牛蒡子苷元調(diào)控miR-21對(duì)低氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞焦亡的影響

姚曉霞 ,陳智睿 ,雷 婧 ,唐 萍

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830000;2.重慶藥友制藥有限公司,重慶 400000;3.畢節(jié)市第一人民醫(yī)院設(shè)備科,貴州畢節(jié) 551700;4.上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,上海 200000)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemiareperfusion injury,MIRI)是指心肌冠狀動(dòng)脈障礙,導(dǎo)致血流無法通過,待恢復(fù)血流后,心肌的損傷程度比缺血時(shí)更為嚴(yán)重[1]。研究發(fā)現(xiàn),再灌注后誘發(fā)心律失常和微循環(huán)障礙等,導(dǎo)致心肌梗死面積增加,從而加重心肌損傷[2]。目前,由于有關(guān)心肌梗死的臨床藥物治療,如環(huán)孢素A,其使用時(shí)需要特異性受體并可導(dǎo)致其他組織和器官的免疫抑制等[3]。因此,積極探尋和開發(fā)MIRI的新藥物具有重大意義。牛蒡子苷元(arctigenin,ARG)是中藥牛蒡子的主要活性成分之一,在抗炎、抗氧化及保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[4-5]。新近研究發(fā)現(xiàn),ARG 能夠減輕壓力負(fù)荷以及體液因素誘導(dǎo)的心肌肥厚、心肌纖維化,并最終改善心臟功能[6]。另外,ARG 能夠抑制L-型鈣電流進(jìn)而延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程,從而發(fā)揮抗心律失常[7]。但是有關(guān)ARG 對(duì)MIRI的影響及作用機(jī)制尚不清楚。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性單鏈非編碼RNA。研究表明,miR-21具有顯著心肌組織特異性,在血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞等細(xì)胞中均呈高表達(dá)[8-9]。在小鼠心肌細(xì)胞MIRI時(shí)miR-21表達(dá)降低,參與心肌細(xì)胞凋亡[10]。另外,新近研究發(fā)現(xiàn),心肌細(xì)胞焦亡也參與了MIRI[11]。細(xì)胞焦亡是一種新的炎癥性細(xì)胞死亡方式,主要是以Caspase-1活化,促進(jìn)GSDMD 剪切形成具有細(xì)胞毒性的GSDMD-N,從而促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(interleukin-18,IL-18)釋放,并最終導(dǎo)致炎癥風(fēng)暴的過程[12]。既往研究證實(shí),在MIRI大鼠心肌組織焦亡相關(guān)蛋白(Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18)表達(dá)明顯升高。藥物干預(yù)或是基因沉默Caspase-1能夠抑制心肌細(xì)胞焦亡,減輕MIRI心肌梗死面積[13]。以上研究均表明,miR-21和心肌細(xì)胞焦亡在MIRI心肌梗死中發(fā)揮重要作用。但是有關(guān)miR-21能否調(diào)控MIRI心肌細(xì)胞焦亡以及ARG 治療MIRI是否通過調(diào)控miR-21發(fā)揮抗心肌細(xì)胞焦亡尚不清楚。為此,本研究擬通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究ARG對(duì)低氧復(fù)氧(hypoxia reoxygenation,H/R)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

H9C2大鼠心肌細(xì)胞購(gòu)自博士德公司,ARG(純度≥98%,批號(hào):HB-01110)購(gòu)自武漢科斯坦生物科技有限公司,IL-18酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)RAB0311)、IL-1βELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):RAB0277)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C0017)、原位缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidy transferase mediated nick end labeling,TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C1088)、羊抗兔IgG 抗體(批號(hào)A0239)、羊抗鼠IgG抗體(批號(hào)A0192)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù),Caspase-1抗體(批號(hào)ab36898)、GSDMD 抗體(批號(hào)ab8805)、IL-1β抗體(批號(hào)ab38449)、IL-18 抗體(批號(hào)ab32536)購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司,β-actin抗體(批號(hào)AF5001)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)。qRT-PCR檢測(cè)試劑盒、miR-21 mimic質(zhì)粒、miR-21 inhibitor質(zhì)粒均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。高速冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,型號(hào)Micro17R]、PCR 儀(美 國(guó)Bio-Rad,型 號(hào)CFX384 Touch)、倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司,型號(hào)GPJ9-TS100-F)、全自動(dòng)多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,型號(hào)FC]、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào)1658033)、ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將H9C2 細(xì)胞放于含100 m L/L 的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%青霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基中,隔天細(xì)胞換液,待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%～90%進(jìn)行實(shí)驗(yàn),傾去培養(yǎng)基后PBS潤(rùn)洗細(xì)胞,首先將細(xì)胞放置于37℃、20 m L/L的O2環(huán)境中缺氧培養(yǎng)10 h,之后將細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)O2補(bǔ)充至950 m L/L構(gòu)建低氧復(fù)氧(H/R)模型。實(shí)驗(yàn)分為如下4 組。對(duì)照組:(Control)正常培養(yǎng);H/R 組:H9C2 細(xì)胞造模成功后,再正常孵育24 h;H/R+ARG 組:H9C2細(xì)胞造模成功后,加入ARG(8μmol/L)含藥血清共孵育24 h;H/R+miR-21 mimic組:Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn) 染miR-21mimic 至H9C2 細(xì)胞后進(jìn)行H/R 處理,最后加入正常血清培養(yǎng)24 h;H/R+ARG+miR-21 inhibitor組:將miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)入H9C2細(xì)胞后進(jìn)行H/R 處理,最后加入ARG 含藥血清共孵育24 h。

1.3 q RT-PCR檢測(cè)miR-21表達(dá)

提取各組H9C2細(xì)胞總RNA,并運(yùn)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 的濃度與純度。以RNA 為模板,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟,逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。再以cDNA 為模板,根據(jù)廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成的PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增。miR-21:上游引物5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3';下游引物5'-GGGUAUCCUGGAUUACUUGAAUU-3';U6:上游引物5'-CCTCACTGTCCACCTTCCA-3';下游引物5'-GGGTGTAAAACGCAGCTCA-3'。擴(kuò)增條件:92℃,10 min;92℃,5 s;58℃,30 s;72℃,30 s,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。采用7300 System SDS Software分析數(shù)據(jù),根據(jù)2-△△Ct值相對(duì)定量樣本中目的基因表達(dá)水平。

1.4 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞焦亡率

各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),棄去細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS 潤(rùn)洗2次,在對(duì)應(yīng)的96孔板內(nèi)加入50μL 的TUNEL 染色液,37℃避光孵育1 h,傾去細(xì)胞染色液,PBS洗滌3次,DAPI染核3 min,PBS洗滌2次,熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照,焦亡細(xì)胞呈綠色熒光。細(xì)胞焦亡率(%)=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI細(xì)胞核×100%。

1.5 LDH 釋放的測(cè)定

將細(xì)胞懸液以1×104/孔接種至96 孔板內(nèi),按照1.2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分組處理后,收集各組細(xì)胞上清液,參照LDH 檢測(cè)試劑盒操作步驟于酶標(biāo)儀450 nm 測(cè)定吸光度值(A)。依據(jù)試劑盒檢測(cè)各組LDH 釋放度,以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 ELISA檢測(cè)IL-1β和IL-18含量

參照ELISA 檢測(cè)試劑盒,測(cè)定各組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果依據(jù)測(cè)定的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度值比值,獲取IL-1β、IL-18 含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blotting檢測(cè)焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

各組H9C2細(xì)胞完成實(shí)驗(yàn)后,提取蛋白質(zhì),并用BCA法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度。按照30μg/孔上樣,確定相應(yīng)上樣體積。制備濃縮膠與分離膠凝膠,上樣;電泳90 min;濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜120 min;用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h,孵育對(duì)應(yīng)Caspase-1抗體(1∶1 000)、GSDMD抗體(1∶1 000)、IL-1β抗體(1∶1 000)、IL-18抗體(1∶1 000)以及β-actin抗體(1∶2 000),于搖床震搖4℃過夜孵育后,滴加山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗(1∶5 000)孵育1～2 h,用TPBS 洗滌3次,5 min/次,然后加入顯影液,顯影并拍照。以目的蛋白條 帶(Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18)灰度值與β-actin灰度值之比反映蛋白相對(duì)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ARG 對(duì)細(xì)胞miR-21表達(dá)的影響

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,與Control組相比,H/R 組細(xì)胞miR-21 表達(dá)明顯降低(P<0.01);與H/R 組相比,H/R+ARG 組細(xì)胞miR-21表達(dá)明顯升高(P<0.01);與H/R+ARG 組相比,H/R+ARG+miR-21 inhibitor組細(xì)胞miR-21表達(dá)明顯降低(P<0.01,圖1)。

圖1 qRT-PCR 檢測(cè)ARG 對(duì)細(xì)胞miR-21表達(dá)的影響Fig.1 The effect of ARG on the expression level of cellular miR-21 detected by qRT-PCR

2.2 各組細(xì)胞焦亡率的比較

TUNEL染色結(jié)果顯示,與Control組相比,H/R組細(xì)胞焦亡率明顯升高(P<0.01);與H/R 組相比,H/R+ARG 組細(xì)胞焦亡率明顯降低(P<0.01);與H/R+ARG 組相比,H/R+ARG+miR-21 inhibitor組細(xì)胞焦亡率明顯升高(P<0.01,圖2)。

圖2 TUNEL 染色檢測(cè)ARG 對(duì)細(xì)胞焦亡的影響Fig.2 The effect of ARG on pyroptosis detected by TUNEL

LDH 試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示,與Control組相比,H/R組H9C2細(xì)胞LDH 釋放明顯升高(P<0.01);與H/R組相比,H/R+ARG 組細(xì)胞LDH 釋放明顯降低(P<0.01);與H/R+ARG組相比,H/R+ARG+miR-21 inhibitor組細(xì)胞LDH釋放明顯升高(P<0.01,圖3)。

圖3 ARG 對(duì)細(xì)胞LDH 釋放的影響Fig.3 The effect of ARG on the release of LDH from cells

2.3 各組細(xì)胞IL-1β、IL-18含量的比較

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,與Control組相比,H/R 組細(xì)胞IL-1β、IL-18釋放明顯升高(P<0.01);與H/R組相比,H/R+ARG 組細(xì)胞IL-1β、IL-18釋放明顯降低(P<0.01);與H/R+ARG 組相比,H/R+ARG+miR-21 inhibitor組細(xì)胞IL-1β、IL-18釋放明顯升高(P<0.01,圖4)。

圖4 ELISA檢測(cè)ARG 對(duì)細(xì)胞IL-1β、IL-18含量的影響Fig.4 The effect of ARG on the content of IL-1βand IL-18 in cells detected by ELISA

2.4 ARG 對(duì)心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,與Control組相 比,H/R 組細(xì)胞cleaved-caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.01);與H/R組相比,H/R+ARG 組細(xì)胞各蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01);與H/R+ARG 組相比,H/R+ARG+miR-21 inhibitor 組細(xì)胞各蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05或P<0.01,圖5)。

圖5 Western blotting檢測(cè)ARG 對(duì)細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of ARG on the expressions of pyroptosis-related proteins in cells detected by Western blotting

3 討 論

細(xì)胞焦亡是一種新型細(xì)胞死亡方式。既往研究顯示,在H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和MIRI大鼠模型中均有細(xì)胞焦亡發(fā)生,主要表現(xiàn)為cleavedcaspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白 表達(dá)增 加,LDH 釋放增多[13]。通過藥物干預(yù)或是抑制焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1表達(dá)能夠明顯改善MIRI和H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[14]。但是,目前關(guān)于H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。

miRNA 參與體內(nèi)多種病理、生理過程,可影響多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展,如心肌梗死、心肌纖維化等[15]。在MIRI大鼠心肌組織miR-21 表達(dá)明顯降低,而過表達(dá)miR-21可以減輕缺血缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷[16],這為緩解心肌損傷及治療缺血性心肌病提供了重要靶點(diǎn)。因此,積極探尋miR-21的藥物干預(yù)治療對(duì)于改善MIRI具有重大意義。研究發(fā)現(xiàn),miR-21 能夠通過調(diào)控NLRP3 介導(dǎo)脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[17]。另外,在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病心肌纖維化模型中miR-21能夠通過靶向雄性激素受體抑制心肌成纖維細(xì)胞焦亡[18]。以上研究提示,miR-21能夠通過調(diào)控細(xì)胞焦亡而影響心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。因此,通過探尋以miR-21為靶點(diǎn)的藥物干預(yù)治療可能是治療MIRI心肌細(xì)胞焦亡的重要途徑。

ARG 是牛蒡子的主要活性成分之一,能夠緩解多種誘因誘發(fā)的心肌損傷。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究ARG 對(duì)H/R 誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞焦亡的影響。qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,H/R 組細(xì)胞miR-21 表達(dá)明顯低于Control組,H/R+ARG 組細(xì)胞miR-21表達(dá)明顯高于H/R 組和H/R+ARG+miR-21 inhibitor組,初步表明H/R 能夠下調(diào)miR-21,而ARG 能夠逆轉(zhuǎn)H/R 誘導(dǎo)miR-21表達(dá);TUNEL染色進(jìn)一步檢測(cè)各組細(xì)胞焦亡情況,結(jié)果顯示,與H/R 組相比,ARG 能夠抑制心肌細(xì)胞焦亡,轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor能夠促進(jìn)H9C2細(xì)胞焦亡。這表明ARG 能夠通過促進(jìn)miR-21表達(dá)而抑制H9C2細(xì)胞焦亡。

心肌細(xì)胞焦亡主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜孔洞形成進(jìn)而促進(jìn)LDH 以及炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-18釋放,并最終誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)[13]。本研究發(fā)現(xiàn),H/R組細(xì)胞LDH、IL-1β、IL-18釋放明顯高于Control組,H/R+ARG 組細(xì)胞LDH、IL-1β、IL-18釋放明顯低于H/R 組和H/R+ARG+miR-21 inhibitor組。另外,細(xì)胞焦亡途徑分為Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典型細(xì)胞焦亡途徑和Caspase-4/5/11介導(dǎo)的非經(jīng)典型細(xì)胞焦亡途徑。其中Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑是目前研究最為廣泛的傳導(dǎo)途徑。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后會(huì)激活Caspase-1 形成cleaved-caspase-1,促進(jìn)GSDMD 形成具有細(xì)胞毒性的GSDMD-N 以及IL-1β、IL-18成熟體形成[19-20]。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,H/R 組細(xì)胞cleaved-caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 表達(dá)均明顯高于Control組,H/R+ARG 組細(xì)胞以上蛋白表達(dá)均明顯低于H/R組和H/R+ARG+miR-21 inhibitor 組。這表明ARG 能夠通過促進(jìn)miR-21表達(dá),從而抑制H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,ARG 能夠抑制H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡,其機(jī)制與促進(jìn)miR-21表達(dá)相關(guān)。這為ARG 用于治療MIRI心肌損傷提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。