干燥綜合征合并特發(fā)性肺纖維化miRNA表達(dá)譜的變化及生物標(biāo)志物的研究*

趙 珊，張 虹，梅 堅(jiān)，畢丹艷

（云南省第一人民醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，650032）

干燥綜合征（Sjogren/s syndrome，SS）是一種慢性和全身性自身免疫性疾病，以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和身體產(chǎn)生水分的外分泌腺（如淚腺和唾液腺）功能的喪失為其定義的表現(xiàn)。它是第二常見的風(fēng)濕性自身免疫性疾病，影響0.5%～1%的普通人群［1］。淚腺和唾液外分泌腺的進(jìn)行性炎癥與功能喪失有關(guān)，導(dǎo)致衰弱的干眼和干嘴。SS與包括腦、肺和肝在內(nèi)的內(nèi)臟器官炎癥增加有關(guān)，并使b細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加44倍［2］。SS可在沒有其他自身免疫性疾?。ㄔl(fā)性SS，PSS）的情況下發(fā)生，或伴有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡甚至可能導(dǎo)致特發(fā)性肺纖維化［3，4］。干燥綜合征合并特發(fā)性肺纖維化病情加劇，伴隨干咳，進(jìn)行性呼吸困難，晚期常因心肺功能衰竭而死亡。有研究［5］對(duì)175例pSS患者進(jìn)行職業(yè)暴露危險(xiǎn)因素調(diào)查，觀察到接觸二氯甲烷、全氯乙烯、氯化溶劑、苯等芳香族溶劑與pSS發(fā)病明顯相關(guān)，提示職業(yè)暴露是pSS的危險(xiǎn)因素。Barragan-Martinez［6］等人報(bào)道了三氯乙烯、苯和芳香族有機(jī)溶劑對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，研究結(jié)果提示暴露在溶劑中會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激的增強(qiáng)，修飾參與上皮細(xì)胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄，這可能是干燥綜合征合并肺纖維化的一種病理分子機(jī)制。

目前，本病的發(fā)病機(jī)制沒有闡明，尚沒有針對(duì)性的藥物治療策略，臨床治療中以對(duì)癥治療和替代療法緩解病情為主。近年來隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，結(jié)合芯片和高通量測(cè)序技術(shù)的不斷革新，為理解各類疾病發(fā)展的分子機(jī)制和病理基礎(chǔ)帶來了無限可能［7］。本研究擬通過芯片檢測(cè)分析干燥綜合征合并特發(fā)性肺纖維化患者血清中miRNA表達(dá)差異，發(fā)掘區(qū)別于原發(fā)性干燥綜合征的潛在生物標(biāo)志物，在臨床中采取針對(duì)性診療策略。本課題經(jīng)云南省第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，納入研究對(duì)象的患者均知曉并簽署知情同意書。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

本研究將樣本分為干燥綜合征組與干燥綜合征合并肺纖維化組，本研究采用NCBI的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO數(shù)據(jù)庫）獲得干燥綜合征及干燥綜合征合并肺纖維化的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。干燥綜合征組3例，干燥綜合征合并肺纖維化患者3例，就診于云南省第一人民醫(yī)院。3例干燥綜合征患者為對(duì)照組，平均年齡為（55.67±4.78）歲，病程為（10.67±1.70）月；3例干燥綜合征合并特發(fā)性肺纖維化患者作為觀察組，平均年齡為（57.67±3.68）歲，病程為（11.00±2.45）月；6例患者均為女性。各組基本臨床資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 血清樣本的RNA提取與基因芯片檢測(cè)miRNA

Agilent Human miRNA Microarray Kit，Release 21.0，8×60K（DesignID：070156）芯片實(shí)驗(yàn)以及6個(gè)樣本的數(shù)據(jù)分析在上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司（上海，中國(guó)）進(jìn)行。芯片上面包含了2 570個(gè)成熟的miRNA。

1.3 miRNA表達(dá)差異分析

采用基于二項(xiàng)分布的DESeq進(jìn)行分析，從差異倍數(shù)和校正后的顯著水平（Padj/q值）兩個(gè)水平進(jìn)行評(píng)估，以q值＜0.01、log2（差異倍數(shù)）＞1.5為篩選條件對(duì)差異miRNAs進(jìn)行篩選。

1.4 qRT-PCR分析

根據(jù)說明書，總RNA反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA作為模板，擴(kuò)增目的基因及內(nèi)參。用Prime Script TMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green Premix Ex TaqTMⅡ定量試劑盒，進(jìn)行miRNA表達(dá)水平驗(yàn)證。反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃5 s，60℃20 s，95℃15 min，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt計(jì)算基因的表達(dá)水平，其中GAPDH作為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 差異基因分析

利用R軟件分析血清樣本miRNA表達(dá)譜，共得到差異表達(dá)基因13個(gè)，包括上調(diào)基因6個(gè)和下調(diào)基因7個(gè)。繪制差異miRNA表達(dá)基因火山圖（圖1）。

Fig.1 Plot of differential miRNA volcanoes between two groups.Red dots indicate significantly up-regulated expression（log2-fold change＞1，P＜0.05）compared to miRNAs from two groups of serum samples，blue dots indicate significantly down-regulated expressed genes（log2-fold change＜-1，P＜0.05），and gray dots indicate nonsignificant differences.The vertical coordinate represents the adjusted P-value（Padj），the smaller the adjusted Pvalue，the more significant the difference and the larger the corresponding-log10（Padj）value.Thus，the dots in the upper left and upper right corners indicate down-regulated and up-regulated genes，respectively，with highly significant differences

2.2 靶基因預(yù)測(cè)

分別選取上調(diào)最明顯的6個(gè)miRNA：hsa-miR-6740-5p，hsa-miR-4507，hsa-miR-6775-5p，hsa-miR-4281，hsa-miR-4459，hsa-miR-6089和下調(diào)的7個(gè)miRNA：hsa-miR-6873-3p，hsamiR-4290，hsa-miR-6858-3p，hsa-miR-574-3p，hsa-miR-92b-3p，hsa-miR-3151-3p，hsa-miR-6886-3p，使用miRDB和miRWalk在線預(yù)測(cè)工具，對(duì)差異miRNA進(jìn)行潛在的靶基因預(yù)測(cè)分析，交互得到363個(gè)下游靶基因（圖2）。

Fig.2 Possible target genes of differential miRNAs screened by two online prediction tools，miRWalk and miRDB

2.3 KEGG和GO富集分析

GO分析：在生物過程方面，主要富集與細(xì)胞代謝過程、細(xì)胞生長(zhǎng)過程的調(diào)節(jié)、上皮細(xì)胞增殖等過程。在細(xì)胞組成方面主要富集于細(xì)胞質(zhì)膜、染色質(zhì)、受體復(fù)合物等細(xì)胞成分中［8］。分子功能方面主要富集與轉(zhuǎn)錄輔助因子活性、氨基多糖結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞粘附分子結(jié)合等分子功能。KEGG分析顯示主要集中于PI3K、AKT信號(hào)通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、乙型肝炎等信號(hào)通路。結(jié)果顯示wnt信號(hào)通路差異明顯，是特發(fā)性肺纖維化的關(guān)鍵信號(hào)通路（圖3，4）。

Fig.3 GO enrichment analysis

Fig.4 KEGG enrichment analysis

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證表達(dá)有差異的miRNA在血清中的表達(dá)水平

根據(jù)差異倍數(shù)，我們選擇差異最明顯的前五個(gè)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如表1所示，miRNA在兩組血清樣品中的表達(dá)趨勢(shì)與芯片檢測(cè)所得表達(dá)趨勢(shì)一致，且與干燥綜合征組比較，干燥綜合征合并肺纖維化組血清中miR-6886-3p，miR-6873-3p，miR-574-3p表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相反的，miR-6740-5p和miR-4507在干燥綜合征合并肺纖維化組中表達(dá)上調(diào)，差異明顯（P＜0.05）。

Tab.1 The relative expressions of miRNA in the serum were detected by RT-qPCR analysis（±s，n=3）

Tab.1 The relative expressions of miRNA in the serum were detected by RT-qPCR analysis（±s，n=3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs desiccation syndrome（PSS）

Group PSS PSS+IPF miR-6886-3p 1.472±0.867 0.088±0.100*miR-6873-3p 0.950±0.551 0.080±0.053*miR-574-3p 3.269±1.037 0.229±0.045**miR-6740-5p 1.889±0.878 9.861±6.284*miR-4507 1.122±1.174 5.702±3.349*

3 討論

干燥綜合征是一種自身免疫性疾病，而非口干。眼干的單一性疾病。目前，診斷及用藥治療策略尚缺少循證醫(yī)學(xué)證據(jù)佐證，臨床中更多地為經(jīng)驗(yàn)性用藥［9，10］。miRNA可以與下游靶基因結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制靶基因的表達(dá)。通常一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，而一個(gè)靶基因可能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，共同組成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［11］。我們從多靶點(diǎn)，多通路的研究角度出發(fā)，深入探究干燥綜合征及特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病機(jī)制及其潛在的治療靶點(diǎn)，探討特異性miRNA在診斷干燥綜合征及特發(fā)性肺纖維化中的具有重要意義。

miRNA芯片檢測(cè)技術(shù)具有高通量［12-14］，靈敏性好，樣本需求低等特點(diǎn)。目前也應(yīng)用于多種復(fù)雜疾病的診斷與新藥研發(fā)。本研究借助miRNA芯片，成功篩選出干燥綜合征合并特發(fā)性肺纖維化疾病相關(guān)的13個(gè)差異miRNA。和干燥綜合征比較，合并特發(fā)性肺纖維化患者血清中hsa-miR-6740-5p，hsa-miR-4507，hsa-miR-6775-5p，hsa-miR-4281，hsa-miR-4459，hsa-miR-6089表 達(dá) 上 調(diào)，hsa-miR-6873-3p，hsa-miR-4290，hsa-miR-6858-3p，hsa-miR-574-3p，hsa-miR-92b-3p，hsamiR-3151-3p，hsa-miR-6886-3p表達(dá)下調(diào)。此外，對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果提示W(wǎng)nt信號(hào)通路和細(xì)胞衰老的相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控與肺纖維化有密切關(guān)系。有報(bào)道稱Wnt信號(hào)通路是通過細(xì)胞表面受體將信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用［15，16］。因此Wnt信號(hào)通路已經(jīng)成為抑制纖維化的潛在靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)［17］Lrp5缺失小鼠影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路，減弱博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。李［18］等發(fā)現(xiàn)CGRP可以抑制eIF3a上調(diào)p27的表達(dá)，抑制肺成纖維細(xì)胞從而抑制肺纖維化的發(fā)展。Tao等［19］也發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)ZD7可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺纖維化，并且能夠通過Wnt信號(hào)通路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與組織纖維化的調(diào)節(jié)。此外，田［20］等證實(shí)益氣化瘀化痰方可以通過下調(diào)TGF-β1，調(diào)控的TGFβ/Snail信號(hào)軸，減緩博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化損傷。我們芯片檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了Wnt信號(hào)通路涉及的分子可能是干燥綜合癥合并特發(fā)性肺纖維化的關(guān)鍵標(biāo)志物，這對(duì)于特發(fā)性肺纖維化的診斷及潛在的新藥研發(fā)具有指導(dǎo)意義。此外，有報(bào)道證實(shí)有機(jī)溶劑與自身免疫性疾病有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和干燥綜合征等［21］。干燥綜合征作為一種自身免疫性疾病，職業(yè)暴露尤其是苯等芳香族有機(jī)溶劑，有加劇職工免疫系統(tǒng)紊亂的風(fēng)險(xiǎn)，誘發(fā)自身免疫功能失衡，因此關(guān)鍵生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對(duì)臨床早期診斷和治療職業(yè)暴露誘發(fā)的肺纖維化具有重大意義。

綜上所述，本研究利用基因芯片研究干燥綜合征合并特發(fā)性肺纖維化的差異表達(dá)miRNAs及下游信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)干燥綜合征合并特發(fā)性肺纖維化患者血清中存在13個(gè)差異miRNA，wnt信號(hào)通路在特發(fā)性纖維化病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些差異miRNAs和wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白均可能是特發(fā)性纖維化臨床診斷和新藥研發(fā)的標(biāo)志物，其為肺纖維化治療策略提供了理論支持，也為治療肺纖維化相關(guān)的職業(yè)病提供指導(dǎo)性意見。在治療肺纖維化等職業(yè)病的新藥研發(fā)中，高度特異miRNAs也可能成為新的藥物靶點(diǎn)，也為我們后續(xù)深入研究職業(yè)暴露誘發(fā)干燥綜合征合并肺纖維化確定了研究方向。