4種檢出限確定方法的討論
——以離子色譜法測(cè)定冬瓜中亞硝酸鹽含量為例

◎ 張 林，方明強(qiáng)，唐浩文，陳 潔，鄭衛(wèi)東

（1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 611830；2.南溪公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 宜賓 644100；3.宜賓市屏山縣書樓鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)綜合服務(wù)中心，四川 宜賓 645350；4.四川凱樂食品檢測(cè)有限公司，四川 成都 611730；5.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 611731）

1947 年，德國(guó)人H·Kaiser 首先提出檢出限的概念[1]。隨著分析方法和分析技術(shù)的發(fā)展，檢出限的定義深入人心，計(jì)算表達(dá)方式呈現(xiàn)多樣化，使用廣泛。但國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）、國(guó)際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）和歐洲分析化學(xué)組織（Eurachem）等組織對(duì)檢出限的定義和計(jì)算表達(dá)方法卻不完全一致[2]。在我國(guó)更多采用IUPAC 的定義：“某一分析方法在給定的置信度條件下可從試樣中檢出待測(cè)物質(zhì)的最小濃度或最小量”[3]。檢出限是樣品中可被（定性）檢測(cè)，但無需準(zhǔn)確定量的最低含量（或濃度），是在一定置信水平下，從統(tǒng)計(jì)學(xué)上與空白樣品區(qū)分的最低濃度水平（或含量）[4]。檢出限是一個(gè)統(tǒng)稱，細(xì)分有儀器檢出限、方法檢出限、實(shí)驗(yàn)室檢出限，也有學(xué)者認(rèn)為還有樣品檢出限[5]。其中，儀器檢出限和方法檢出限是日常工作中使用頻率較高、使用范圍較廣的兩類。儀器檢出限是儀器對(duì)目標(biāo)分析物的最低可檢測(cè)濃度或含量，反映了儀器本身對(duì)不同物質(zhì)具有的靈敏度，一般取噪音的3 倍值。方法檢出限是指采用某種分析方法能定性檢出目標(biāo)分析物的最低濃度，一般是通過樣品空白添加目標(biāo)分析物，經(jīng)過樣品處理的全部步驟，再上機(jī)檢測(cè)。方法檢出限能綜合反映分析方法和分析儀器的靈敏度。

當(dāng)實(shí)驗(yàn)室首次使用某種檢測(cè)方法時(shí)，需對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證或確認(rèn)。方法驗(yàn)證是指針對(duì)要采用的標(biāo)準(zhǔn)方法或官方發(fā)布的方法，通過提供客觀證據(jù)對(duì)規(guī)定要求已得到滿足的證實(shí)，而方法確認(rèn)是指針對(duì)要采用的非標(biāo)準(zhǔn)方法或非官方發(fā)布的方法，通過提供客觀證據(jù)對(duì)特定的預(yù)期用途或應(yīng)用要求已得到滿足的認(rèn)定[6]。方法驗(yàn)證或方法確認(rèn)需要考察的性能特征至少應(yīng)包括正確度、精密度、選擇性、檢出限、定量限、線性度（或其他校準(zhǔn)模型）、范圍、不確定度和耐用性[7]。實(shí)際工作中，化學(xué)分析工作者普遍認(rèn)為，當(dāng)目標(biāo)組分含量在常量級(jí)別或以上，通常情況下可以不進(jìn)行檢出限的測(cè)定或計(jì)算，但當(dāng)目標(biāo)組分含量在痕量或超痕量時(shí)，必須進(jìn)行檢出限的測(cè)定或計(jì)算[8]。

實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行檢驗(yàn)方法驗(yàn)證或確認(rèn)時(shí)，多數(shù)情況下選擇一種檢出限計(jì)算方法或一種檢出限測(cè)試方法即可。但不同途徑獲得的檢出限結(jié)果可能不同。本文以離子色譜法測(cè)定冬瓜中亞硝酸鹽為例，用全程序空白法、加入標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)分析物法、標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋法和通過校準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)能力法4種方法獲得檢出限，通過比較，探討不同計(jì)算方法對(duì)檢出限的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3種亞硝酸鹽（NO2-）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（以NO2-計(jì)）均為國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：①編號(hào)GSB 04-2839-2011，批號(hào)188049-2，質(zhì)量濃度1 000 μg·mL-1，擴(kuò)展不確定度0.7%（k=2）。②編號(hào)GSB 05-1142-2000，批號(hào)103412，標(biāo)準(zhǔn)值100 mg·L-1，擴(kuò)展不確定度2%（k=2）；③編號(hào)GBW（E）081223，證書號(hào)H1808271/011，批號(hào)180827，標(biāo)準(zhǔn)值1.000 g·L-1，擴(kuò)展不確定度0.6% （k=2）。淋洗液為KOH 溶液，由美國(guó)Thermo 公司提供免試劑發(fā)生裝置產(chǎn)生。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-1100 型離子色譜儀，配電導(dǎo)檢測(cè)器和循環(huán)再生電解抑制器，美國(guó)Thermo。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.33—2016）[9]第一法離子色譜法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)原理為試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，采用相應(yīng)的方法提取和凈化，以氫氧化鉀溶液為淋洗液，陰離子交換柱分離，電導(dǎo)檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器檢測(cè)。

1.3.2 樣品前處理

稱取冬瓜約5 g（精確至0.001 g，可適當(dāng)調(diào)整試樣的取樣量，下同）置于150 mL 具塞錐形瓶中，加入80 mL 水、1 mL 1 mol·L-1氫氧化鉀溶液，超聲提取30 min，每隔5 min 振搖1 次，保持固相完全分散。于75 ℃水浴中放置5 min，取出放置至室溫，定量轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。溶液經(jīng)濾紙過濾后，取部分溶液于10 000 r·min-1離心 15 min，取上清液備用。

1.3.3 校準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確吸取亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL 于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，得到NO2-標(biāo)準(zhǔn)中間液10 mg·L-1。將亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)中間液再稀釋 10 倍，得到標(biāo)準(zhǔn)使用液1 mg·L-1，再逐級(jí)稀釋配制為 0 mg·L-1、0.02 mg·L-1、0.04 mg·L-1、0.06 mg·L-1、 0.08 mg·L-1、0.10 mg·L-1和0.15 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)濃度進(jìn)樣1次。以濃度與相應(yīng)峰面積繪制校準(zhǔn)曲線。

1.3.4 儀器條件

IonPac AG19 Analytical Column（50 mm×4 mm）保 護(hù) 柱，IonPac AS19 Analytical Column（250 mm× 4 mm）分離柱，AERS 500（4-mm）型抑制器；抑制電 流：174 mA；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：50 μL；柱 溫：35 ℃；檢測(cè)池溫度35 ℃。梯度洗脫：6 mmol·L-1，30 min；70 mmol·L-1，5 min；6 mmol·L-1，5 min。淋洗時(shí)間：45 min，峰面積定量。

1.3.5 信噪比測(cè)定方法

將標(biāo)準(zhǔn)中間液逐漸稀釋，配制為0.000 25 mg·L-1、0.000 50 mg·L-1、0.001 00 mg·L-13 個(gè)低濃度溶液，測(cè)定信噪比。

2 結(jié)果與分析

2.1 全程序空白法檢出限結(jié)果

確定檢出限時(shí)，應(yīng)選用不含或含有低濃度目標(biāo)組分的天然樣本。此外，也可使用空白樣本、含有低濃度目標(biāo)組分的均勻檢驗(yàn)物料[10]。為盡可能降低基質(zhì)中亞硝酸鹽含量，進(jìn)行了基質(zhì)選擇預(yù)備實(shí)驗(yàn)。選取蛋白質(zhì)含量較低且日常食用量較大的植物性食物檢測(cè)其亞硝酸鹽含量，通過對(duì)新鮮蔬菜冬瓜、藠頭、黃瓜、白蘿卜、胡蘿卜（橙色）和萵筍頭進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)冬瓜的亞硝酸鹽含量最低，基質(zhì)干擾最小。因此，選取冬瓜作為基質(zhì)材料。

在不添加標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)分析物的情況下，檢測(cè)5 批次樣品，每批次樣品進(jìn)行兩次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)全程序空白法考察方法檢出限。由于該檢測(cè)方法為離子色譜法測(cè)定亞硝酸鹽，根據(jù)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水質(zhì)分析質(zhì)量控制》（GB/T 5750.3—2006）[11]中的6.3.2.2 方法計(jì)算檢出限。計(jì)算公式見式（1）和式（2），經(jīng)查表得t0.05(5)=2.571，計(jì)算得檢出限為 0.11 mg·kg-1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 全程序空白法檢測(cè)結(jié)果表（單位：mg·L-1）

式中：Swb為空白平行測(cè)定（批內(nèi)）標(biāo)準(zhǔn)偏差；Xij為樣品的測(cè)定值；i為批次；j為同一批次樣品各個(gè)測(cè)定值；p為批數(shù)；n為樣品平行數(shù)。

式中：DL為檢出限，mg·kg-1；Swb為空白平行測(cè)定 （批內(nèi)）標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＜20）；tf為顯著性水平為0.05 （單側(cè)），自由度為f的t值；f為批內(nèi)自由度，等于p(n-1)；p為批數(shù)；n為平行樣品份數(shù)。

GB 5009.33—2016[9]中給出了離子色譜法測(cè)定亞硝酸鹽的檢出限為0.2 mg·kg-1。根據(jù)全程序空白法得到的方法檢出限是0.11 mg·kg-1，該數(shù)據(jù)低于國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)給出的檢出限，但兩個(gè)數(shù)據(jù)的數(shù)量級(jí)一致，同時(shí)也表明基質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析測(cè)定有干擾，原因是冬瓜自身含有較低量的亞硝酸鹽[12]。通過全程序空白法獲得的檢出限能綜合反映基質(zhì)、試劑、人員和設(shè)備等實(shí)驗(yàn)因素的影響，但該方法也有一定的局限性，即當(dāng)檢測(cè)基質(zhì)不同時(shí)，工作量較大。

在實(shí)際檢測(cè)工作中，也可用3 倍空白標(biāo)準(zhǔn)差作為檢出限。在式（2）中約為7.3，該值遠(yuǎn)大于3，意味著按照式（2）計(jì)算得到的檢出限比按照3 倍空白標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算得到的檢出限高。由此可知，即使原始數(shù)據(jù)一樣，計(jì)算方法不同也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不同，因此需綜合考慮實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況及檢測(cè)方法本身等多個(gè)因素，選擇合適的計(jì)算方法。

2.2 加入標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)分析物法檢出限結(jié)果

結(jié)合冬瓜自身亞硝酸鹽含量及干擾，設(shè)定本次實(shí)驗(yàn)添加亞硝酸鹽濃度為0.030 mg·L-1、0.035 mg·L-1、 0.040 mg·L-1和0.045 mg·L-1。各濃度水平加0.10 mL，獨(dú)立重復(fù)3 次，待測(cè)液檢測(cè)1 次，檢測(cè)結(jié)果見表2。

由表2 可知，添加量為0.003 0 mg·L-1的樣品組的信噪比最低。考慮扣除冬瓜基質(zhì)的影響后，預(yù)估添加量為0.003 0 mg·L-1的樣品組實(shí)際的信噪比會(huì)更低。對(duì)此，實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行了添加量分別為0.002 0 mg、 0.002 5 mg 的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明0.002 0 mg 組的出峰情況接近空白組，根據(jù)添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算得出方法檢出限為0.4 mg·kg-1。

表2 添加標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)分析物法檢測(cè)結(jié)果表

與檢測(cè)方法給出的0.2 mg·kg-1的檢出限相比，盡管濃度數(shù)量級(jí)是同一級(jí)別，但通過添加目標(biāo)分析物實(shí)驗(yàn)獲得的檢出限明顯偏高。實(shí)驗(yàn)人員分析，出現(xiàn)該情況的主要原因是受基質(zhì)影響。冬瓜自身含有一定量的亞硝酸鹽，當(dāng)添加量很小時(shí)，增加的響應(yīng)峰面積不明顯，會(huì)導(dǎo)致檢出限較高[13]。

2.3 稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液法檢出限結(jié)果

配制0.000 25 mg·L-1、0.000 50 mg·L-1、0.001 00 mg·L-13 個(gè)低濃度溶液，每個(gè)濃度水平設(shè)置3 次獨(dú)立重復(fù)，待測(cè)液上機(jī)測(cè)定1 次，檢測(cè)結(jié)果見表3。0.000 50 mg·L-1的待測(cè)液有1 次檢測(cè)的信噪比小于3。0.001 00 mg·L-1待測(cè)液的3 個(gè)重復(fù)檢測(cè)結(jié)果均滿足信噪比要求，即每次檢測(cè)都能明確識(shí)別檢測(cè)信號(hào)。隨著濃度的增大，0.002 50 mg·L-1、0.005 00 mg·L-1兩個(gè)濃度水平的信噪比顯著增大。通過稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液法計(jì)算得到的檢出限是0.02 mg·kg-1，低于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中給出的檢出限。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，避免了基質(zhì)及處理環(huán)節(jié)的影響，得到的檢出限數(shù)值上更接近儀器檢出限，也往往會(huì)低于方法檢出限的數(shù)值。

表3 稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液法檢測(cè)結(jié)果表

2.4 通過校準(zhǔn)直線計(jì)算檢測(cè)能力法檢出限結(jié)果

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，方法的線性范圍確定為＞ 6 mg·L-1，結(jié)合實(shí)際檢品，方法的工作范圍確定為 0 ～4 mg·L-1[14]。因 此，設(shè) 定0 mg·L-1、0.8 mg·L-1、 1.6 mg·L-1、2.4 mg·L-1、3.2 mg·L-1和4.0 mg·L-1為 標(biāo)準(zhǔn)溶液各濃度點(diǎn)，每個(gè)濃度點(diǎn)準(zhǔn)備3 個(gè)獨(dú)立重復(fù)。檢測(cè)結(jié)果見表4。

表4 校準(zhǔn)直線計(jì)算檢測(cè)能力法檢測(cè)結(jié)果表

獲得校準(zhǔn)函數(shù)和校準(zhǔn)直線后，應(yīng)檢驗(yàn)校準(zhǔn)函數(shù)和校準(zhǔn)直線的線性性能。本實(shí)驗(yàn)的3 條校準(zhǔn)直線均通過檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果為各濃度點(diǎn)測(cè)定值無異常，校準(zhǔn)直線通過0.000 3 原點(diǎn)，校準(zhǔn)函數(shù)線性成立，可以使用[14]。根據(jù)ISO 11843-2，可通過校準(zhǔn)直線計(jì)算檢測(cè)能力，詳細(xì)的計(jì)算公式參見ISO 11843-2 C3[15]。通過校準(zhǔn)直線計(jì)算的檢出限是0.12 mg·L-1。

通過計(jì)算獲得檢出限是很多實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的做法。張光建[5]分享了利用Excel 計(jì)算檢出限的方法，同時(shí)指出校準(zhǔn)曲線的不同配制方法對(duì)應(yīng)的檢出限不同。對(duì)比多種方法獲得的檢出限結(jié)果，可以看出通過計(jì)算獲得的檢出限比通過添加實(shí)驗(yàn)實(shí)際測(cè)得的檢出限低。有學(xué)者認(rèn)為，通過長(zhǎng)期積累數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得到的檢出限是最佳的檢出限[14]。

3 結(jié)論與建議

（1）檢出限獲得的方式有空白檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的倍數(shù)、信噪比法、逐步稀釋法、儀器靈敏度法、方法分辨率法和檢測(cè)能力計(jì)算法等。不同原理的檢測(cè)方法得到的檢出限結(jié)果也不同，如色譜類檢測(cè)方法更多運(yùn)用信噪比法，光譜類檢測(cè)方法多運(yùn)用空白檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差法[16]。用不同的方法可能會(huì)獲得不同的結(jié)果，結(jié)果可能會(huì)有較大的差異。當(dāng)可以嘗試多種方法時(shí)，建議實(shí)驗(yàn)室采用多種方法獲得檢出限，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)方法準(zhǔn)確度的要求來確定合適的方法計(jì)算檢出限。

（2）在食品分析領(lǐng)域，常涉及食品安全判定標(biāo)準(zhǔn)?？梢灶A(yù)見，食品安全管控會(huì)越來越嚴(yán)格，針對(duì)不得檢出或檢出量在痕量水平的物質(zhì)，在進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)特別注意檢出限。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室的檢出限高于判定標(biāo)準(zhǔn)，或高于檢測(cè)方法給出的數(shù)值時(shí)，應(yīng)查找原因，多方法嘗試，以確保獲得的檢出限具有分析操作的現(xiàn)實(shí)意義。

（3）檢出限測(cè)定或計(jì)算方法不同，獲得的檢出限結(jié)果可能存在較大的差異。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果除與儀器信號(hào)、儀器噪音有關(guān)，還與樣品基質(zhì)、操作人員、試劑和測(cè)定條件有關(guān)。在方法驗(yàn)證還未成為檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室強(qiáng)制規(guī)定前，就有學(xué)者提出應(yīng)統(tǒng)一檢出限的計(jì)算方法[3]。筆者認(rèn)為，隨著分析儀器的升級(jí)、分析方法的創(chuàng)新，檢出限的計(jì)算方法會(huì)變得更多樣化。若檢驗(yàn)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)在出版時(shí)，文本中明確給出檢出限的測(cè)定過程或計(jì)算方法，將有利于方法驗(yàn)證和數(shù)據(jù)比較。