乙醇回流法提取大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮的 工藝研究

◎ 劉瑞霞，李翔輝，馮青松

（1.漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南 漯河 462300；2.河南省興霖農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，河南 信陽 465350）

青錢柳（Cyclocarya paliurus），由于果實(shí)類似銅錢，又名搖錢樹，屬于胡桃科青錢柳屬植物，主要分布在江西、江蘇、浙江和貴州等中國南部省份，全世界范圍內(nèi)只有中國境內(nèi)存在青錢柳，屬于國家重點(diǎn)保護(hù)植物之一[1]。其葉片中含多糖、黃酮、礦物質(zhì)、有機(jī)酸、皂苷、三萜類和生物堿等有益成分[2-3]，具有抗氧化、降低血糖、降血壓以及調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶能力等多種功效[4]。2013年，青錢柳被納入新食品原料進(jìn)行管理，這為青錢柳的開發(fā)利用提供了有利條件。目前青錢柳產(chǎn)品主要以干制青錢柳葉為主，雖然青錢柳有多種功效，但是其深加工技術(shù)還有待進(jìn)一步提高。為了探索大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮提取工藝，本試驗(yàn)采用乙醇回流對大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮提取率進(jìn)行探討，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，探究最佳提取工藝條件，為今后大別山產(chǎn)青錢柳深加工提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳（河南省興霖農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司）。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇和硝酸鋁均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（UV-9000S，上海元析儀器有限公司）；電子天平（FA1204N，上海菁海儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-4，江蘇中大儀器科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考蔣南洋等[5]文獻(xiàn)中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法進(jìn)行繪制。

1.3.2 樣品前處理

取新鮮青錢柳葉子，蒸餾水清洗，置于50 ℃烘箱中干燥，經(jīng)粉碎后過40 目篩，得干粉備用。稱取100 g 干粉樣品，取500 mL 乙醚，對干粉樣品冷凝回流24 h，脫去脂肪、色素等干擾物質(zhì)，過濾后用少量乙醚清洗樣品，通風(fēng)櫥中自然散去多余乙醚，再將樣品移入恒溫干燥箱中，于100 ～105 ℃下干燥2.0 h，備用。

1.3.3 總黃酮的提取

參考總黃酮提取相關(guān)文獻(xiàn)，確定總黃酮提取方法[6-7]。精確稱取20 g 上述脫脂樣品，采用乙醇回流法提取總黃酮，提取大別山產(chǎn)青錢柳中的總黃酮。

（1）單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。提取大別山產(chǎn)青錢柳中的總黃酮的試驗(yàn)條件見表1。

表1 單因素試驗(yàn)條件表

（2）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用4 因素3 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以A、B、C、D為因素，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，具體因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 總黃酮的測定

收集各回流提取液，濃縮后稀釋至250 mL，取一只10 mL 比色管，用移液槍精密量取1.0 mL 稀釋液置于其中，取0.3 mL 5% NaNO2溶液加入比色管，搖勻，放置8 min，取0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液加入比色管，搖勻，放置8 min，再加4% NaOH 溶液4 mL，加蒸餾水稀釋至刻度后，搖勻等待15 min，以試劑空白做對照實(shí)驗(yàn)測定吸光度。

1.3.5 總黃酮含量的計(jì)算

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測液中總黃酮含量（以蘆丁計(jì)），樣品青錢柳中總黃酮含量按公式（1）計(jì)算。

式中：X為樣品中總黃酮含量（以蘆丁計(jì)），%；m為樣品質(zhì)量，g；m1為測定用樣品溶液總黃酮的量，mg；V1為測定用樣品溶液體積，mL；V為樣品處理液總體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮提取率的影響

在其他試驗(yàn)條件固定的情況下，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)變化對提取率的影響，結(jié)果見圖1。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過75%時，總黃酮提取率變化趨勢趨于平緩。董安強(qiáng)等[8]研究青錢柳黃酮提取中有類似結(jié)果，即乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%左右時，提取率趨于穩(wěn)定，這可能是因?yàn)榍噱X柳中黃酮類化合物的極性與75%乙醇的極性接近。因此，選擇75%乙醇作為青錢柳黃酮提取中合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響圖

2.2 提取溫度對大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮提取率的影響

在其他試驗(yàn)條件固定的情況下，研究提取率與提取溫度之間的關(guān)系，結(jié)果見圖2。隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率呈逐漸增大的趨勢，當(dāng)提取溫度為70 ℃時，提取率最高，但當(dāng)溫度高于70 ℃時，提取率又呈現(xiàn)出下降趨勢。這可能是因?yàn)樘崛囟仍?0 ～70 ℃時，隨著溫度升高細(xì)胞壁破壞程度加劇，造成更多的黃酮溶出，但超過70 ℃之后，黃酮受熱導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而總黃酮提取率降低。綜合考慮，選擇提取溫度70 ℃作為提取青錢柳黃酮的合適溫度。

圖2 提取溫度對總黃酮提取率的影響圖

2.3 提取時間對大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮提取率的影響

在其他試驗(yàn)條件固定的情況下，研究提取時間對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。在2.0 h 以內(nèi)，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率明顯升高，當(dāng)提取時間大于2.0 h 時，總黃酮提取率的增長趨勢較為平緩。提取過程中的能源消耗是必須考慮的因素，延長提取時間時，提取成本也會增加，綜合考慮提取效率和提取成本，選擇2.0 h 作為提取青錢柳黃酮的合適時間。

圖3 提取時間對總黃酮提取率的影響圖

2.4 料液比對大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮提取率的影響

在其他試驗(yàn)條件固定的情況下，研究料液比對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4?？傸S酮提取率隨著提取溶劑含量的增加而增大，當(dāng)料液比達(dá)到1 ∶15 時，提取率基本達(dá)到最大，此時繼續(xù)增加提取溶劑的含量，提取率基本不會發(fā)生變化，這可能是由總黃酮的充分溶出造成的。因此，選擇料液比1 ∶15 為提取青錢柳黃酮合適的料液比。

圖4 料液比對總黃酮提取率的影響圖

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

由于不同因素在提取過程中會相互影響，為進(jìn)一步研究不同單因素在青錢柳黃酮提取過程中的相互作用，對提取條件在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果如表3 所示。

影響大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮提取率因素的主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，由k值分析可知，大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮的最佳提取條件為A2B2C3D3，9 組正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)未包含上述工藝參數(shù)組合，因此對該組合進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，測得大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮提取率為2.39%。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、提取溫度70 ℃，的提取時間2.5 h、料液比1 ∶20 為大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮的最佳提取條件。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用乙醇回流法提取河南大別山地區(qū)青錢柳中黃酮，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間和料液比對提取率的影響，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件，得到了最佳提取參數(shù)組合，在此工藝條件下大別山產(chǎn)青錢柳總黃酮的提取率為2.39%。本試驗(yàn)僅對總黃酮的提取條件進(jìn)行了初步研究，下一步計(jì)劃通過研究多種提取方法的工藝條件，進(jìn)一步比較不同方法對提取率的影響，在充分考慮成本與產(chǎn)出的基礎(chǔ)上，找到總黃酮的最優(yōu)提取方案與工藝條件，為青錢柳深加工、開發(fā)利用提供更多的理論基礎(chǔ)。