基因VI 型新城疫病毒反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

王靜靜，舒 波，2，于曉慧，克軍宏，3，邢安琪，4，彭真奇，5，劉華雷

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西南昌 330045；3.塔里木大學(xué)，新疆阿拉爾 843300；4.寧夏大學(xué)，寧夏銀川 750021；5.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥 230036）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）強(qiáng)毒株感染引起的，可危害多種禽類的烈性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將ND 列為法定報告動物疫病，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為二類動物疫病。雞、鴿等易感禽類感染NDV 后，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)100%[1-2]。NDV 基因組全長有15 198、15192 和15 186 nt 3 種長度，共包含6 個基因片段，3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，其中F基因和HN基因是主要的毒力決定基因[3]。NDV 可分為Class I 和Class II 兩類，其中強(qiáng)毒株均屬于Class II[4]。國家新城疫參考實驗室監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，我國目前流行的強(qiáng)毒株主要是Class II 的基因VI 型和VII 型，其中鴿源基因VI 型NDV 近年分離率明顯升高[5-6]。

通過接種雞胚進(jìn)行病毒分離和RT-PCR 測序鑒定是確診ND 的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7-8]，然而這些方法對生物安全要求高，步驟繁瑣，耗費時間長，成本較高，不能做出快速診斷。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字PCR（dPCR）被廣泛應(yīng)用于多種動物病原的精準(zhǔn)檢測[9-11]。dPCR 是先對模板進(jìn)行預(yù)處理，將其稀釋分配到許多個獨立的單元，每個單元有1 個目標(biāo)序列的PCR 微反應(yīng)區(qū)，PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，通過采集熒光信號進(jìn)行量化（陽性記作1，陰性記作0），再引入泊松概率分布函數(shù)進(jìn)行計算，從而得到樣本的初始拷貝數(shù)，對樣本進(jìn)行絕對定量[12-13]。該方法靈敏度極高，可檢測到樣本中低拷貝數(shù)的核酸，且大大節(jié)約了檢測時間和檢測成本，在動物疫病檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景[14]。本研究利用dPCR 技術(shù)平臺，針對基因VI 型NDVF基因保守區(qū)設(shè)計引物和探針，建立了一種快速、有效、靈敏度高的RT-dPCR 檢測方法，以期為在鴿群中開展基因VI 型NDV 快速檢測和研制診斷用核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 基因VI 型、VII 型、XII 型NDV，H5、H7、H9 亞型禽流感病毒（AIV），雞傳染性支氣管炎病毒（IBV），雞傳染性喉氣管炎病毒（AILTV），禽腺病毒（FAdV）等常見禽病病原，均由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測室保存。

1.1.2 臨床樣品 180 份鴿口咽/泄殖腔拭子，由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心2021 年從國內(nèi)部分地區(qū)活禽市場采集。

1.1.3 試劑盒 核酸提取試劑盒（High Pure Viral Nucleic Acid Kit），購自Roche 公司；RT-PCR 試劑盒（Primescript One Step RT-PCR Kit Ver.2），購自TaKaRa 公司；熒光RT-PCR 試劑盒（SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit），購自Invitrogen 公司；一步法反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR 反應(yīng)預(yù)混液（RT-dPCR Kit），購自蘇州思納福醫(yī)療科技有限公司。

1.1.4 雞胚 9～11 日齡SPF 雞胚，購自山東濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 引物、探針設(shè)計與篩選

從GenBank 上下載NDVF基因序列，采用MEGA 6 進(jìn)行序列比對分析，選取保守區(qū)域設(shè)計3套特異性引物和探針（表1），并通過熒光RT-PCR和RT-dPCR 方法篩選出最佳引物探針組合。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 RT-dPCR 引物和探針

1.3 病毒核酸提取

按照核酸提取試劑盒說明書提取病毒核酸，立即用于RT-dPCR 擴(kuò)增，或置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-dPCR 反應(yīng)

反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)程序：50 ℃，15 min；95 ℃，3min；95℃ 30 s，58 ℃ 60 s，42 個循環(huán)。升降溫速率2 ℃/s。

表2 RT-dPCR 反應(yīng)體系

1.5 靈敏度試驗

將基因VI 型NDV 核酸進(jìn)行10 倍倍比稀釋，分別取100、10-1、10-2、10-3、10-4稀釋度樣品進(jìn)行RT-dPCR 檢測，每個濃度做3 次重復(fù)檢測，評價方法的靈敏度。

1.6 特異性試驗

提取基因VI 型、VII 型、XII 型NDV，H5、H7、H9 亞型AIV，IBV，AILTV，F(xiàn)AdV 病毒核酸，使用RT-dPCR 方法進(jìn)行檢測，驗證方法的特異性。

1.7 重復(fù)性試驗

用建立的RT-dPCR 方法對基因VI 型NDV 核酸進(jìn)行檢測，重復(fù)測定6 次，計算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，評價方法的重復(fù)性。

1.8 臨床樣品檢測

用建立的RT-dPCR 方法對臨床采集的180 份鴿口咽/泄殖腔拭子樣品進(jìn)行檢測，并與病毒分離方法檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 引物探針篩選

用設(shè)計的3 組引物探針組合對基因VI 型NDV核酸進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果（表3）顯示，第3 組引物探針擴(kuò)增Ct 值略低于前兩組。用設(shè)計的3 組引物探針進(jìn)行RT-dPCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，3組引物探針均可有效擴(kuò)增，故最終選擇第3 組引物探針用于RT-dPCR 方法建立。

表3 3 組引物探針組合熒光RT-PCR 擴(kuò)增Ct 值

2.2 靈敏度試驗

將基因VI 型NDV 核酸進(jìn)行10 倍倍比稀釋（100～10-4）后進(jìn)行RT-dPCR 檢測，每個濃度做3 次重復(fù)，獲得梯度稀釋擴(kuò)增圖（圖1）和標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.021x-0.132（圖2），R2=0.993。結(jié)果說明，本方法具有較高擴(kuò)增效率，且在1.97×100～1.30×104copies/μL 的檢測范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低檢測限為1.97 copies/μL。

2.3 特異性試驗

用建立的RT-dPCR 方法檢測基因VI 型、VII型、XII 型NDV，H5、H7、H9 亞型AIV，IBV，AILTV，F(xiàn)AdV 等9 種病毒核酸，僅有基因VI型NDV 檢測結(jié)果為陽性，其余病毒檢測結(jié)果均為陰性（圖3）。

2.4 重復(fù)性試驗

取同1 份基因VI 型NDV 核酸樣品，經(jīng)RTdPCR 重復(fù)測定6 次。結(jié)果（表4）顯示，變異系數(shù)為2.2%，表明本方法重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

用建立的RT-dPCR 方法對臨床采集的180 份鴿口咽/泄殖腔拭子樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出陽性樣品14 份，同時對180 份樣品進(jìn)行病毒分離鑒定（雞胚接種、RT-PCR 擴(kuò)增和測序、序列分析），結(jié)果顯示14 份陽性樣品均為基因VI 型NDV。RT-dPCR檢測結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果完全一致，符合率為100%，說明本研究建立的RT-dPCR 方法可信度高，可用于臨床樣品中基因VI型NDV的檢測。

3 討論

基因VI 型NDV 是引發(fā)鴿ND 的主要病原，嚴(yán)重危害我國鴿業(yè)健康發(fā)展。自20 世紀(jì)80 年代鴿ND 傳入我國以來，一直在我國鴿群中流行和傳播[15-16]。ND 與禽流感、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎等禽類呼吸道疾病在鑒別診斷上難以區(qū)分，甚至一些APMV-13 和APMV-7 等副黏病毒也能與NDV 發(fā)生HI 交叉反應(yīng)[15-16]，因此快速鑒定NDV 對于養(yǎng)禽業(yè)意義重大[17]。ND 的早期診斷主要通過血清學(xué)方法，如血凝抑制試驗、病毒中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫組化法（IHC）等[18]，這些檢測技術(shù)雖然能檢測NDV 但是不能判斷其基因型和病毒毒力，而且有些毒株無法被ELISA 等技術(shù)檢測到[19]。RT-PCR、熒光RTPCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）等分子生物學(xué)方法是目前應(yīng)用最廣泛的方法[20]。RT-PCR 和熒光RT-PCR 雖然能快速準(zhǔn)確檢測NDV，但其靈敏度和準(zhǔn)確度還有待提高，而且經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，也無法檢測到所有NDV[21]。LAMP 需要針對模板設(shè)計4 對引物，方法的建立難度較大，LAMP多路復(fù)用也增加了該方法的局限性[22]，而且，上述方法均不能對病原進(jìn)行絕對定量。

隨著科技的不斷發(fā)展，1999 年Bert Vogelstein和Kenneth W.Kinzler 建立了第三代PCR 技術(shù)，即dPCR 技術(shù)[23]。dPCR 與第一代和第二代PCR 技術(shù)相比，具有更高的靈敏度、精確度、耐受性以及絕對定量等優(yōu)點，彌補(bǔ)了熒光PCR 依靠Ct 值間接定量的缺陷，也解決了熒光PCR 重復(fù)性差的問題[24]。dPCR 可用于稀有突變檢測[25-26]、拷貝數(shù)變異分析[27]、復(fù)雜樣本基因表達(dá)檢測[28]等。近年來，在動物疫病檢測中的應(yīng)用越來越廣泛，陳亞娜等[29]和譚建錫等[30]分別利用dPCR 技術(shù)建立了偽狂犬病毒和H1 亞型豬流感病毒微滴式dPCR 檢測方法，提高了檢測的靈敏性和準(zhǔn)確度。但由于其檢測高濃度核酸樣品時，無法實現(xiàn)精準(zhǔn)定量，目前dPCR 還不能完全取代熒光PCR[31]。

本研究利用dPCR 技術(shù)，針對基因VI 型NDVF基因保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，建立了一種可快速、特異、靈敏檢測基因VI 型NDV 的RT-dPCR 方法，可用于臨床上鴿NDV 的精準(zhǔn)檢測及樣本中病毒核酸的精確定量，為研制診斷用核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。