臭氧亞慢性暴露對(duì)大鼠心臟lncRNA表達(dá)譜的影響*

趙 越，田 蕾，閆 峻，李 康，林本成，襲著革，劉曉華

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050）

近年來(lái)空氣污染問(wèn)題已成為全球亟待解決的重要環(huán)境問(wèn)題之一，臭氧（ozone，O3）作為環(huán)境重要污染物之一，已成為我國(guó)夏季大氣首要污染物［1］。中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站數(shù)據(jù)顯示，2019年就有154個(gè)城市出現(xiàn)O3高值，且以O(shè)3為首要污染物的天數(shù)共153 d；2020年，京津冀地區(qū)、長(zhǎng)江三角地區(qū)和汾渭平原O3超標(biāo)天數(shù)占總超標(biāo)天數(shù)的一半［1］。流行病學(xué)研究表明O3暴露與人類(lèi)呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率呈正相關(guān)關(guān)系［2］。O3暴露可引起黏膜和呼吸道刺激性反應(yīng)，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些因子隨血液循環(huán)到達(dá)其他組織器官，引起全身性反應(yīng)［3］。

長(zhǎng)鏈非編碼RAN（long noncoding RNA，lncRNA）是真核生物DNA轉(zhuǎn)錄中產(chǎn)生的一類(lèi)非編碼RNA，其核苷酸數(shù)量大于200個(gè)堿基，lncRNA功能與其在細(xì)胞中的定位相關(guān)，在細(xì)胞核中的lncRNA主要通過(guò)干預(yù)染色體來(lái)發(fā)揮調(diào)控功能，在細(xì)胞質(zhì)中的lncRNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與機(jī)體生理病理學(xué)過(guò)程［4］。Janika等人研究表明lncRNA Chat可促進(jìn)心室重塑［5］，Maria-Teresa Piccoli團(tuán)隊(duì)研究表明Meg3升高可在慢性心肌肥大的基礎(chǔ)上導(dǎo)致心臟纖維化，特異性干擾該基因的表達(dá)可顯著改善心臟功能［6］。

目前O3亞慢性暴露對(duì)心臟影響的研究較少，深入機(jī)制研究更為匱乏。本文首次針對(duì)O3亞慢性暴露后大鼠心臟中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜變化情況，和差異性lncRNA潛在的生物學(xué)功能進(jìn)行闡述，為預(yù)防O3亞慢性暴露對(duì)人體的損傷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型構(gòu)建及樣本采集

從北京維通利華有限公司購(gòu)入18只6周齡雄性Wistar大鼠，于清潔級(jí)動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將其隨機(jī)分為清潔空氣組和臭氧暴露組，每組9只。建模期間，將大鼠置于氣體染毒柜（Beijing huironghe，HRH-CSED-K）中，清潔空氣組暴露于過(guò)濾空氣中，臭氧暴露組暴露于O3濃度為0.5 ppm（0.980 mg/m3）的混合氣體中，每天6 h，共90 d。暴露結(jié)束后大鼠禁食不禁水，次日以3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后立即摘取心臟，隨后每組取3只大鼠心尖組織置于10%甲醛固定液中用于石蠟切片制備，其余心肌組織于4℃生理鹽水中清洗去除血液后置于液氮中保存。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)大鼠的所有操作都經(jīng)過(guò)軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)。

1.2 總RNA提取及質(zhì)量控制

根據(jù)TRIzol試 劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）說(shuō)明書(shū)從前述實(shí)驗(yàn)中凍存的6只大鼠心臟中提取總RNA，利用RNasey Mini Kit對(duì)RNA樣本進(jìn)行純化，最后采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)總RNA完整性進(jìn)行評(píng)估，通過(guò)Nanodrop ND-1000（Nanodrop，Wilmington，de，USA）對(duì)每個(gè)樣本中的總RNA進(jìn)行定量和質(zhì)量驗(yàn)證。

1.3 芯片雜交分析

由Arraystar Technologies（Maryland，USA Rockville）設(shè)計(jì)并生產(chǎn)大鼠lncRNA芯片2.0 V（4×44k），根據(jù)Quick Amp Labeling Kit和One-Color試劑盒（Agilent，USA）說(shuō)明書(shū)將1.2中提取的總RNA樣本進(jìn)行標(biāo)記并反轉(zhuǎn)為熒光cRNA，隨后純化并檢測(cè)cDNA的質(zhì)量和濃度。根據(jù)Agilent Gene Expression Hybridization試劑盒（Agilent，USA）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，通過(guò)Agilent Scanner G2505C對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行掃描，通過(guò)R（3.1.2版）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)

從芯片結(jié)果中選取6個(gè)差異性顯著的lncRNA（3個(gè)顯著上調(diào)，3個(gè)顯著下調(diào)）進(jìn)行驗(yàn)證，以GAPDH為內(nèi)參，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物。用TRIzol試劑提取前述實(shí)驗(yàn)中凍存的心肌組織中總RNA，去除基因組DNA，根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒（Thermo，US）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)（30℃10 min；42℃50 min）。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)主要儀器為Bio-Rad iq5（Bio-Rad，US）；主要試劑為Fast-Start Essential DNA Green Maste（Roche）qRT-PCR，條件為85℃10 min，每組六次平行實(shí)驗(yàn)。

1.5 GO和KEGG分析

基因本體論（Gene Ontology，GO）（http：//www.geneontology.org）分析包括生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三個(gè)部分，使用Fisher檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P（P＜0.05）值越小，GO項(xiàng)越顯著；京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（https：//www.genome.jp/kegg/）用于描述差異性lncRNA可能參與的信號(hào)通路，P（P＜0.05）值越小，KEGG項(xiàng)越顯著。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 O3亞慢性暴露對(duì)大鼠心臟中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的影響

我們采用芯片雜交技術(shù)對(duì)O3亞慢性暴露后大鼠心臟中l(wèi)ncRNA表達(dá)變化情況進(jìn)行分析。箱式圖描述了臭氧暴露組與清潔空氣組數(shù)據(jù)分布情況，結(jié)果顯示六組數(shù)據(jù)分散情況基本一致（圖1A）。熱圖結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，臭氧暴露組中大量lncRNA表達(dá)量發(fā)生改變（紅色為表達(dá)上調(diào)，綠色為表達(dá)下調(diào)，圖1B）?；鹕綀D結(jié)果顯示差異性lncRNA中顯著上調(diào)的有167個(gè)（紅色），顯著下調(diào)的有64個(gè)（綠色，圖1C）。

Fig.1 Overview of differentially expressed lncRNA

2.2 O3亞慢性暴露大鼠心臟中差異表達(dá)lncRNA分類(lèi)

通過(guò)對(duì)差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行分類(lèi)分析，結(jié)果顯示差異性上調(diào)的lncRNA中含量最多的是基因間lncRNA（灰色，34%）、外顯子有義重疊型lncRNA（橙色，32%）和內(nèi)含子有義重疊型lncRNA（黃色，21%）；差異性下調(diào)的lncRNA中含量最多的是基因間lncRNA（灰色，46%）、雙向型lncRNA（深藍(lán)色，22%）和外顯子有義重疊型lncRNA（橙色，20%）。在全部lncRNA中占比最多的是基因間lncRNA（灰色），最少的是天然反義型lncRNA（綠色，圖2）。

Fig.2 Classification of the differentially expressed lncRNA

2.3 差異表達(dá)lncRNA表達(dá)量驗(yàn)證

根據(jù)芯片雜交分析結(jié)果，我們利用qRT-PCR方法對(duì)表達(dá)變化最顯著的6個(gè)lncRNA（LOC102554403、LOC103693964、LOC108349594、LOC102554241、LOC102547903、LOC102552250）的表達(dá)趨勢(shì)進(jìn)行驗(yàn)證。qRT-PCR結(jié)果顯示，LOC102554403、LOC103693964和LOC108349594表達(dá) 上 調(diào)，LOC102554241、LOC102547903和LOC102552250表達(dá)下調(diào)，且變化倍數(shù)＞2，這一結(jié)果與芯片分析結(jié)果一致，即芯片結(jié)果可信（圖3）。

Fig.3 LncRNA expression level validated by microarray and qRT-PCR（±s，n=6）

2.4 O3亞慢性暴露大鼠心臟中差異表達(dá)lncRNA的GO分析

GO分析結(jié)果表明，顯著上調(diào)的lncRNA主要參于生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和細(xì)胞對(duì)外界刺激性的反應(yīng)；在細(xì)胞中主要存在于細(xì)胞質(zhì)中；可能具有黏著功能（GO：0005488）和與其他物質(zhì)相結(jié)合的功能（表1）。

顯著下調(diào)的lncRNA主要參與細(xì)胞器定位（GO：0051640）和物質(zhì)分解代謝的過(guò)程；在細(xì)胞中主要定位于纖毛纖維過(guò)渡、濃縮的染色體外著絲粒和微管中；可能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化還原酶活性發(fā)揮調(diào)控功能（表2）。

2.5 O3亞慢性暴露大鼠心臟中差異表達(dá)lncRNA的KEGG分析

KEGG分析結(jié)果表明顯著上調(diào)的lncRNA主要參與PI3K-Akt信號(hào)通路、脂肪酸降解、甲狀腺激素等信號(hào)通路；顯著下調(diào)的lncRNA主要參與各種維生素和主要供能物質(zhì)的代謝過(guò)程，并可能調(diào)控藥物代謝細(xì)胞色素P450等過(guò)程（表3）。

3 討論

O3是目前大氣污染中重點(diǎn)防治對(duì)象之一，O3對(duì)哺乳動(dòng)物和人的影響主要集中于呼吸系統(tǒng)，研究表明O3急性暴露導(dǎo)致肺部發(fā)生廣泛性、持續(xù)性的炎癥，使機(jī)體免疫功能降低、肺上皮細(xì)胞增生和肺纖維化［3］。在本研究中我們采用芯片技術(shù)研究證實(shí)O3亞慢性暴露可導(dǎo)致大鼠心臟中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，顯著上調(diào)的lncRNA有167個(gè)，顯著下調(diào)的lncRNA有64個(gè)（FC≥1.5和P＜0.05），其中數(shù)量最多的是基因間lncRNA。

Tab.1 GO analysis for up-regulated lncRNA after ozone subchronic exposure

Tab.2 GO analysis for down-regulated lncRNA after ozone sub-chronic exposure

GO分析結(jié)果表明差異性上調(diào)的lncRNA可能主要參與生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，大量研究表明發(fā)育過(guò)程較為復(fù)雜的生物體內(nèi)的lncRNA可能通過(guò)RNA修飾參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)揮過(guò)程，與心臟發(fā)育密切相關(guān)的基因有Bvht、Fendrr等，其中l(wèi)ncRNA SRA1和Linc-MD可通過(guò)海綿作用調(diào)控細(xì)胞分化［7］，本研究也發(fā)現(xiàn)大量與發(fā)育相關(guān)的lncRNA，GO分析提示這些差異表達(dá)的lncRNA可能參與調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、器官生長(zhǎng)發(fā)生或系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程；此外還可能參與細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激和有機(jī)物刺激的應(yīng)激過(guò)程，有研究表明O3急性暴露可使神經(jīng)體液因子失調(diào)，這些神經(jīng)體液因子隨循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)全身各處，造成機(jī)體代謝紊亂，Miller DB等人的研究表明O3大多在呼吸道發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生大量應(yīng)激因子和脂質(zhì)代謝物，如IL-6、內(nèi)皮素、纖維蛋白原等，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果表明循環(huán)系統(tǒng)中上述物質(zhì)表達(dá)量顯著升高［8］，而這些物質(zhì)在循環(huán)中的升高可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，造成血栓和動(dòng)脈粥樣硬化［2］。

Tab.3 KEGG analysis for differentially expressed lncRNA after ozone sub-chronic exposure

KEGG分析結(jié)果表明差異性上調(diào)的lncRNA可能主要參與PI3K-Akt信號(hào)通路，有大量研究揭示PI3K-Akt信號(hào)通路在多種心臟疾病和功能損傷等病理進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，該通路的激活可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖，氧化應(yīng)激激活該通路使心肌細(xì)胞凋亡加快［9］，敗血癥誘導(dǎo)的心臟功能障礙中PI3K和Akt去磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞炎癥與凋亡，在心肌肥大的研究中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mRNA信號(hào)通路活化后，可通過(guò)Bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［9，10］。其次，差異性上調(diào)的lncRNA也可能參與調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，脂肪酸氧化分解可產(chǎn)生ATP，在成年心臟中脂肪酸是主要能量代謝物質(zhì)［11］，脂肪酸代謝超過(guò)一定的限度可抑制心臟糖酵解過(guò)程，從而導(dǎo)致能量供給不足，使心臟功能降低，在臨床治療中通常通過(guò)直接增加糖酵解或抑制脂肪酸代謝來(lái)改善心臟功能［12］，實(shí)驗(yàn)證明棕櫚酸酯可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和心肌細(xì)胞死亡相關(guān)基因、蛋白質(zhì)表達(dá)升高［13］，結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以假設(shè)O3暴露可能通過(guò)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激途徑對(duì)心臟造成損傷；近年來(lái)有體外實(shí)驗(yàn)證明lncRNA參與調(diào)控脂肪酸代謝過(guò)程，LINC00473在脂肪細(xì)胞中特異性表達(dá)，該基因的表達(dá)量與線(xiàn)粒體氧化代謝能力相關(guān)，在調(diào)節(jié)脂肪酸解代謝也有重要作用，核lncRNA Blinc1參與調(diào)控生熱脂肪細(xì)胞的發(fā)育，lncBATE10通過(guò)抑制Ppargc1a mRNA基因的表達(dá)使細(xì)胞產(chǎn)熱［14］。

差異表達(dá)下調(diào)的lncRNA可能主要參與氨基酸代謝過(guò)程，心臟可以分泌大量谷氨酸和丙氨酸，有研究表明支鏈氨基酸分解代謝受損使心臟更容易發(fā)生缺血/再灌注損傷，這主要是通過(guò)抑制小鼠體內(nèi)葡萄糖代謝和O-GlcNAc的蛋白修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)的［15］；γ-氨基丁酸主要參與調(diào)節(jié)心血管生理病理進(jìn)程，在慢性心力衰竭患者血中總氨基酸和多種分類(lèi)氨基酸含量均降低，其中天冬氨酸、蛋氨酸和牛黃酸含量與心臟功能衰減程度有正相關(guān)關(guān)系［16］。谷氨酰胺是癌癥細(xì)胞中重要的能量代謝物質(zhì)，lncRNA可調(diào)節(jié)癌癥中谷氨酰胺代謝，如肝內(nèi)膽管癌中l(wèi)ncRNA TUG1表達(dá)升高與該疾病愈后差密切相關(guān)，抑制lncRNA TUG1表達(dá)后谷氨酰胺消耗和能量產(chǎn)生顯著減少，lncRNA EPB41L4A-AS1表達(dá)量降低可使HeLa和HepG2細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的依賴(lài)性增強(qiáng)，同時(shí)加快谷氨酰胺的代謝，在膀胱癌細(xì)胞中抑制lincRNA-p21的表達(dá)也可以使谷氨酰胺代謝加速，而過(guò)表達(dá)lincRNA-p21可抑制癌細(xì)胞增殖［17］。

KEGG分析結(jié)果表明差異性下調(diào)的lncRNA主要參與維生素的調(diào)節(jié)，流行病學(xué)研究和大量實(shí)驗(yàn)研究證明維生素D在心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中有重要作用［18］，25-OH D水平降低可激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)和左心室心肌肥厚，體內(nèi)維生素D不足與心血管疾病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，Zhou等人研究發(fā)現(xiàn)缺乏維生素D可增加人群心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，維生素D水平過(guò)低的患者發(fā)生心臟病的風(fēng)險(xiǎn)更高，而且該人群血壓更高［19］。維生素E是一種重要的脂溶性抗氧化劑，流行病學(xué)研究、體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明維生素E升高可抑制低密度脂蛋白氧化所誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)一步發(fā)展［20］，這為維生素E治療與脂質(zhì)氧化相關(guān)心血管疾病提供重要數(shù)據(jù)支撐。

我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的大量lncRNA可能參與調(diào)節(jié)心臟中能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝，目前對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在心血管疾病中的研究?jī)H是冰山一角，需要深入研究，并且營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充對(duì)疾病的治療在用量和方法上都難以從動(dòng)物試驗(yàn)中推廣到人群實(shí)驗(yàn)中。lncRNA在心臟中的研究在功能和調(diào)控機(jī)制尚未闡述完全，由于ln-cRNA保守性差，因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果向臨床試驗(yàn)外推十分困難，lncRNA在臨床治療方面尚處空白階段，因此對(duì)心臟中l(wèi)ncRNA功能和調(diào)控機(jī)制研究十分必要，而我們的研究對(duì)治療心臟疾病的可能有重大推進(jìn)作用。