甘油二酯的酶法合成及純化工藝研究進展

◎ 梅 嵐，李祎銘

（脂代科技（北京）有限公司，北京 100089）

甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）是一種天然存在的來源于多種食用油脂的微量組分，也是油脂在人體代謝的中間產物，是公認的安全食品成分，具有營養(yǎng)、人體相容性高等優(yōu)點，其在色澤、風味、口感上與食用油脂中的主要成分甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）無異[1-2]。

1 甘油二酯概述

DAG 由于在緩解糖尿病等與營養(yǎng)相關的慢性代謝性疾病、抑制脂肪堆積方面有著重要的生理作用而受到廣泛關注。DAG 根據脂肪酸與羥基結合的位點不同，可分為1,3-DAG 與1,2-DAG 兩種異構體（圖1），其中CO-R、CO-R1為飽和或不飽和脂肪?；?。由于空間位阻效應，1,3-DAG 在熱力學上比1,2-DAG 更穩(wěn)定。約70%的DAG 以1,3-DAG 形式存在于食用油脂中[3]；而1,2-DAG 主要存在于油脂代謝中間產物中。不同種類的食用油中DAG 含量不同，見表1[4]。

表1 食用油中DAG 的含量表（單位：%）

圖1 甘油二酯的兩種結構示意圖

天然存在的DAG 很少，主要以普通油脂為原料，通過化學方法或生物酶法合成[5-6]。采用化學方法所需的化學試劑需通過額外步驟去除和回收，且工藝條件較苛刻（溫度220 ～260 ℃），會產生較高的運行成本，同時高熱環(huán)境可能導致熱敏性的多不飽和脂肪酸降解。因此，目前DAG 的生產極少使用化學方法。酶法由于環(huán)境友好、反應溫和、特異性強等特點而被廣泛使用。

脂肪酶催化的酶法提供了幾種合成DAG的途徑。①脂肪酸和甘油之間的酯化反應。②TAG 和甘油之間的甘油解反應。③TAG 的部分水解反應。④TAG和MAG 之間的酯交換或部分水解和酯化的組合。盡管酶法是合成DAG 的首選方法，但其生產成本往往較高。一般通過固定化的方法使酶穩(wěn)定并重復利用，從而降低酶法合成DAG 的成本。通常情況下，酶反應后產生的DAG 通過柱層析、分子蒸餾等進一步純化從而消除反應過程中形成的副產物，如游離脂肪酸（Free Fatty Acid，F(xiàn)FA）、MAG 和TAG，以達到食品級DAG 的產品要求[7]。

2 甘油二酯的酶法合成

2.1 酯化反應

酯化是以甘油和脂肪酸為原料，以脂肪酶為催化劑，制備DAG。在酯化過程中，會生成TAG、MAG等副產物（圖2）。在酯化反應中生成的水不僅會阻礙反應的正向進行，而且會降低脂肪酶的活性，所以控制適當的水含量至關重要。通常情況下，游離脂肪酸的供應量大于甘油，以提供足夠的游離脂肪酸與甘油酯化，但不能過量，以免在反應結束時難以去除或因酸度高而影響脂肪酶活性。李相等[8]以諾維信435 為催化劑，調整油酸和甘油的物質的量比為2.27 ∶1.00，在真空除水的條件下反應6 h，可以得到含量為70wt%的DAG。直接酯化法具有反應時間短、產物純度高、反應步驟簡單等優(yōu)勢，但因游離脂肪酸非常昂貴，因此直接酯化法的成本較高。因此，LO等[9]用玉米和大豆油脫臭餾出物中的脂肪酸與甘油進行了酶促酯化反應，經純化后DAG 的純度可高達84wt%。脫臭餾出物作為DAG 合成的廉價原料，間接降低了DAG 的生產成本。但當其用于食用油時，餾出物中的雜質仍然令人堪憂。類似的研究還有使用椰子油和葵花籽油的混合除臭餾出物來生產DAG。該研究采用了一種不同的DAG 合成方法，其中脫臭餾出物經過兩步酶促反應，先水解，使游離脂肪酸完全釋放，再將水解的游離脂肪酸與甘油酯化。與一步酯化法相比，使用該方法再純化后得到的DAG 純度可高達70wt%～94wt%[10]。

2.2 部分水解法

部分水解法是將TAG 與水和酶反應，得到DAG、MAG 和FFA 的混合物，再通過分子蒸餾去除水、MAG、FFA和殘留的TAG，得到高純度的DAG，見圖3。部分水解法反應過程簡單、成本低廉，但該過程會引入水，可能會降低油的品質，特別是多不飽和脂肪酸含量高的油。CHEONG 等[11]采用固定化脂肪酶通過部分水解法生產棕櫚基DAG，粗提純后的DAG 經純化后可獲得純度約90wt%的棕櫚基DAG。有研究表明，在反應發(fā)生前，水在脂肪物質中的溶解度先影響反應速率。因此，部分水解反應中通常會加入有機溶劑或表面活性劑，從而增加反應物的互溶性，提高DAG的產率[12]。此外，反應物對酶分子活性部位的可及性，尤其是在固定化酶形式下，對水解反應有顯著的影響。水分子還可與酶分子結合形成穩(wěn)定的水酶復合物，在部分水解反應體系下與TAG 競爭，所以當水含量超過一定的臨界限度時，TAG 的水解受到抑制。

圖3 部分水解法制備甘油二酯圖

2.3 甘油解法

甘油解法是生產DAG 最經濟的方法。酶法甘油解是以TAG 和甘油為原料，在脂肪酶的催化下制備DAG的方法，具體反應見圖4。在甘油解過程中，甘油是逐步加入的，以免甘油吸附在脂肪酶的活性部位而影響其催化活性[13]。KAHVECI 等[14]以甘油和菜籽油為原料，以諾維信435 為催化劑，制備了含量在40%～50% 的1,3-DAG。與部分水解法相似，有時會在甘油解反應中加入食品級表面活性劑，以克服甘油與油脂不混溶的問題。最近一項研究表明，超聲波預處理可促進豬油中DAG 的產生。一定強度的超聲功率強度會提高脂肪酶催化反應速率，但過高的超生功率強度可能導致脂肪酶失活從而降低反應速率。同時，超聲波可提高底物和脂肪酶的混溶性，但規(guī)模生產時能耗和成本較高[15]。

圖4 酶法甘油解制備甘油二酯圖

2.4 酯交換

酯交換法是以TAG 和MAG 為原料，在脂肪酶的催化下生成DAG。酯交換法分為兩步，先是TAG 的水解反應，再是TAG 水解后的脂肪酶與MAG 間的酯化反應，水解和酯化兩步反應的平衡是關鍵也是難點。同時，MAG 成本較高，不利于實現(xiàn)工業(yè)化。

3 DAG 的純化方法

在生產DAG的過程中，需對粗產物進行分離純化，去除MAG 等副產物，從而得到高純度的DAG。常用的純化方法有溶劑結晶法、柱層析法、超臨界CO2萃取法和分子蒸餾法[16]。

3.1 溶劑結晶法

溶劑結晶法利用混合物中脂肪酸、MAG、DAG和TAG 在特定溶劑中不同溫度下的溶解度差異控制不同的溫度使各組分得以結晶分離。此法的關鍵在于選擇合適的溶劑及結晶溫度。此法操作簡單、成本低廉，但僅適用于溶解度不會隨著溫度變化而改變的物質，并且存在工業(yè)生產低溫結晶難度較大、有機溶劑殘留等缺點。

3.2 柱層析法

柱層析法需選擇合適的液體洗脫劑及固體吸附劑，利用吸附劑對混合物各組分的吸附能力與脫附能力不同，通過柱內吸附劑的不斷吸附及脫附作用，使各組分依次被洗脫下來，實現(xiàn)分離純化。國外專利報道已實現(xiàn)采用離子交換樹脂[17]和分子篩[18]作為吸附劑，分離MAG、DAG 及TAG。MAEKAWA 等[19]將離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為洗脫劑對MAG 進行洗脫分離，得到了最終純度為95%的MAG。ZINNEN 等[17]用柱層析法實現(xiàn)了MAG、DAG、TAG 的高效分離。柱層析法對真空度的要求比分子蒸餾低，成本相對較低，但處理能力低，且僅處于實驗室階段，尚未實現(xiàn)工業(yè)化生產。

3.3 超臨界CO2 萃取法

當CO2溫度高于31.26 ℃且壓力高于7.38 MPa 時會轉變?yōu)槌R界狀態(tài)。利用超臨界CO2在特殊天然產物中溶解度增加而將各組分萃取出來，然后通過升溫或減壓下使CO2逸出后得到目標產物，這是近年來DAG 的最新分離方法[20]。超臨界CO2具有無腐蝕、高純度、無毒和價格低的優(yōu)點，既如氣體又如液體，具有較好的滲透性。但此法的缺點是操作壓力較高，工業(yè)化成本較高。

3.4 分子蒸餾法

分子蒸餾又名短程蒸餾，是在一定溫度和真空度下，利用不同物質分子運動的平均自由程差異實現(xiàn)液液分離的方法。此法具有操作溫度低、真空度高、受熱時間短、分離程度高等特點，適合于分離純化高沸點、熱敏性和易氧化的天然產物，能克服傳統(tǒng)蒸餾方法易引起熱敏性和易氧化成分的高溫破壞，并能分離沸點高和沸點差異小的物質，已廣泛應用于DAG 的純化過程[21]。

4 結語

酶法合成特定結構的DAG以及純化技術的發(fā)展，不僅促進了DAG 的產業(yè)化，而且滿足了消費者對不同功能性脂肪酸DAG 的需求，彌補了DAG 在食品領域的空缺。其中，經濟性較高的甘油解法由于產品產率高、反應時間短等特點常與操作溫度低、分離效率高的分子蒸餾法相結合，作為DAG 生產的優(yōu)勢路線，具有很好的產業(yè)化前景。