制備富硒醬油的釀造方法研究

◎ 周萌萌，董修濤，付寒奇

（廣東廚邦食品有限公司，廣東 陽江 529800）

為了獲得富含有機(jī)硒的發(fā)酵醬油，各界學(xué)者通過不同方式進(jìn)行研究[1]。通過富集富硒酵母提取有機(jī)硒來制備有機(jī)硒醬油；以魚蛋白為原材料，經(jīng)過酶解發(fā)酵獲得富含氨基酸的基液，加入富硒酵母作為有機(jī)硒載體，生產(chǎn)富硒醬油。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：從亞硒酸鈉培養(yǎng)基中篩選普羅威登斯菌；廣東廚邦食品有限公司自培米曲霉、酵母菌群。

培養(yǎng)基：蛋白胨0.7%、氯化鈉溶液20%、瓊脂2.0%和亞硒酸鈉2.0%。

試劑：乙醇，濟(jì)寧博誠化工有限公司；鹽酸，廣東省東紅化工廠；硝酸，佛山市華希盛化工有限公司；甲苯，廣東光華化學(xué)有限公司和氫氧化鈉，天津市明亮化學(xué)試劑廠。

發(fā)酵原材料：東北非轉(zhuǎn)基因黃豆、小麥粉、食用鹽和水。

1.2 儀器與設(shè)備

KDC-2C 型微量凱式定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；3-18N 型臺(tái)式離心機(jī)，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)UV5，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；GK-1 微量元素檢測(cè)儀，山東國康電子科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 主要工藝流程

醬油釀造工藝流程見圖1。對(duì)照組是采用現(xiàn)有發(fā)酵工藝，米曲霉與發(fā)酵菌群混合制曲發(fā)酵，獲得發(fā)酵醬油。實(shí)驗(yàn)組是以現(xiàn)有發(fā)酵工藝為基礎(chǔ)，增加普羅威登斯菌混合制曲，獲得富硒發(fā)酵醬油。

圖1 醬油釀造工藝流程圖

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

蛋白酶活力的測(cè)定參考《蛋白酶制劑》（GB/T 23527— 2009）；氨基酸態(tài)氮的測(cè)定參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》（GB 5009.235—2016）；總氮含量的測(cè)定參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5—2016），采用凱式定氮法；有機(jī)硒含量的測(cè)定參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》（GB 5009.93—2017）。

1.3.3 風(fēng)味化合物的測(cè)定

參考陳光靜[2]的方法，分析風(fēng)味物質(zhì)形成的階段及產(chǎn)生機(jī)理，并對(duì)各風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行量化測(cè)量，為醬油風(fēng)味物質(zhì)研究提供重要參考。

1.3.4 氨基酸態(tài)氮和總氮含量的測(cè)定

依據(jù)相關(guān)國標(biāo)檢測(cè)氨基酸態(tài)氮《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》（GB 5009.124—2016）和總氮《化學(xué)試劑 總氮量測(cè)定通用方法》（GB/T 609—2018） 檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)出天然油的含量。

1.3.5 有機(jī)硒含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)可根據(jù)（GB 5009.93—2017）方法，測(cè)出總硒；利用氫化物發(fā)生原子熒光光譜法測(cè)出無機(jī)硒含量；用總硒減去無機(jī)硒，最終得出有機(jī)硒含量。

1.3.6 有機(jī)硒抗氧化性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)以不同有機(jī)硒濃度、有機(jī)硒添加量以及氧化時(shí)間為影響因素，以色澤、形態(tài)、組織和滋味氣味為感官評(píng)價(jià)指標(biāo)，驗(yàn)證不同因素對(duì)延緩食物褐變的影響，并觀察蘋果切片的褐變時(shí)間及褐變程度，評(píng)估有機(jī)硒抗氧化效果。有機(jī)硒抗氧化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 有機(jī)硒抗氧化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表

2 結(jié)果與分析

2.1 不同醬酪發(fā)酵酶活力對(duì)比

由表3 可知，對(duì)照樣與實(shí)驗(yàn)樣中α-淀粉酶活力沒有明顯差異（P＞0.05）；對(duì)照樣與實(shí)驗(yàn)樣的中性蛋白酶活力沒有明顯差異（P＞0.05）；對(duì)照樣與實(shí)驗(yàn)樣中酸性蛋白酶活力沒有明顯差異（P＞0.05）；對(duì)照樣與實(shí)驗(yàn)樣中糖化酶活力沒有明顯差異（P＞0.05）； 谷氨酰胺酶可催化谷氨酰胺水解生成谷氨酸，在提升醬油的風(fēng)味方面至關(guān)重要[3]。對(duì)照樣與實(shí)驗(yàn)樣中谷氨酰胺酶活力存在顯著差異（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)樣中谷氨酰胺酶是對(duì)照組的1.5 倍。

表3 發(fā)酵醬酪各種酶活記錄表（單位：U·g-1）

2.2 氨基酸態(tài)氮和總氮含量的變化

由圖2 可知，實(shí)驗(yàn)組采用3種微生物發(fā)酵，氨基酸態(tài)氮和總氮含量均優(yōu)于對(duì)照組，且氨基酸態(tài)氮與總氮成正比例關(guān)系。

圖2 不同曲料混合氨基酸態(tài)氮、總氮變化情況圖

2.3 有機(jī)硒含量的變化

對(duì)照樣與實(shí)驗(yàn)樣分別添加0.5 g·mL-1的亞硒酸鈉溶液，通過微生物發(fā)酵跟進(jìn)原油中有機(jī)硒含量。由表4 可知，發(fā)酵醬油添加普羅威登斯菌的混合醬油中有機(jī)硒含量達(dá)到0.025 mg·kg-1，遠(yuǎn)高于直接使用酵母菌、米曲霉混合發(fā)酵的有機(jī)硒含量0.013 mg·kg-1，發(fā)酵過程生產(chǎn)有機(jī)硒效率達(dá)到對(duì)照組的1.9 倍，存在顯著差異（P＜0.05）。

2.4 有機(jī)硒抗氧化性分析

由表5 可知，有機(jī)硒添加量對(duì)抗氧化性影響最大，其次為氧化時(shí)間和有機(jī)硒濃度。實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)組合為A3B2C1，即有機(jī)硒濃度0.02 mg·kg-1，添加量5 mL，氧化時(shí)長(zhǎng)5 min，該組合感官得分最高（97.4 分），抗氧化效果最好。另有文獻(xiàn)表明，提高植物GSH-Px、GR、GST 和APX 等抗氧化物酶的活性以及非酶類抗氧化物質(zhì)如AsA、GSH 等的含量，AsA-GSH 循環(huán)體系可提升自身抗氧化能力，這是市面上部分植物在切割后仍能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持新鮮的原因[4-5]。

2.5 風(fēng)味化合物含量的變化

由表6 可知，實(shí)驗(yàn)組風(fēng)味物質(zhì)較多，達(dá)到49種，與對(duì)照組相比，醇類、醛類和吡嗪類物質(zhì)種類較多對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組感官風(fēng)味醇厚濃郁，主要與發(fā)酵環(huán)節(jié)添加富硒酵母活性較高有關(guān)。添加普羅維登斯菌、米曲霉和酵母菌混合培養(yǎng)的醬酪在醇類、醛類、吡嗪類物質(zhì)種類較多僅用米曲霉、酵母菌混合培養(yǎng)的發(fā)酵醬油。

表6 風(fēng)味化合物的記錄表

3 結(jié)論

有機(jī)硒醬油產(chǎn)品發(fā)酵環(huán)節(jié)，添加普羅維登斯菌分解無機(jī)亞硒酸鈉后，經(jīng)米曲霉、酵母菌群發(fā)酵獲得的有機(jī)硒含量遠(yuǎn)高于直接將無機(jī)納米硒采用米曲霉、酵母菌群發(fā)酵的醬油原油。分析兩種方案理化特性，實(shí)驗(yàn)組谷氨酰胺酶含量較高，更有利于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)谷氨酸，提升氨基酸態(tài)氮利用率。實(shí)驗(yàn)組將無機(jī)亞硒酸鈉經(jīng)過分解納米化，發(fā)酵醬油轉(zhuǎn)化的有機(jī)硒含量為對(duì)照組的1.9 倍，說明經(jīng)微生物分解后的無機(jī)納米硒更有助于發(fā)酵生成有機(jī)硒。從風(fēng)味物質(zhì)種類分析，實(shí)驗(yàn)組能夠產(chǎn)出更多風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)酵醬油的綜合風(fēng)味更佳濃郁，產(chǎn)出醬油品質(zhì)更佳。