)體系后，蓋上管蓋，充分混勻，低速離心后迅速將反應(yīng)管放置于恒溫擴增儀中反應(yīng)。

1.2.5 熒光RAA 靈敏度、特異性、重復(fù)性試驗對已知拷貝濃度的PMD18-pirB 重組質(zhì)粒載體進行10 倍梯度稀釋，以各梯度濃度質(zhì)粒為模板進行熒光RAA 方法檢測，確定該方法對pirB基因的最低檢出限；以VpAHPND-HK190423 株、糞腸球菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、福氏志賀氏菌、阪崎腸桿菌、溶藻弧菌、傷寒沙門氏菌、創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌等作為對照菌株，用去離子水作為空白對照，采用SC/T 7233—2020 推薦的熒光探針PCR 檢測法作為平行對照，驗證熒光RAA 法檢測pirB基因的特異性；取8.2×103copies/μL 濃度的pMD18-T-pirB 重組質(zhì)粒進行熒光RAA 試驗，設(shè)計8 次組內(nèi)重復(fù)，測Ct 值并計算其平均值和標準差（S）及其變異系數(shù)（CV），以變異系數(shù)（標準偏差/重復(fù)值的平均數(shù)）評估該方法的重復(fù)性。

1.3 模擬樣品熒光RAA 檢測方法的應(yīng)用

對蝦感染試驗采用浸泡感染，空白對照組使用滅菌海水浸泡對蝦樣品。將菌株VpAHPNDHK190423 株接種至胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基中 100 r/min、28 ℃搖菌培養(yǎng)12 h；將培養(yǎng)好的菌液5 000 r/min 離心5 min，收集沉淀，用滅菌海水重懸。取42 份凡納濱對蝦、36 份斑節(jié)對蝦和48 份中國明對蝦樣品，采用菌株VpAHPNDHK190423 株菌懸液進行浸泡感染，浸泡感染24 h后換滅菌海水養(yǎng)殖。對瀕死對蝦肝胰腺組織進行取樣，每種對蝦分別取0.5 g 肝胰腺組織于1.5 mL 離心管中，加入0.5 mL 滅菌生理鹽水研磨勻漿，提取總DNA 作為模板。用建立的熒光RAA 檢測方法和SC/T 7233—2020 推薦的熒光探針PCR 法同時進行檢測，并對檢測結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果

2.1 克隆載體構(gòu)建

以提取的VpAHPND菌株DNA 為模板，將經(jīng)PCR擴增獲得的目的基因片段用瓊脂糖凝膠電泳，獲得pirB基因條帶；回收純化目的基因片段和pMD18-T 質(zhì)粒載體后，用T4 連接酶連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α 中，涂板培養(yǎng)24 h；挑選陽性菌落搖瓶培養(yǎng)，收集菌體后，提取重組質(zhì)粒pMD18-T-pirB，同時用限制性內(nèi)切酶BamHI 和XohI 進行酶切后電泳，結(jié)果出現(xiàn)1 條約1 200 bp 的目的片段和1 條約2 700 bp 的克隆載體片段，說明陽性質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 熒光RAA 靈敏度

用去離子水將拷貝濃度為8.2×107copies/μL的pMD18-T-pirB 質(zhì)粒作10 倍系列稀釋，用稀釋后的模板進行熒光RAA 檢測，以確定該方法最低檢出限。結(jié)果（圖1）顯示，在8.2×101copies/μL質(zhì)粒濃度時，仍出現(xiàn)擴增曲線，表明該檢測方法至少能檢測到8.2×101copies/μL，達到了SC/T 7233—2020 推薦的熒光PCR 法檢測靈敏度。

2.3 熒光RAA 特異性

用建立的熒光RAA 檢測方法對VpAHPNDHK190423 株、單核細胞增生李斯特菌等病原菌進行檢測，結(jié)果只有VpAHPND-HK190423 株出現(xiàn)了擴增曲線，而單核細胞增生李斯特菌等其他對照菌株和空白對照沒有出現(xiàn)擴增曲線（圖2），說明熒光RAA 法對VpAHPND的檢測具有特異性，檢測結(jié)果與SC/T 7233—2020 推薦的熒光PCR 法檢測結(jié)果一致。

2.4 熒光RAA 重復(fù)性

對樣品進行重復(fù)性試驗，選取8.2×103copies/μL濃度的pMD18-T-pirB 克隆質(zhì)粒進行8 次重復(fù)的熒光RAA 試驗及熒光PCR 檢測。結(jié)果（圖3）顯示：熒光RAA 試驗變異系數(shù)是0.41%，表明重復(fù)性良好，穩(wěn)定性強；而SC/T 7233—2020 推薦的熒光PCR 法變異系數(shù)是0.51%，重復(fù)性略低于熒光RAA 方法。

2.5 人工感染樣品檢測

應(yīng)用建立的熒光RAA 方法對采集到的3 種對蝦樣品進行菌懸液浸泡感染后做熒光RAA 檢測，共檢出陽性樣本35 份，且陽性樣本對蝦具有AHPND 臨床癥狀和組織病理學(xué)特征。將熒光RAA 擴增結(jié)果為陽性的對蝦肝胰腺組織加入到含3%氯化鈉的堿性蛋白胨水液體培養(yǎng)基中，37 ℃增菌培養(yǎng)6 h，按照GB 4789.7—2013 方法進行劃線分離及生化鑒定，確定檢出的陽性樣品感染了VpAHPND。SC/T 7233—2020 推薦的熒光PCR 方法與熒光RAA 方法檢測3 種對蝦的檢測結(jié)果符合率為100%，說明該方法檢測對蝦臨床樣本具有很高可靠性。

3 討論

近年來，研究證明非副溶血弧菌也可以引起對蝦患AHPND。2015 年Kondo 等[8]分離出可致病的攜帶pVA1 質(zhì)粒的歐文氏弧菌，并證實這株歐文氏弧菌能導(dǎo)致養(yǎng)殖對蝦患AHPND；2017年，Dong 等[9]從發(fā)病對蝦中分離到1 株可表達毒力蛋白PirAB 的坎貝氏弧菌，其能夠?qū)е聦ξr患AHPND；2018 年，Restrepo 等[10]分離出可引起AHPND 的浦那弧菌，該菌也攜帶有pVA1 質(zhì)粒。pVA1 致病質(zhì)?？梢栽诜N間通過接合平行傳播，也可在垂直方向穩(wěn)定遺傳給子代細胞，并可在子代中永久遺傳[11]。AHPND 致病菌可以是攜帶pVA1 質(zhì)粒的副溶血弧菌，也有可能是攜帶pVA1 質(zhì)粒的坎貝氏弧菌、歐文氏弧菌、浦那弧菌等病原菌，因此應(yīng)該用建立的RAA 檢測方法對攜帶pVA1 質(zhì)粒的坎貝氏弧菌、歐文氏弧菌、浦那弧菌也進行檢測驗證，但因缺少這幾種試驗菌株，未進行相關(guān)試驗，待以后補充。

試驗過程中，取病蝦肝胰腺組織在含3%氯化鈉的堿性蛋白胨水液體培養(yǎng)基中增菌，再提取DNA 進行熒光RAA 擴增結(jié)果呈弱陽性，而直接取病蝦肝胰腺組織提取DNA 進行熒光RAA 擴增結(jié)果曲線正常。這可能是因為增菌過程中肝胰腺組織中的VpAHPND在傳代中PVA1 質(zhì)粒丟失所致。

目前已有多種核酸檢測方法應(yīng)用于AHPND檢測，例如PCR 擴增方法及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）。常規(guī)PCR、熒光定量PCR 和巢式PCR 擴增等方法對儀器和環(huán)境要求較高，且檢測時間較長，難以在基層推廣應(yīng)用。LAMP 作為一種核酸等溫擴增技術(shù)，其反應(yīng)靈敏度高于PCR 檢測方法，且熒光染料法可以直接通過肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果，但LAMP 反應(yīng)產(chǎn)物是一些序列長度不等的片段，不能進行測序驗證，只能用于判斷是否有擴增條帶[12]。當(dāng)然，RAA 檢測方法也存在不足之處，其擴增體系中存在大量蛋白酶，應(yīng)用電泳分析結(jié)果前須純化去除蛋白質(zhì)[13]。熒光RAA 方法與LAMP法相比所需時間更短，無需昂貴的PCR 儀器，只需要一臺能收集熒光信號的恒溫裝置，且靈敏度與熒光PCR 相當(dāng)，同時還能完成多重擴增[14]，可使用恒溫?zé)晒鈾z測系統(tǒng)，也可結(jié)合測流試紙條法檢測，具有廣闊的應(yīng)用前景。

綜上，本試驗根據(jù)質(zhì)粒pVA1 中pirB基因序列設(shè)計探針和引物，建立的對蝦AHPND 病原菌熒光RAA 擴增檢測方法，靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好、操作步驟簡單，可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中對蝦樣品AHPND 的檢測。