外源性硫化氫對家兔內(nèi)毒素休克誘發(fā)肺動脈高壓的干預(yù)作用*

郭 贊，劉宜先，齊 杰，羨曉輝，黃新莉△

（1.河北醫(yī)科大學(xué)生理教研室，2.病理生理教研室，石家莊 050017）

內(nèi)毒素休克（endotoxic shock，ES）是常見的臨床危重病癥，血管反應(yīng)性改變是其重要的病理生理特征，其中早期肺循環(huán)壓力的升高，甚至發(fā)生肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PAH）是ES時(shí)急性肺損傷的早期表現(xiàn)，也是導(dǎo)致休克難以治療的重要因素之一［1］。目前對ES誘發(fā)PAH發(fā)病機(jī)制的研究已深入到細(xì)胞、亞顯微結(jié)構(gòu)和分子水平，但其具體機(jī)制仍未充分闡明。因此，探討如何防治ES時(shí)PAH的形成及其機(jī)制已成為該領(lǐng)域重要的研究課題。

繼一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化碳（carbon monoxide，CO）之后，硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）作為第三種內(nèi)源性氣體信號分子引起了人們的關(guān)注。研究證實(shí)，H2S也具有舒張血管的作用［2］。以往本室在離體水平上的研究結(jié)果表明，H2S可能參與內(nèi)毒素血癥大鼠主動脈反應(yīng)性改變的調(diào)節(jié)，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H2S生成減少可能導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥大鼠PAH的發(fā)生，但其具體機(jī)制尚未完全闡明［3］。其他學(xué)者的研究顯示［4-6］，內(nèi)源性H2S在慢性阻塞性肺疾病患者PAH、缺氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）及休克大鼠的血管張力調(diào)節(jié)中均發(fā)揮重要作用。以往相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道就H2S對肺動脈高壓的影響及其機(jī)制多為探討內(nèi)源性的H2S的作用，有關(guān)外源性的H2S對肺動脈高壓的影響及其機(jī)制多為離體實(shí)驗(yàn)，在整體水平，外源性H2S對ES時(shí)PAH有何影響及其機(jī)制尚不十分清楚。本研究旨在通過頸靜脈注射大劑量細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）建立家兔ES模型，在整體水平上探討預(yù)先給予外源性H2S供體是否能夠緩解LPS誘發(fā)肺循環(huán)的紊亂，逆轉(zhuǎn)PAH的發(fā)生。并通過觀察上述過程中家兔肺動脈反應(yīng)性，以及肺動脈壁結(jié)構(gòu)的改變，以期為進(jìn)一步闡述外源性H2S對LPS誘發(fā)ES家兔血流動力學(xué)紊亂的治療作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

大腸桿菌LPS（E.coli，0111：B4）、硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS，H2S供體）、苯腎上腺素（phenylephrine，PE，α1腎上腺素受體激動劑）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）及消炎痛（indomethacin，Indo）均購自美國Sigma公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 復(fù)制ES家兔模型及分組設(shè)計(jì)

成年雄性新西蘭大耳白家兔32只，體重（2.1±0.1）kg，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心。經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射25%烏拉坦（1 g/kg）實(shí)施全身麻醉后，立即將家兔仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)操作臺上。常規(guī)消毒后，行頸部正中切口，氣管插管，鈍性分離左側(cè)頸總動脈后插入導(dǎo)管（PE-50，Intramedic，New York，NY，內(nèi)充滿肝素），連接多導(dǎo)生理信號記錄儀MP150（美國Biopac公司）用以記錄平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）；鈍性分離右側(cè)頸外靜脈，經(jīng)耳緣靜脈注射肝素（1 250 U/kg，i.v.）抗凝后，經(jīng)右心室插入導(dǎo)管至肺動脈入口處（根據(jù)顯示屏上壓力波形可判斷肺動脈導(dǎo)管的位置），連接多導(dǎo)生理信號記錄儀MP150用以監(jiān)測平均肺動脈壓（mean pulmonary arterial pressure，MPAP）。動物穩(wěn)定15 min后，經(jīng)頸靜脈導(dǎo)管彈丸式注射藥物并實(shí)時(shí)連續(xù)監(jiān)測MAP和MPAP，直至給藥后5 h。家兔按數(shù)字表法隨機(jī)分為4組（n=8）：（1）溶劑對照組：注入生理鹽水（0.8 ml/kg，i.v.）；（2）LPS組：緩慢（10 min）經(jīng)頸靜脈注射LPS（8 mg/0.8 ml/kg）；（3）LPS+NaHS組：腹腔注射NaHS（28μmol/kg）后15 min再注入LPS；（4）NaHS組：腹腔注射NaHS（28μmol/kg）。每次靜脈給藥后再緩慢注入2 ml生理鹽水沖管。各組于給藥后5 h進(jìn)行下列觀察。

1.3 離體兔肺動脈環(huán)（PARs）的制備

上述各組實(shí)驗(yàn)動物放血處死后，參照文獻(xiàn)［7，8］報(bào)道的方法制備PARs：快速聯(lián)合取出心肺置于4℃并通有混合氣（95%O2+5%CO2）的改良Krebs液中。仔細(xì)分離肺動脈，將血管周圍組織去除干凈，剪成3 mm寬的肺動脈環(huán)，注意避免損傷肺動脈內(nèi)皮。

1.4 離體PARs的張力檢測

參照文獻(xiàn)［8］報(bào)道的方法，將血管環(huán)垂直懸掛于盛有6 ml Krebs液（含10μmol/L的Indo以消除環(huán)氧酶產(chǎn)物作用）的恒溫浴槽中（37℃），并持續(xù)通入混合氣（95%O2+5%CO2）。血管環(huán)一端固定于浴槽底部，另一端連接張力換能器（T-1型）。從0 g開始，每隔5 min使PARs張力增加0.5 g，直至最適張力2 g。PARs在2 g基礎(chǔ)張力下平衡1 h，每隔15 min換1次液。然后用1×10-6mol/L PE和1×10-6mol/L ACh檢測PARs的反應(yīng)性及內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，確認(rèn)其反應(yīng)性穩(wěn)定及內(nèi)皮細(xì)胞完整后，每組選用8個(gè)PARs用于實(shí)驗(yàn)（1個(gè)環(huán)/家兔）。首先用1×10-6mol/L PE預(yù)收縮PARs，記錄預(yù)收縮值PEAX，收縮達(dá)平臺后觀察PARs對1×10-6mol/L ACh的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將肺動脈環(huán)烘烤（溫度為60～70℃）至恒重，稱量每個(gè)肺動脈環(huán)的干重。收縮反應(yīng)用克張力/毫克干重（g tension/mg dw）表示，舒張反應(yīng)結(jié)果用占1×10-6mol/L PE收縮值的百分比表示。

1.5 肺動脈組織形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，迅速留取家兔肺動脈，立刻置于事先已經(jīng)準(zhǔn)備好的4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成5μm厚切片，常規(guī)HE染色，進(jìn)行光鏡觀察。另取家兔肺動脈，采用2.5%戊二醛固定，常規(guī)制備掃描電鏡標(biāo)本，進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 NaHS對ES發(fā)生過程中PAH的影響

與對照組家兔MAP比較，LPS組家兔MAP呈持續(xù)性降低，0.5 h時(shí)顯著低于對照組（P＜0.01）；1 h時(shí)為（80.10±2.93）mmHg，2 h時(shí)降到更低水平（61.80±3.60）mmHg，一直維持到5 h，均顯著低于對照組（P均＜0.01，表1）。在5 h的實(shí)驗(yàn)中，對照組家兔MPAP維持在（25.65±2.03～21.38±1.57）mmHg的范圍內(nèi)。與對照組相比，LPS組家兔MPAP迅速升高，0.5 h達(dá)高峰，顯著高于同時(shí)間點(diǎn)對照組（P＜0.01）；1 h后MPAP（（34.43±1.58）mmHg，P＜0.01）和1.5 h后MPAP（（30.90±1.80）mmHg，P＜0.05）稍下降，但均顯著高于對照組；2 h后MPAP仍高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組相比，LPS+NaHS組雖然在最初的1 h內(nèi)MPAP仍表現(xiàn)為升高，但1 h后開始下降且在1.5 h時(shí)間點(diǎn)下降接近對照組。與LPS組相比，LPS+NaHS組家兔MPAP在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低（P均＜0.05）。與對照組相比NaHS組家兔各時(shí)間點(diǎn)的MPAP無明顯變化（表2）。

Tab.1 Effects of NaHSon changes in mean arterial pressure（MAP）induced by LPSin rabbits（mmHg，±s，n=8）

Tab.1 Effects of NaHSon changes in mean arterial pressure（MAP）induced by LPSin rabbits（mmHg，±s，n=8）

LPS：Lipopolysaccharides；NaHS：Sodium hydrosulfide **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPSgroup

Group 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 3 h 4 h 5 h Control 102.11±4.88 102.38±4.23 95.48±5.63 90.53±4.73 90.98±4.23 94.50±3.91 93.52±3.98 89.63±3.89 LPS 99.53±2.62 80.93±3.23**80.10±2.93**66.52±3.01**61.80±3.60**60.07±3.61**59.11±3.12**60.75±3.67**LPS+NaHS 100.50±3.75 85.81±5.93#85.73±3.98#81.35±4.95#81.60±4.72##84.02±6.15##80.02±5.36*##77.63±5.04##NaHS 98.78±4.58 96.54±3.90 91.88±3.92 90.00±3.98 91.28±3.56 97.51±4.13 96.35±3.68 97.50±3.57

Tab.2 NaHSreverses pulmonary arterial hypertension induced by LPSin rabbits（mmHg，±s，n=8）

Tab.2 NaHSreverses pulmonary arterial hypertension induced by LPSin rabbits（mmHg，±s，n=8）

LPS：Lipopolysaccharides；NaHS：Sodium hydrosulfide *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPSgroup

Group 0 h 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 3 h 4 h 5 h Control 25.65±2.03 26.40±2.70 25.43±2.40 24.64±2.33 23.03±1.88 23.18±1.87 21.38±1.57 21.68±2.48 LPS 27.23±1.20 37.88±2.55**34.43±1.58**30.90±1.80*27.91±1.73 37.68±1.74 28.21±2.58 27.60±2.10 LPS+NaHS 28.43±2.19 30.83±1.56 28.28±2.17 23.48±1.88#21.64±1.83#22.21±1.81#21.56±2.03#21.38±1.96#NaHS 27.90±3.06 25.50±3.57 26.10±2.70 21.38±1.80 21.98±1.57 20.77±1.42 20.03±1.85 20.40±1.72

2.2 NaHS對ES時(shí)PARs張力變化的影響

與對照組相比，LPS組家兔PARs對α1腎上腺素受體激動劑PE的收縮反應(yīng)張力顯著增高（P＜0.01）；與LPS組相比，LPS+NaHS組家兔PARs對PE的收縮反應(yīng)顯著降低（P＜0.05），并接近對照組水平；與對照組相比，NaHS組家兔PARs對PE的收縮反應(yīng)無顯著差異（表3）。

與對照組家兔相比，LPS組家兔PARs對Ach的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)顯著降低（P＜0.01）；與LPS組相比，LPS+NaHS組家兔PARs對ACh內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)顯著增高（P＜0.05）；與對照組相比，NaHS組家兔PARs對ACh內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)無顯著差異（表3）。

Tab.3 Comparison of contraction response to PE and endothelium-dependent relaxation response to ACh in rat pulmonary artery（±s，n=8）

Tab.3 Comparison of contraction response to PE and endothelium-dependent relaxation response to ACh in rat pulmonary artery（±s，n=8）

LPS：Lipopolysaccharides；NaHS：Sodium hydrosulfide **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group

Group Contraction（g tension/mg·d·w） Relaxation（%）Control 2.62±0.56 86.19±7.28 LPS 4.07±0.63** 67.41±3.45**LPS+NaHS 3.09±0.41# 81.36±5.57#NaHS 2.55±0.47 85.26±8.04

2.3 NaHS對ES時(shí)肺動脈組織形態(tài)學(xué)的影響

2.3.1 光鏡觀察 HE染色后在光鏡下觀察，正常對照組家兔肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)連續(xù)，內(nèi)皮下彈力纖維完整，平滑肌層排列整齊；LPS組家兔部分肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)皮下彈力纖維斷裂，平滑肌層結(jié)構(gòu)紊亂；與LPS組相比，LPS+NaHS組家兔肺動脈壁各層的損傷明顯減輕；NaSH組家兔各層肺動脈壁結(jié)構(gòu)未見顯著變化（圖1）。

Fig.1 Microphotographs showing structural changes in pulmonary artery of rabbits（HE ×400）

2.3.2 掃描電鏡觀察 LPS組家兔肺動脈組織在掃描電鏡下的病理改變表現(xiàn)為部分內(nèi)皮細(xì)胞缺失；LPS+NaHS組肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)接近對照組，僅可見細(xì)胞間隙稍增寬，未見細(xì)胞脫落。NaSH組家兔肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見顯著變化（圖2）。

Fig.2 Microphotographs showing structural changes in pulmonary artery of rabbits（HE ×400）

3 討論

ES是由于感染所導(dǎo)致的以機(jī)體血流動力學(xué)紊亂為特征的臨床危重癥，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)，靜脈注射大劑量LPS后，家兔出現(xiàn)MAP呈持續(xù)性降低，標(biāo)志成功建立家兔ES模型。而ES家兔MPAP迅速升高，0.5 h達(dá)高峰，顯著高于同時(shí)間點(diǎn)對照組；1 h和1.5 h后MPAP稍下降，但均顯著高于對照組；2 h后MPAP仍高于對照組。在LPS誘導(dǎo)MAP顯著降低的同時(shí)，MPAP出現(xiàn)早期增高而晚期下降的改變，MPAP顯著增高可引發(fā)肺水腫乃至呼吸衰竭。合并與不合并MPAP升高的呼吸障礙患者相比，前者的死亡率明顯高于后者［9，10］，因此及時(shí)有效地糾正ES早期肺循環(huán)紊亂對于防治ES具有重要意義。

以往的研究［11-13］顯示，H2S是繼NO、CO之后的第三種內(nèi)源性的氣體信號分子，近些年越來越引人關(guān)注。由于其高脂溶性，故能夠自由穿過生物膜，可有效舒張血管，調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激或抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以及具有抗炎作用等。內(nèi)源性H2S的供體硫氨基酸主要通過酶促反應(yīng)產(chǎn)生H2S，而NaHS是外源性H2S供體，因?yàn)镹aHS的穩(wěn)定性比較好，因此NaHS溶液常作為外源性H2S供體用于動物試驗(yàn)。雖然H2S被認(rèn)為是第三種內(nèi)源性氣體信號分子已有近二十年的時(shí)間，近年來關(guān)于H2S通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激或抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控PAH及其它疾病的研究越來越多［14，15］，并已經(jīng)證實(shí)其在調(diào)節(jié)血管張力和血管結(jié)構(gòu)重建方面發(fā)揮著重要作用［16］，但目前關(guān)于H2S在ES時(shí)PAH中的確切作用及機(jī)制仍尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MPAP在大劑量LPS入血0.5 h后（早期）出現(xiàn)升高，且預(yù)先注射NaHS后，1 h內(nèi)MPAP亦表現(xiàn)為升高。但隨著病程的進(jìn)展和連續(xù)監(jiān)測時(shí)間的延長，MPAP呈現(xiàn)出下降的趨勢。與對照組相比，NaHS組家兔各時(shí)間點(diǎn)的PAP無顯著變化。以上結(jié)果提示，NaHS能夠逆轉(zhuǎn)大劑量LPS入血后誘發(fā)的肺循環(huán)紊亂，表現(xiàn)為有效逆轉(zhuǎn)ES家兔MPAP的早期升高，但對正常家兔MPAP沒有顯著影響，這與本室以往有關(guān)內(nèi)源性H2S可拮抗內(nèi)毒素血癥大鼠引起血管的反應(yīng)性張力異常變化的研究結(jié)果是一致的［3］。與以往研究不同的是，本實(shí)驗(yàn)采用的動物是比大鼠體型大的家兔，且LPS的劑量較大（8 mg/kg vs5 mg/kg），動物MAP顯著降低，處于ES狀態(tài)，更接近臨床實(shí)際。

進(jìn)一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予外源性H2S可改善肺動脈對縮血管劑的高反應(yīng)性，逆轉(zhuǎn)肺動脈血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)性的降低，這與我們以往在復(fù)制的大鼠內(nèi)毒素血癥模型上觀察到的結(jié)果相一致［3］。與以往研究中肺血管張力測定時(shí)先制備正常家兔的肺動脈環(huán)，然后再在體外加入不同藥物的培養(yǎng)基中孵育不同的是，本實(shí)驗(yàn)中肺血管張力測定所用的肺動脈環(huán)是在整體用藥情況下檢測完家兔MAP和MPAP后進(jìn)行取材的，屬于在整體水平探討LPS導(dǎo)致家兔PAH的機(jī)制；另外本實(shí)驗(yàn)在檢測肺血管張力變化的同時(shí)，對肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)也進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果在光鏡和掃描電鏡下均觀察到肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，且上述變化均可被NaHS所逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果提示，ES時(shí)由于內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的肺動脈收縮反應(yīng)增強(qiáng)、內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)降低可以引起PAH的發(fā)生，NaHS通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞改善ES時(shí)肺動脈的反應(yīng)性張力變化可能是其緩解PAH的重要機(jī)制之一。

本室以往在盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and perforation，CLP）法制備的大鼠肺損傷模型上發(fā)現(xiàn)，CLP大鼠肺組織中內(nèi)源性H2S的含量明顯增多導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生［17］。也有其它在大鼠CLP導(dǎo)致的休克或ES大鼠模型上的研究發(fā)現(xiàn)，休克時(shí)大鼠肺動脈、主動脈等血管組織中內(nèi)源性H2S的含量均較對照組明顯升高［18-20］。因此H2S在ES時(shí)的確切作用及其對主動脈和肺動脈作用差異性產(chǎn)生的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。