抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥對(duì)孕育期雌鼠心血管影響*

余海娟，陳祖盛，陳 彤，吳燚晶，孫珂悅，李昱靜，徐 欽，葉寒輝，陳雅紅，阮琴韻，傅麗云，黃春燕，周琳瑛，汪敏華，方秋娟△

（1.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系心血管病離子通道信號(hào)調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.臨床醫(yī)學(xué)部，3.護(hù)理學(xué)院，4.孟超肝膽醫(yī)院，5.附屬第一醫(yī)院超聲科，6.公共技術(shù)中心電鏡室，福建 福州 350108；7.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建 福州 350108）

艾滋病（獲得性免疫缺陷綜合征，acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是感染人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的人類免疫系統(tǒng)功能缺陷。HIV通過母嬰傳播已造成全球320多萬15歲以下的兒童罹患艾滋病［1］。對(duì)HIV陽性孕產(chǎn)婦施行抗病毒聯(lián)合治療（又稱高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療，highly active antiretroviral therapy，HAART），可顯著降低HIV母嬰傳播，改善HIV陽性母親預(yù)后［2，3］。而HAART藥物長期使用可引發(fā)包括心血管系統(tǒng)損傷等不良反應(yīng)，制約著HIV母嬰阻斷的安全和成?。?］。本研究參照《國家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物治療手冊(cè)》［5］，采用“齊多夫定（AZT）+拉米夫定（3TC）+克力芝（LPV/r）”HAART方案，觀察孕育期雌性大鼠AZT+3TC+LPV/r灌胃3個(gè)月對(duì)存活、體重、血脂、血糖、心肌酶、肝酶及心血管功能結(jié)構(gòu)影響，評(píng)價(jià)HAART對(duì)孕育期雌性大鼠的心血管不良反應(yīng)，為臨床HIV孕產(chǎn)婦心血管疾病監(jiān)測(cè)、干預(yù)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠25只，其中9周齡雌鼠19只，10周齡雄鼠6只，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（閩）2016-0002。

1.2 儀器與藥品

RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)、壓力換能器YPJ01H型（成都儀器廠），酶標(biāo)儀Elx800（Bio Tek公司），GE VIVID E95彩色多普勒超聲診斷儀（美國GE公司）；克力芝（AbbVie Ltd Maidenhead，SL6 4XE，英國），齊多夫定（東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司），拉米夫定（上海迪賽諾生物醫(yī)藥有限公司）；甘油三酯（triglyceride，TG）、肌酸激酶（lactate dehydrogenase，LDH）、葡萄糖（glucose，GLU）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?/h3>

將9只/10只雌性大鼠與3只雄性大鼠合為1籠，共2籠，分對(duì)照組（CON）、AZT+3TC+LPV/r組（HARRT）。兩組雌性大鼠于受孕前同時(shí)開始給藥。每組雌性大鼠早、晚固定時(shí)間各灌胃1次，其中CON組雌性大鼠灌生理鹽水（NS，10 ml/kg）；HAART組雌性大鼠灌等容積藥物（含AZT 31.25 mg/kg+3TC 15.63 mg/kg+LPV/r（41.67/10.42）mg/kg）。每天測(cè)定體重，連續(xù)3個(gè)月。

1.4 雌性大鼠受孕情況判斷

將待檢查的雌鼠置于操作臺(tái)上（避免尚未檢查的雌鼠受其影響），輕柔安撫雌鼠，拇指和食指捏住其尾巴，其余三指輕壓其后腰背部。翻起尾巴露出外陰，清理糞便后用生理鹽水潤濕的無菌棉簽輕觸陰道口，如發(fā)現(xiàn)有乳白或淡黃色固態(tài)栓狀物即為陰栓，有陰栓者即交配成功，記為妊娠第“0”日。交配成功的雌鼠于妊娠第14日進(jìn)行孕中期腹部觸診。孕中期在雙側(cè)腹部觸及多個(gè)花生米大小、質(zhì)韌、可推動(dòng)、成串珠狀排列的組織團(tuán)塊即為胚胎，為受孕成功的標(biāo)志。

1.5 雌性大鼠心臟超聲檢查

雌性大鼠飼養(yǎng)12周后，腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉，采用GE VIVID E95彩色多普勒超聲診斷儀，測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVDd）、室間隔厚度（interventricular septal thickness，IVST）、左室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）、主動(dòng)脈竇部（sinus of aorta，AOD）、左房前后徑（left atrial diamete，LAD）及射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）并記錄連續(xù)3個(gè)完整心動(dòng)周期的二維圖像。另外于標(biāo)準(zhǔn)心尖四腔心切面取二尖瓣口血流速度頻譜和二尖瓣環(huán)間隔、側(cè)壁的組織速度多普勒頻譜。

1.6 雌性大鼠動(dòng)脈血壓檢測(cè)

雌性大鼠氨基甲酸乙酯（1 g/kg）腹腔注射麻醉，右頸總動(dòng)脈插管，經(jīng)RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)描記動(dòng)脈血壓，測(cè)心率（heart rate，HR）、收縮壓（systolic pressure，SP）、舒張壓（diastolic pressure，DP）、平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，Pmean）、脈搏壓（pulse pressure，PP）。

1.7 雌性大鼠左心室內(nèi)壓檢測(cè)

雌性大鼠左心室插管，經(jīng)RM6240BD系統(tǒng)描記大鼠左心室壓力波，測(cè)心率（HR）、左心室壓力最大上升速度（LVP+dp/dtmax）和最大下降速度（LVPdp/dtmax）。

1.8 雌性大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)

雌性大鼠腹主動(dòng)脈取血，按試劑盒說明，測(cè)甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein，LDL）、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、血糖（glucose，GLU）及肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳 酸 脫 氫 酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）含量。

1.9 雌性大鼠心肌組織Masson染色

取雌性大鼠心肌組織制備石蠟切片、脫蠟、降梯度濃度酒精中脫水、溫水漂洗，經(jīng)R1核染色液、R2漿染色液、R3黃色分色液、R4藍(lán)色復(fù)染液染色，升梯度濃度酒精中浸泡，二甲苯透明后封片，在光鏡下觀察心肌組織纖維化程度并拍照。

1.10 雌性大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察

取雌性大鼠左心室心尖部心內(nèi)膜下心肌組織，切成1 mm3大小。經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟后，包埋在已裝有包埋劑的多孔橡膠模版中，將包埋劑灌滿，制成包埋塊。包埋塊定位后，保留需要電鏡觀察的部分，把其余部分削除，切片，定位。用醋酸鈾染色，再用檸檬酸鉛染色5～15 min，蒸餾水沖洗。在透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組雌性大鼠存活情況的比較

CON組雌性大鼠9只均存活；HAART組雌性大鼠10只存活6只，4只分別于第4、16、22、39日死亡。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r導(dǎo)致生存不良。

2.2 兩組雌性大鼠受孕情況的比較

CON組9只存活雌性大鼠受孕8只，平均分娩子鼠8.8只，平均受孕天數(shù)37.2 d；與CON組比較，HAART組6只存活雌性大鼠均受孕，平均分娩子鼠9.8只，平均受孕天數(shù)36.8 d。

2.3 兩組雌性大鼠體重變化的比較

與CON組比較，HAART組雌性大鼠初始一周體重減少（P＜0.05，圖1），后期體重與CON組無明顯差異，提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r早期不良反應(yīng)導(dǎo)致體重下降。

Fig.1 Changes in body weight of female rats*P＜0.05 vs CON group

2.4 兩組雌性大鼠心臟超聲指標(biāo)的比較

與CON組比較，HAART組雌性大鼠心臟左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、室間隔厚度（IVST）、左室后壁厚度（LVPWT）、左房前后徑（LAD）均增加（P＜0.05，表1）。提示雌性大鼠孕育期施加AZT+3TC+LPV/r引起心室肌肥厚、心臟擴(kuò)大。

2.5 兩組雌性大鼠動(dòng)脈血壓的比較

與CON組比較，HAART組雌性大鼠心率減少、舒張壓增加（P＜0.05）；收縮壓、平均壓增加，脈壓減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r導(dǎo)致動(dòng)脈硬化，血管阻力增大，舒張壓升高。

Tab.1 Cardiac ultrasound index of female rats（±s）

Tab.1 Cardiac ultrasound index of female rats（±s）

LVDd：Left ventricular end diastolic diameter；IVST：Interventricular septal thickness；LVPWT：Thickness of left ventricular posterior wall；AOD：Sinus of aorta；LAD：Left atrial diameter；EF：Ejection fraction*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group

Group n LVDd（cm） IVST（cm） LVPWT（cm） AOD（cm） LAD（cm） EF（%）CON 8 0.73±0.04 0.13±0.01 0.14±0.01 0.39±0.02 0.40±0.03 78.98±6.30 HAART 6 0.77±0.03* 0.15±0.01** 0.15±0.01* 0.41±0.03 0.44±0.03* 77.46±4.51

Tab.2 Arterial blood pressure in female rats（±s）

Tab.2 Arterial blood pressure in female rats（±s）

SP：Systolic pressure；DP：Diastolic pressure；Pmean：Mean arterial pressure；PP：Pulse pressure*P＜0.05 vs CON group

Group n Heart rate（beats/min） SP（mmHg） DP（mmHg） Pmean（mmHg） PP（mmHg）CON 6 373±55 120±15 79±12 93±12 41±8 HAART 5 349±47* 127±7 95±17* 106±13 32±11

2.6 雌性大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較

與CON組比較，HAART組雌性大鼠左心室壓力最大上升速度（LVP+dP/dtmax）減少（P＜0.01，表3）。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r造成左心室收縮功能下降。

Tab.3 Hemodynamic parameters of left ventricle in female rats（±s，n=6）

Tab.3 Hemodynamic parameters of left ventricle in female rats（±s，n=6）

LVP+dP/dtmax：Maximum rise velocity of left ventricular pressure；LVP-dP/dtmax：Maximum fall velocity of left ventricular pressure**P＜0.01 vs CON group

Group Heart rate（beats/min）LVP+dP/dtmax（mmHg/s）LVP-dP/dtmax（mmHg/s）CON 358±54 14374±1873 -8535±1099 HAART 342±32 10806±2104**-8868±2355

2.7 雌性大鼠血清生化指標(biāo)的比較

與CON組比較，HAART組雌性大鼠甘油三酯（TG）減少（P＜0.05）、血糖（GLU）增加（P＜0.05，表4）；肌酸激酶（CK）減少（P＜0.01）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）減少（P＜0.05，表5）。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r導(dǎo)致營養(yǎng)不良、糖脂代謝紊亂。

Tab.4 The four lipids and blood glucose of female rats（mmol/L，±s）

Tab.4 The four lipids and blood glucose of female rats（mmol/L，±s）

TG：Triglyceride；T-CHO：Cholesterol；LDL：Low density lipoprotein；HDL：High density lipoprotein；GLU：Glucose*P＜0.05 vs CON group

Group n TG T-CHO LDL HDL GLU CON 8 0.70±0.30 2.31±0.45 0.20±0.16 0.86±0.22 10.90±4.05 HAART 6 0.45±0.11*2.48±0.32 0.10±0.05 0.82±0.13 15.75±4.51*

Tab.5 Serum myocardial enzymes and liver functional enzymes of female rats（±s）

Tab.5 Serum myocardial enzymes and liver functional enzymes of female rats（±s）

LDH：Lactate dehydrogenase；CK：Creatine kinase；GOT：Glutamic oxalacetic transaminase；GPT：Glutamic pyruvic transaminase*P＜0.05，**P＜0.01vs CON group

Group LDH（U/L）CK（U/ml）GOT（/karU）GPT（/karU）CON 254±175 1.83±0.83 27.97±10.33 45.87±20.38（n=8） （n=7） （n=6） （n=6）HAART 266±167 0.41±0.20**17.16±2.99*36.89±7.80（n=5） （n=6） （n=6） （n=6）

2.8 兩組雌性大鼠心肌組織纖維化的比較

與CON組比較，HAART組雌性大鼠心肌組織藍(lán)染顯示增加，表明心肌組織膠原纖維多（圖2，圖3）。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r造成心肌組織纖維化。

Fig.2 Myocardial tissues of different female rats in CONgroup（Masson×400）

Fig.3 Myocardial tissues of different female rats in HAART group（Masson×400）

2.9 雌性大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的比較

CON組雌性大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)濃密；肌原纖維排列整齊，Z線、肌小節(jié)明顯，可見M線和明帶、暗帶；線粒體豐富，嵴致密；核膜完整，染色質(zhì)清晰（圖4）。與CON組比較，HAART組雌性大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)疏松；肌絲模糊，明帶、暗帶不清，可見灶性斷裂、溶解、消失，膠原纖維增生；線粒體嵴稀疏，呈空泡樣改變；肌漿網(wǎng)擴(kuò)張（圖5）。提示孕育期雌性大鼠施加AZT+3TC+LPV/r造成心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷。

Fig.4 Ultrastructure of myocardial cells of female rats in CON group（×12.5K）

Fig.5 Ultrastructure of myocardial cells of female rats in HAART group（×12.5K）

3 討論

艾滋病是威脅人類健康的重大傳染性疾病。WHO報(bào)告顯示，全球新發(fā)HIV感染中母嬰傳播約占9%，是HIV疫情增長的重要因素之一。HIV孕產(chǎn)婦在未加干預(yù)的情況下，HIV母嬰傳播的概率高達(dá)20%～45%。采用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART），此概率可降到2%以下甚至更低［6，7］。對(duì)HIV孕產(chǎn)婦HAART防止HIV母嬰傳播已成為專家共識(shí)［8］，但HAART藥物不良反應(yīng)不容忽視［9］。

HAART引發(fā)的多系統(tǒng)不良反應(yīng)中，心血管系統(tǒng)病變最受臨床關(guān)注。目前我國艾滋病免費(fèi)抗病毒治療藥物主要有兩類：逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（如AZT、3TC）和蛋白酶抑制劑（如LVP/r），前者對(duì)線粒體有毒性，后者可致糖、脂代謝異常，兩者都可引發(fā)心血管疾病（CVD）［10］。臨床實(shí)踐表明，與男性相比，HIV女性HAART導(dǎo)致的脂肪分布異常、貧血、CVD等不良反應(yīng)更為常見。此外，妊娠期生理改變?cè)斐伤幬镂?、分布、代謝和排泄改變，影響HAART效果和不良反應(yīng)，增加HIV女性孕育期CVD風(fēng)險(xiǎn)。臨床觀察也表明，與妊娠期未接受HAART的孕婦相比，HAART的孕婦因高血壓病死亡的風(fēng)險(xiǎn)更大［11］。因此，需要評(píng)估孕育期女性HAART安全性、耐受性和潛在毒性，防止高血脂、高血糖和肝毒性等不良反應(yīng)［12］，避免HIV孕產(chǎn)婦CVD風(fēng)險(xiǎn)，保障母嬰健康。

本研究制備雌性大鼠孕育期AZT+3TC+LPV/r灌胃3個(gè)月實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察生存情況、體重、血糖、血脂、心肌酶、肝酶及心血管功能和結(jié)構(gòu)變化，明確艾滋病的抗病毒治療藥物對(duì)孕育期雌性大鼠的心血管不良反應(yīng)，可望為HIV女性孕育期CVD防護(hù)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，HAART組雌性大鼠4/10只分別于HAART第4、16、22、39日死亡，提示HAART造成孕育期雌性大鼠生存不良；HAART初始1周時(shí)孕育期雌性大鼠體重減少，這與HIV患者HAART初體重下降的變化一致，其機(jī)制可能與HAART藥物的近期不良反應(yīng)（如胃腸道反應(yīng)）有關(guān)；雌性大鼠3個(gè)月時(shí)血糖增加，TG、CK、GOT減少，提示HAART造成孕育期雌性大鼠代謝紊亂、營養(yǎng)不良。臨床實(shí)踐也顯示，第一代核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTIs）（司他夫定、齊多夫定等）和一些蛋白酶抑制劑（PIs）（克力芝等）可影響HIV患者脂質(zhì)代謝［13］，造成脂代謝紊亂，導(dǎo)致脂肪營養(yǎng)不良、皮下脂肪減少、內(nèi)臟脂肪積聚、血脂異常（TG、LDL升高）、胰島素抵抗、糖耐量異常等遠(yuǎn)期不良反應(yīng)，導(dǎo)致HIV患者易伴發(fā)CVD［14］；此外，本研究顯示，HAART組雌性大鼠動(dòng)脈舒張壓升高，說明HAART造成血管外周阻力增大。這可能與蛋白酶抑制劑（克力芝）脂代謝異常的遠(yuǎn)期不良反應(yīng)，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)［15］。本研究對(duì)雌性大鼠心臟超聲、心臟血流動(dòng)力學(xué)、心臟組織學(xué)及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察［16］，結(jié)果顯示，雌性大鼠孕育期HAART導(dǎo)致心臟擴(kuò)大、心肌肥厚，心臟收縮速度下降，心肌膠原纖維增加，心肌細(xì)胞線粒體、肌原纖維等超微結(jié)構(gòu)損傷，說明HAART可致心臟結(jié)構(gòu)和功能異常，心肌纖維化重塑［17］。這些變化也與臨床HAART的HIV患者常見心臟功能障礙相一致［18］。有研究表明，HAART可引起血管內(nèi)膜-中膜復(fù)合物厚度增加，并直接或間接誘發(fā)內(nèi)皮功能障礙；此外，齊多夫定和拉米夫定單獨(dú)或聯(lián)合使用可造成肌內(nèi)膜間隙增加、心肌細(xì)胞損失和心肌束減少［19，20］。

本研究觀察表明，HAART對(duì)孕育期雌性大鼠生長、代謝、心血管結(jié)構(gòu)和功能影響，與臨床實(shí)踐中觀察到HIV孕產(chǎn)婦HAART不良反應(yīng)一致［21-25］。證實(shí)艾滋病抗病毒藥（AZT+3TC+LPV/r）可導(dǎo)致孕育期雌性大鼠心血管不良反應(yīng)。因此，臨床HIV孕產(chǎn)婦HAART過程中需要加強(qiáng)心血管疾病監(jiān)測(cè)與防護(hù)，以確保母嬰安全。