基于網(wǎng)絡藥理學分析芪貞元丹治療動脈粥樣硬化的作用機制*

李林芳，呂鑫鈺，邱玉玲，孔德新△

（1.天津市天津醫(yī)院藥學部，天津 300200；2.天津醫(yī)科大學藥學院臨床藥學系，天津 300070；3.天津天獅學院醫(yī)學院，天津 301700）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）所導致的心腦血管疾病是全球范圍內(nèi)位居前列的死亡原因之一［1］。近年來，AS發(fā)生率呈逐年增加態(tài)勢，發(fā)病群體也越來越年輕化。

AS的病理過程相當復雜，大量泡沫細胞死亡而裂解成纖維帽，不穩(wěn)定的斑塊碎裂，進而阻塞管腔［2］，導致動脈瘤、冠心病、腦梗死等并發(fā)癥，危害人類健康［3］。

針對動脈粥樣硬化臨床表現(xiàn)和特點，中醫(yī)理論體系將之歸為“胸痹”、“眩暈”、“中風”、“脈痹”等證，近年來有關于“毒邪致病”的理論報道［4］。中醫(yī)藥界在此基礎上辯證論治，把防治AS的常見中藥總結(jié)為如下幾種：清熱解毒類、補益類、活血化瘀類。芪貞元丹是一個用于治療高血脂和動脈粥樣硬化的臨床驗方，含黃芪、女貞子、延胡索與丹參，其中黃芪與女貞子為補益組分，補益正氣，增強體質(zhì)，抵御外邪；延胡索和丹參為活血組分，通利血脈、促進血行、消散瘀血。補益組分中黃芪為補氣要藥，適用于補氣升陽，固表止汗，行滯通痹，托毒排膿等；女貞子為補陰藥，用于滋補肝腎，明目烏發(fā)?；钛M分中的延胡索為活血鎮(zhèn)痛藥，用于活血，行氣，鎮(zhèn)痛；丹參是活血涼血藥，用于活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰。

經(jīng)過文獻挖掘研究表明，黃芪可以提高人外周血管內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的增殖、增強其遷移能力、黏附能力［5］；女貞子能降低實驗動物血清中的膽固醇和甘油三酯水平，從而消減AS斑塊，并降低AS發(fā)生率［6］；延胡索則對實驗動物動-靜脈旁路誘發(fā)的血栓有抑制作用［7］；丹參能減少動脈粥樣硬化的實驗動物主動脈血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達［8］等。大量實驗研究為芪貞元丹治療AS提供佐證，但中藥復方化學成分復雜，芪貞元丹是如何協(xié)同多成分、多靶點、多途徑對抗AS的，仍需進一步探討。

本研究利用網(wǎng)絡藥理學研究手段具有整體性、系統(tǒng)性的這一特征，并結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)學的辨證論治理論，進一步發(fā)掘芪貞元丹組方治療AS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、UniProt數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.uniprot.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、GeneCards（www.genecards.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、STRING數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）、Cytoscape3.8.0軟件、Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）。

1.2 芪貞元丹初選化學成分和靶點的篩選

運用數(shù)據(jù)庫TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲取芪貞元丹復方中四味中藥全部化學成分，以OB≥30%和DL≥0.18為標準進行篩選，得到的化學成分可能具有對抗AS的作用，作為芪貞元丹復方的初選化學成分，并查詢初選化學成分所對應的靶點蛋白名。

1.3 藥物靶點的標準化

在UniProt數(shù) 據(jù) 平 臺（https：//www.uniprot.org/）上檢索芪貞元丹靶點蛋白名，校正物種來源為Human，將蛋白名進行基因名標準化。

1.4 AS疾病靶點的預測

運用OMIM（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)、和TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，以疾病名稱“atherosclerosis”搜索，分別刪除重復項，以Excel形式存檔備用；運用GeneCards（www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，以疾病名稱“atherosclerosis”搜索，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中“relevance score”得分排序，選取與AS相關性較大的前1 000個靶點進行研究，以Excel形式存檔備用，三個數(shù)據(jù)庫所得數(shù)據(jù)截止時間為2020年7月，將三個數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)果合并后再次刪除重復項，獲取與AS相關的疾病靶點。

1.5 芪貞元丹治療AS的作用靶點預測

利用Venny2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）對1.3和1.4所得數(shù)據(jù)求交集，獲得芪貞元丹-AS共同靶點，作為作用靶點。

1.6 “藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡的構建

1.5中作用靶點所對應的初選化學成分，為最終對抗AS的活性成分，將活性成分、作用靶點分別以Excel形式存檔，整理好對應關系，導入Cytoscape 3.8.0軟件，構建“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡圖。

1.7 芪貞元丹治療AS的作用靶點PPI網(wǎng)絡的構建

利用STRING數(shù)據(jù)平臺對芪貞元丹治療AS的作用靶點進行PPI網(wǎng)絡作用分析，物種限定為“Homo sapiens”，置信度分值為0.4，用Cytoscape 3.8.0進行可視化分析。

1.8 GO功能分析與KEGG通路富集分析

將作用靶點上傳至Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）數(shù)據(jù)庫，篩選要求是Log10（P）＜0.1，并把GO生物過程和KEGG信號通路按P-Value［-Log10（P）］值大小排序，選取數(shù)值較大的前20位。

1.9 “活性成分-作用靶點-KEGG信號通路”網(wǎng)絡構建

建立“活性成分-作用靶點-KEGG通路”網(wǎng)絡。以電子表格的形式上傳至Cytoscape3.8.0進行網(wǎng)絡可視化。

2 結(jié)果

2.1 芪貞元丹活性成分的篩選

檢索得到：黃芪的初選化學成分20個、女貞子的初選化學成分13個、延胡索的初選化學成分49個、丹參的初選化學成分65個，合并重復成分后共獲得143個初選化學成分，再輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫后，共獲得271個藥物靶點，其中，有255個靶點通過UniProt數(shù)據(jù)平臺成功轉(zhuǎn)換為基因名。

2.2 疾病靶點的篩選

利用OMIM（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)、GeneCards（www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)和TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，以疾病名稱“atherosclerosis”為關鍵詞進行檢索，OMIM檢索到AS疾病靶點484個，GeneCards篩選得到AS疾病靶點1 000個，TTD檢索到AS疾病靶點22個，合并后去掉重復項后共獲得1364個疾病靶點。

2.3 藥物治療AS作用靶點的預測

利用Venny 2.1繪制韋恩圖，得到芪貞元丹與AS共有靶點蛋白共118個，作為芪貞元丹組方治療AS的作用靶點（圖1）。

2.4 “藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡的構建

在“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡中，共包含245個節(jié)點，1 501條邊，其中，代表藥物的節(jié)點4個，代表活性成分的節(jié)點123個，代表作用靶點的節(jié)點118個。藥物、活性成分、作用靶點之間通過“邊”相關聯(lián)，黃芪中的14個活性成分與103個作用靶點相關聯(lián)，女貞子中的8個活性成分與97個作用靶點相關聯(lián)，延胡索中49個活性成分與103個作用靶點相關聯(lián)，丹參中56個活性成分與64個作用靶點相關聯(lián)，復方中每個活性成分平均作用于11.20個作用靶點，每個作用靶點關聯(lián)的活性成分為5.04個，表明藥物的活性成分與作用靶點之間存在著一對多的對應關系，而作用靶點也同時存在于多個活性成分中?；钚猿煞种心鞠菟貫榈?、女貞子所共有，槲皮素為黃芪、女貞子、延胡索所共有，山奈酚為黃芪、女貞子所共有，并且通過計算Degree值，可知這三種活性成分相關聯(lián)的作用靶點最多，見表1（Degree值前十位），表明這三種活性成分具有關鍵作用。

Fig.1 Venn diagram of targets of herbs and diseaseTab.1 The key active ingredients in QiZhenYuanDan and their Degree values

2.5 藥物治療AS作用靶點PPI網(wǎng)絡的構建

將118個作用靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫平臺，以收集蛋白互作關系相關數(shù)據(jù)，然后通過Cytoscape 3.8.0軟件繪制PPI網(wǎng)絡圖，并通過Degree值調(diào)節(jié)節(jié)點大小（圖2）。節(jié)點圖形越大，表示與之產(chǎn)生互作關系的的靶點越多，邊越粗，表示靶點蛋白之間的相互作用越強。

Fig.2 PPI network of active targets

根據(jù)度值排序，選取排在前十位的靶點，見表2，再次運用Cytoscape 3.8.0構建PPI網(wǎng)絡，這十個靶點可能為芪貞元丹組方治療AS的關鍵靶點（圖3）。

2.6 GO生物過程和KEGG通路富集分析

利 用Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）數(shù)據(jù)平臺，分析芪貞元丹-AS作用靶點的GO生物過程和KEGG信號通路富集過程。

Tab.2 Top 10 targets of degree in PPI network

Fig.3 PPI network of key targets

將118個作用靶點上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫，然后依次進行GO Biological Processes（生物過程）、GO Cellular Components（細胞組成）、GO Molecular Functions（分子功能）分析，根據(jù)P-Value［-Log10（P）］值由大至小的排序，最后選取前20個GO生物過程分析條目，并將其上傳至易漢博生物信息平臺（http：//www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/GOenrichmentplot.html）進行數(shù)據(jù)可視化處理（圖4）。GO分析結(jié)果提示芪貞元丹治療AS的作用靶點顯著富集在對無機化合物的反應、對脂多糖的反應、對有毒物質(zhì)的反應、細胞對脂質(zhì)的反應等生物過程中（圖4A）；分子功能主要在細胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構域特異性結(jié)合等過程中有所體現(xiàn)（圖4B）；在細胞組成中膜筏、囊泡、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復合物、受體復合物、細胞外基質(zhì)等占比最大（圖4C）。

同樣，共獲得155條KEGG信號通路，根據(jù)PValue［-Log10（P）］值從大到小的順序，選取前20個KEGG信號通路上傳至易漢博生物信息平臺，得到KEGG的氣泡圖（圖5）。分析氣泡圖顯示，KEGG顯著富集在細胞流體切應力與動脈粥樣硬化等疾病相關信號通路以及磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）等信號通路上。富集結(jié)果表明，芪貞元丹可能通過上述信號通路發(fā)揮治療作用。

2.7 “活性成分-作用靶點-KEGG信號通路”網(wǎng)絡構建

經(jīng)整理，將“藥物活性成分-作用靶點-KEGG信號通路”互作關系對應匹配，上傳至Cytoscape 3.8.0軟件可視化，網(wǎng)絡圖表明，芪貞元丹組方中各活性成分通過“多靶點、多信號通路”協(xié)同互作發(fā)揮治療AS的作用。

3 討論

中醫(yī)藥由于具有整體調(diào)節(jié)、多靶優(yōu)效和毒副作用小等優(yōu)勢被廣泛應用于AS相關科研與臨床實踐工作中。網(wǎng)絡藥理學的分析結(jié)果表明，芪貞元丹治療AS的活性成分主要有10個，分別為槲皮素、山奈酚、木犀草素、芒柄花素、丹參酮ⅡA、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、異鼠李素、二氫丹參內(nèi)酯、丹參新醌D、4-亞甲丹參新酮。槲皮素可通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt、NF-κB p65等信號通路抑制細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達，改善血管內(nèi)皮細胞功能，降低AS中的炎癥反應，延緩AS過程［9］。山奈酚可減少巨噬細胞衍生趨化因子（macrophage derived chemokine，MDC）、干擾素誘導蛋白-10（interferon induced protein-10，IP-10）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等炎癥因子形成，抑制炎癥的發(fā)生［10］；降低動脈血中ICAM-1、VCAM-1、整合蛋白、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）等黏附分子的基因水平和蛋白水平，抑制MAPK信號通路，降低血管炎癥反應，具有防止AS發(fā)生的潛在功能［11］。木犀草素可以降低臭氧和活性氮類成分的合成，從而影響花生四烯酸的代謝和炎性相關通路的表達［12］，同時可以降低的白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、IL-6等炎癥因子的形成，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平［13］，發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用。這幾種活性成分在芪貞元丹復方抗AS過程中發(fā)揮重要作用。由此可知，芪貞元丹可能是通過其活性成分與靶點、信號通路交互作用，降低AS中的炎癥反應，延緩AS發(fā)病進程的。

Fig.4 Visualization results of GO pathway enrichment

Fig.5 Visualization results of KEGG signaling pathway

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡研究結(jié)果表明，芪貞元丹可能是通過IL-6、蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等藥物-疾病共有靶點發(fā)揮治療AS作用。白細胞介素-6基因名為IL-6，T細胞、上皮細胞、B細胞及血管內(nèi)皮細胞等都能分泌IL-6，在AS的發(fā)病過程中，IL-6主要參與機體的各種炎癥反應［14］。VEGFA可通過作用于炎性細胞和內(nèi)皮細胞間接參與瘢痕的生成，也可作用于人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblast，HSF）直接參與到瘢痕的生成［15］。此外，靶點蛋白互作過程還可能與多種脂蛋白及血管內(nèi)皮炎性因子等相關，如AKT1、TNF、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）等，而AS發(fā)病過程又與脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應等相關，證明芪貞元丹作為中藥復方，其成分復雜性的特點，使其能通過多分子、多靶點、多途徑相互作用發(fā)揮抗AS的效果。

結(jié)合GO生物過程分析和KEGG富集分析的結(jié)果提示，芪貞元丹治療AS，是多種復雜的生物過程富集在不同信號通路上，各通路共同作用產(chǎn)生的結(jié)果。結(jié)果顯示有PI3K-Akt、NF-κB、HIF-1等信號通路和炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）通路等，這些通路都能影響脂代謝、炎癥反應、調(diào)節(jié)細胞凋亡等過程。PI3K-Akt信號通路在細胞中廣泛存在，磷酸化活化后，誘發(fā)第二信促使AKT磷酸化，磷酸化AKT可以促增殖、抗凋亡，并且能夠抑制氧化應激［16］。NF-κB信號通路與機體免疫及炎癥反應的關系密切。NF-κB作為一種蛋白復合物，是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其主要亞型是P50和P65，即NF-κB1和Rel A，通過TNF-α、IL-1、脂多糖（Lipopo-lysaccharide，LPS）等刺激因子的活化，誘導多種相關基因的表達，產(chǎn)生多種細胞因子參與炎癥反應［17，18］。HIF-1信號通路是一條重要的信號通路，在集體對低氧代償?shù)谋姸嗾{(diào)節(jié)機制中，HIF-1作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在生理和病理條件下，能夠調(diào)整多種基因的表達，在機體低氧和缺血的狀態(tài)下發(fā)揮保護作用，從而降低心肌酶活性，改善心肌組織形態(tài)，抑制心肌細胞死亡，降低心梗面積，改善心肌缺陷再灌損傷效果［19］。此外，KEGG富集結(jié)果中Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、Transcriptional misregulation in cancer等癌癥相關通路富集較高。有研究表明，內(nèi)皮損傷反應可能是腫瘤與AS發(fā)生的共同誘因，腫瘤細胞浸潤血管內(nèi)皮，損傷血管內(nèi)皮細胞，當血管內(nèi)皮受損后，釋放組織因子（tissue factor，TF），促進局部血栓形成。同時，腫瘤細胞還能激活凝血系統(tǒng)，致凝血和纖溶功能的異常，凝血活性亢進，外周血中D-二聚體升高，如肺癌、直腸癌、肝癌、卵巢癌等，使患者發(fā)生深靜脈血栓的風險增加［20］。同時結(jié)果顯示，與Malaria、Inflammatory bowel disease等信號通路的相關性，提示瘧疾、炎性腸病可能與AS的某些信號通路可能是共通的，有共同的致病誘因，也提示我們在研究其抗AS作用的同時應留意可能產(chǎn)生的副作用。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡藥理學角度，分析芪貞元丹治療AS是多成分—多靶點—多途徑協(xié)同作用的過程。結(jié)果表明，該復方中的槲皮素、山奈酚、木犀草素等活性成分作用于IL-6、PI3K-Akt、VEGFA等靶點，通過抗細胞凋亡、抑制氧化應激、抑制炎癥反應等發(fā)揮抗AS作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突