時(shí)鐘基因BMAL1在運(yùn)動性骨骼肌損傷恢復(fù)中的作用*

傅澤鋌，夏 雨，丁海麗

（成都體育學(xué)院，四川 成都 610041）

生物節(jié)律通過時(shí)鐘基因的表達(dá)調(diào)控人體各組織器官的機(jī)能，時(shí)鐘基因的表達(dá)隨著晝夜時(shí)間（circadian time，CT）改變而變化，對人體多種生理活動有重要影響。骨骼肌作為外周組織也受時(shí)鐘基因調(diào)控，大腦/肌肉芳香經(jīng)受體核轉(zhuǎn)位因子樣蛋白1（brain and muscle ARNT-like1，BMAL1）作為核心時(shí)鐘基因，參與肌生成的過程［1］；細(xì)胞骨架有維持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的功能，可將它分為三種類型的蛋白質(zhì)纖維，即微絲（microfilament）、微管（microtubule）和中間絲（intermediate-filament）。其中，中間絲在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成一個(gè)完整的支撐網(wǎng)架系統(tǒng)，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間都起著多方面的結(jié)構(gòu)作用。骨骼肌細(xì)胞骨架按位置可分為肌小節(jié)內(nèi)骨架、肌小節(jié)外骨架和肌細(xì)胞膜骨架，肌小節(jié)外細(xì)胞骨架主要由中間絲構(gòu)成［2］，結(jié)蛋白（DESMIN）作為主要的肌肉特異性中間絲，貫穿Z線使肌原纖維連接起來，同時(shí)DESMIN也是新肌生成的重要標(biāo)志［3］。

運(yùn)動性骨骼肌損傷（exercise-induced muscle damage，EIMD）是骨骼肌在長時(shí)間及大負(fù)荷運(yùn)動下，產(chǎn)生的一種骨骼肌纖維損傷。已證實(shí)一次性90 min下坡跑步可造成運(yùn)動性骨骼肌損傷［4］。運(yùn)動作為一種條件刺激可引起骨骼肌時(shí)鐘基因相位的改變。研究表明［5，6］，小鼠在一天中非活動時(shí)間運(yùn)動可以引起B(yǎng)MAL1的mRNA表達(dá)發(fā)生變化，計(jì)劃性運(yùn)動可影響骨骼肌自身節(jié)律表達(dá)，使時(shí)鐘基因相位前移2～3 h，但不影響中樞節(jié)律變化；而人類的急性運(yùn)動也會引起骨骼肌核心時(shí)鐘基因表達(dá)改變［7］。盡管這些研究證明骨骼肌核心時(shí)鐘基因在運(yùn)動中表達(dá)會發(fā)生改變，并且參與新肌生成，但運(yùn)動誘發(fā)的骨骼肌損傷修復(fù)過程中的關(guān)系尚不明確。基于此，本研究采用一次下坡跑建立大負(fù)荷運(yùn)動大鼠模型，通過分析時(shí)鐘基因BMAL1的周期性節(jié)律表達(dá)變化趨勢及mRNA表達(dá)；觀察大負(fù)荷運(yùn)動后骨骼肌肌纖維超微結(jié)構(gòu)；檢測BMAL1、DESMIN的蛋白表達(dá)；觀測二者共定位情況，以此探討時(shí)鐘基因BMAL1在運(yùn)動性骨骼肌損傷恢復(fù)中與骨架蛋白DESMIN之間的關(guān)系，為肌肉運(yùn)動能力的恢復(fù)以及治療肌肉相關(guān)疾病提供新的思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性8周齡SPF級SD大鼠共208只，（283.17±4.06）g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。于成都體育學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物房每籠4只分籠飼養(yǎng)，定時(shí)訓(xùn)練，室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，自由飲水飲食。實(shí)驗(yàn)室光照與黑暗時(shí)間12 h交替，CT0（即光照起始時(shí)間）為早8：00開燈；CT12（即光照結(jié)束時(shí)間）為晚20：00熄燈。實(shí)驗(yàn)中動物處置符合國家科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定，獲得成都體育學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組與干預(yù)方案

將208只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為兩組，對照組（Control，C，n=104）和運(yùn)動組（Exercise，E，n=104）。依據(jù)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步分為13亞組（n=8）：即刻組（CT0），運(yùn)動后6 h組（CT6），運(yùn)動后12 h組（CT12），運(yùn)動后18 h組（CT18），運(yùn)動后24 h組（CT24），運(yùn)動后30 h組（CT30），運(yùn)動后36 h組（CT36），運(yùn)動后42 h組（CT42），運(yùn)動后48 h組（CT48），運(yùn)動后54 h組（CT54），運(yùn)動后60 h組（CT60），運(yùn)動后66 h組（CT66），運(yùn)動后72 h組（CT72）。

大負(fù)荷離心運(yùn)動方案：參考Armstong離心運(yùn)動方案［8］，使用小動物電動跑臺對大鼠進(jìn)行訓(xùn)練。E組在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練3 d，第1日坡度0°，速度16 m/min，運(yùn)動時(shí)間5 min；第2日坡度0°，速度16 m/min，運(yùn)動時(shí)間10 min；第3日休息，第4日進(jìn)行一次持續(xù)性下坡跑，坡度-16°，速度16 m/min，運(yùn)動時(shí)間90 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取樣

實(shí)驗(yàn)大鼠分別在安靜和運(yùn)動后即刻0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h時(shí)分批處死并取材。所有大鼠取材前稱量空腹體重，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后開腹分離并剪取腓腸肌，放入冰臺上的錫紙，小心去除肌腱和結(jié)締組織。取材過程中，避免肌肉牽拉。把處理后的腓腸肌肌腹分為三段，其中一段大小為1 mm×1 mm×3 mm，然后放入4℃預(yù)冷的3%戊二醛固定液，用于透射電鏡觀察；剩余部分平均分成兩段，一段放入4%多聚甲醛溶液中，保存于4℃，用于免疫熒光共定位觀測；另一段用錫紙包裹后放入液氮迅速降溫，然后保存于-80℃，用于Western blot法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

1.4 透射電子顯微鏡觀察骨骼肌纖維超微結(jié)構(gòu)變化

將腓腸肌1）戊二醛固定；2）四氧化鋨再固定；3）丙酮脫水；4）樹脂包埋；5）制備切片；6）JEM-1400透射電鏡觀察。采用透射電鏡（型號JEM-1400PLUS，日本電子（JEOL）生產(chǎn)）觀察腓腸肌的肌原纖維特征，包括肌小節(jié)排列順序、肌節(jié)明/暗帶分布情況、線粒體改變情況。先將骨骼肌切段后樣品預(yù)固定（3%戊二醛）后再固定（1%四氧化鋨），經(jīng)丙酮逐級脫水，按比例設(shè)置脫水劑的濃度（在100%濃度中更換3次），處理后的骨骼肌樣品使用脫水劑，后經(jīng)過環(huán)氧樹脂包埋，制備約50 nm切片后，漂浮于刀槽液面上，再撈至銅網(wǎng)，分別通過醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色10～15 min和1～2 min，透射電鏡觀察采圖。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測核心時(shí)鐘基因mRNA表達(dá)

將100 mg組織在液氮中磨碎加入1 ml已預(yù)冷的Trizol，依次采用氯仿、異丙醇、75℅乙醇經(jīng)反復(fù)離心分離提純樣本總RNA，經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度后，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

采用PIKORed 96（美國ThermoFisher生產(chǎn)）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測BMAL1的mRNA表達(dá)水平，所有引物均交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，并以ULTRAPAGE純化。BMAL1的上游引物序列為5′-TGCCACCAATCCATACAC-3′，下游引物 序 列 為5′-TTCCCTCGGTCACATCCTAC-3′；βactin的上游引物序列為5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCC-3′，下游引物序列為5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。使用Thermo Scientific PikoReal軟件分析PCR過程各檢測樣本的CT（Threshold cycle）值。通過2-△△CT計(jì)算X相對mRNA表達(dá)水平。

1.6 免疫印跡法檢測骨骼肌細(xì)胞BMAL1、DESMIN的蛋白含量

取適量每周期始末肌肉樣本，經(jīng)過裂解、低溫離心收集上清液，用Bradford法蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，并進(jìn)行蛋白變性處理。使用PAGE凝膠快速制備試劑盒（7.5%）制膠，上樣：40μg（10 g/L）蛋白；電泳：穩(wěn)定電壓100 V，15 min；轉(zhuǎn)膜：200 mA轉(zhuǎn)膜1～2 h；封閉PVDF膜2 h。孵育Ⅰ抗的濃度分別為：BMAL1和DESMIN，1∶1 000；GAPDH，1∶10 000。Ⅱ抗孵育稀釋濃度為1∶10 000。將PVDF膜平鋪到曝光板上，利用ECL發(fā)光液顯影、定影，最后用天能GIS機(jī)箱控制軟件2.0對條帶進(jìn)行曝光掃描，結(jié)果以目的蛋白相對表達(dá)量表示。

1.7 免疫熒光染色標(biāo)記骨骼肌細(xì)胞BMAL1與DESMIN共定位情況（雙染）

1）固定好的大鼠腓腸肌組織通過全自動脫水機(jī)進(jìn)行脫水、包埋、切片。2）石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ15 min，二甲苯Ⅲ15 min，無水乙醇Ⅰ5 min；無水乙醇Ⅱ5 min，85%酒精5 min，75%酒精5 min，蒸餾水洗；3）抗原修復(fù)：將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），微波爐高火加熱10 min，停火8 min，中高火再加熱10 min；冷卻后，PBS洗3次，每次5 min；4）血清封閉：滴加山羊血清封閉液，室溫靜置20 min；5）滴加一抗，4℃條件靜置過夜；6）PBS洗3次，每次5 min；7）滴加二抗，37℃30 min；8）PBS洗3次，每次5 min；9）滴加DAPI，室溫孵育10 min；PBS洗3次，每次5 min；10）使用抗熒光衰減封片劑封片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用余弦分析軟件circacompare（R package）獲取擬合余弦曲線參數(shù)，其擬合的余弦函數(shù)方程為Y=Mesor+Amplitude×cos（time_Radians-φ），其中Mesor為基線/中值；Amplitude為節(jié)律震蕩的振幅；φ為峰值相位；time Radians為時(shí)間所對應(yīng)的弧度值。

2 結(jié)果

2.1 一次大負(fù)荷離心運(yùn)動對骨骼肌時(shí)鐘基因節(jié)律震蕩的影響

結(jié)果顯示：C組BMAL1基因呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)，72 h內(nèi)共呈現(xiàn)3個(gè)完整節(jié)律周期。C組擬合余弦函數(shù)曲線顯示，BMAL1 mRNA于CT 0.25（早上8：25）處于峰值，隨后下降到CT 12.25（晚上8：25）為谷值，然后回升至CT 24（24 h，1 d）完成一個(gè)周期節(jié)律振蕩；E組BMAL1基因表達(dá)在72 h中節(jié)律性喪失，0～24 h節(jié)律出現(xiàn)紊亂，24～48 h節(jié)律有所恢復(fù)，48～72 h與C組相似（圖1，表1）。

Fig.1 Bmal1 mRNA expression and the rhythmic changes of the fitted cosine function

Tab.1 Parameters of BMAL1 mRNA expression in fitting cosine function

2.2 各組對應(yīng)時(shí)相骨骼肌核心時(shí)鐘基因表達(dá)的比較分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：E組BMAL1 mRNA含量呈現(xiàn)先升高，后趨于正常的狀態(tài)，在0 h、6 h、12 h和18 h顯著高于C組對應(yīng)時(shí)相（P＜0.05，表2）。

2.3 一次大負(fù)荷離心運(yùn)動對骨骼肌纖維超微結(jié)構(gòu)變化的影響

C組肌纖維超微結(jié)構(gòu)整齊，肌節(jié)均勻，z線清晰，肌原纖維排列整齊，線粒體分布均勻，形態(tài)正常。E組運(yùn)動后0 h，肌節(jié)變寬，z線模糊不清呈水波狀，肌原纖維斷裂、扭曲，間隙增大；12 h組，肌纖維大面積溶解，整個(gè)視野內(nèi)無法看清整齊的肌原纖維和肌節(jié)，z線消失；24 h組，肌原纖維彎曲，排列不規(guī)則，間隙依然比較大；48 h組，骨骼肌超微結(jié)構(gòu)扭曲的形態(tài)開始恢復(fù)；72 h組，骨骼肌超微結(jié)構(gòu)扭曲的形態(tài)基本恢復(fù)（圖2）。

Tab.2 The relative expressions of BMAL1 mRNA at different phases after a high-load exercise（±s，n=8）

Tab.2 The relative expressions of BMAL1 mRNA at different phases after a high-load exercise（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group at the same phase

Group C E CT0 1.402±0.081 1.967±0.129*CT6 1.213±0.151 1.508±0.043*CT12 1.005±0.057 1.943±0.214*CT18 1.245±0.195 1.923±0.070*CT24 1.572±0.282 1.460±0.285 CT30 1.225±0.073 1.312±0.059 CT36 1.017±0.244 0.963±0.066 CT42 1.322±0.135 1.148±0.131 CT48 1.625±0.155 1.485±0.061 CT54 1.455±0.210 1.238±0.135 CT60 1.062±0.147 1.043±0.172 CT66 1.228±0.064 1.253±0.073 CT72 1.502±0.314 1.578±0.088

Fig.2 Skeletal muscle myofibrils of rats under high power electron microscopy

2.4 一次大負(fù)荷離心運(yùn)動對骨骼肌BMAL1、DESMIN蛋白表達(dá)的影響

BMAL1蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與C組相比，E組BMAL1蛋白表達(dá)在運(yùn)動后0 h、12 h顯著上升（P＜0.05），24 h至72 h恢復(fù)至與C組無明顯差異（圖3，表3）。DESMIN蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與C組相比，E組DESMIN蛋白表達(dá)在運(yùn)動后0 h、12 h顯著下降（P＜0.05）；24 h開始逐漸升高，48 h表達(dá)達(dá)到最高，與C組存在顯著性差異，至72 h與C組相比無顯著性差異（P＞0.05，圖3，表4）。

Fig.3 The protein expressions of BMAL1 and DESMIN after a high-load exercise

2.5 一次大負(fù)荷離心運(yùn)動后骨骼肌細(xì)胞BMAL11與DESMIN共定位變化

免疫熒光共定位結(jié)果顯示：C組五個(gè)時(shí)相Pear-son系數(shù)小于0.5，Overlap系數(shù)小于0.6，均不存在共定位現(xiàn)象（圖4，表5）；與C組相比，E組在運(yùn)動后0h的Pearson系數(shù)為0.822022、Overlap系數(shù)為0.819980，12h的Pearson系數(shù)為0.888031、Overlap系數(shù)為0.889843，24 h的Pearson系數(shù)為0.831670、Overlap系數(shù)為0.832746，說明存在共定位現(xiàn)象；48 h的Pearson系數(shù)大于0.5，但Overlap系數(shù)小于0.6，72 h的Pearson系數(shù)小于0.5，Overlap系數(shù)小于0.6，說明不存在共定位現(xiàn)象。0～24 h共定位呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，24 h的熒光強(qiáng)度達(dá)到最高值（圖5，表5，6）。

Tab.3 The relative expressions of BMAL1 protein at different phases after ahigh-load exercise（±s，n=8）

Tab.3 The relative expressions of BMAL1 protein at different phases after ahigh-load exercise（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group at the same phase

Group C E CT0 0.851±0.075 1.451±0.081*CT12 0.978±0.080 1.644±0.059**CT24 1.025±0.094 1.288±0.360 CT48 1.052±0.051 0.907±0.111 CT72 1.095±0.010 0.949±0.349

Tab.4 The relative expressions of DESMIN protein at different phases after ahigh-load exercise（±s，n=8）

Tab.4 The relative expressions of DESMIN protein at different phases after ahigh-load exercise（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group at the same phase

Group C E CT0 1.036±0.062 0.687±0.012*CT12 0.784±0.010 0.426±0.054**CT24 0.958±0.088 1.009±0.030 CT48 1.032±0.005 1.339±0.038**CT72 1.255±0.118 1.308±0.074

Fig.4 Co-localization of BMAL1 and DESMIN aggregates at different phases at Group C after a high-load exercise

Fig.5 Co-localization of BMAL1 and DESMIN aggregates at different phases at Group E after a high-load exercise

Tab.5 The Pearson's correlation and overlap coefficient of colocalization of BMAL1 and DESMIN（±s，n=8）

Tab.5 The Pearson's correlation and overlap coefficient of colocalization of BMAL1 and DESMIN（±s，n=8）

Group Phase Pearson's correlation（Rr）Overlap coefficient（R）C E CT0 0.375368 0.402997 0.822022 0.819980 C E CT12 0.216996 0.239659 0.888031 0.889843 C E CT24 0.462627 0.496067 0.831670 0.832746 C E CT48 0.302091 0.319237 0.528399 0.411978 C E CT72 0.425345 0.430837 0.347045 0.383269

Tab.6 Immunofluorescence intensity of light BMAL1 and DESMIN after a high-load exercise（±s，n=8）

Tab.6 Immunofluorescence intensity of light BMAL1 and DESMIN after a high-load exercise（±s，n=8）

Group C E CT0 / 0.854±0.017 CT12 / 0.669±0.004 CT24 / 1.083±0.031 CT48 / /CT72 / /

3 討論

骨骼肌具有內(nèi)在固有的周期性晝夜節(jié)律，該節(jié)律由時(shí)鐘基因驅(qū)動產(chǎn)生。嚙齒動物的日常作息為晝伏夜出，活躍時(shí)期一般在夜間，研究發(fā)現(xiàn)小鼠夜間晚期運(yùn)動優(yōu)于夜間早期［9］；對人體骨骼肌活檢發(fā)現(xiàn)，時(shí)鐘基因BMAL1在CT12到CT24期間，mRNA表達(dá)上升達(dá)到峰值［10］，形成約24 h周期循環(huán)。運(yùn)動作為一種授時(shí)因子可影響骨骼肌節(jié)律變化，同時(shí)受到骨骼肌固有時(shí)鐘的調(diào)控。研究表明，晝夜節(jié)律紊亂模型小鼠的運(yùn)動能力比正常小鼠顯著降低，而運(yùn)動可通過改變骨骼肌節(jié)律來恢復(fù)肌肉正常的代謝功能［11，12］。本研究對未施加干預(yù)的C組SD大鼠骨骼肌BMAL1 mRNA進(jìn)行檢測，并獲取擬合余弦曲線參數(shù)分析其變化趨勢，發(fā)現(xiàn)72 h內(nèi)上述基因均呈現(xiàn)3個(gè)完整近日節(jié)律周期，即晝夜節(jié)律振蕩。進(jìn)一步分析其振蕩曲線的峰值與谷值，發(fā)現(xiàn)C組BMAL1 mRNA在CT0到CT12期間由波峰降至波谷，在CT12到CT24期間回升至波峰，而E組BMAL1 mRNA在運(yùn)動后第1日（0 h～24 h）出現(xiàn)近日節(jié)律消失，第2日（24 h～48 h）和第3日（48 h～72 h）基本恢復(fù)，表明一次大負(fù)荷運(yùn)動可誘發(fā)骨骼肌核心時(shí)鐘基因節(jié)律振蕩紊亂。

下坡跑步作為一種全身性運(yùn)動，因可使肌肉產(chǎn)生離心運(yùn)動而廣泛用于研究肌肉損傷的生理變化。一次大負(fù)荷運(yùn)動可誘發(fā)運(yùn)動性骨骼肌損傷［4］，導(dǎo)致骨骼肌纖維超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，骨架蛋白發(fā)生降解，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，DESMIN纖維絲斷裂；Z線模糊、破壞或消失是在離心收縮后肌纖維觀察到的典型特征［13］。DESMIN在運(yùn)動后12 h降解最為顯著，大約在運(yùn)動后48 h表達(dá)開始升高，此時(shí)重新生成新的肌原纖維［14，15］。在本研究中，骨骼肌在運(yùn)動性骨骼肌損傷的修復(fù)過程中，BMAL1的晝夜節(jié)律遭到破壞，其mRNA含量在運(yùn)動后0 h、6 h、12 h、18 h顯著性上升，蛋白表達(dá)在運(yùn)動后0 h、12 h顯著性升高，24 h即與C組無明顯差異，這與先前的研究結(jié)果相符合［16］。DESMIN的蛋白表達(dá)在運(yùn)動后0 h、12 h發(fā)生顯著性下降，24 h表達(dá)逐漸恢復(fù)，升高至48 h與C組存在顯著性差異，先前的證據(jù)也顯示骨骼肌細(xì)胞在離心運(yùn)動后的增殖表現(xiàn)出時(shí)序性［17］。我們在每個(gè)晝夜節(jié)律周期始末觀察肌纖維超微結(jié)構(gòu)，同時(shí)分析比較E組與C組對應(yīng)時(shí)相基因及蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示E組相比于C組在晝夜節(jié)律表達(dá)均受到破壞的0 h、12 h、24 h存在顯著性差異，同時(shí)肌纖維超微結(jié)構(gòu)改變在0 h、12 h、24 h也較為明顯；24 h～48 h時(shí)BMAL1節(jié)律發(fā)生偏移，而48 h時(shí)刻點(diǎn)的肌纖維超微結(jié)構(gòu)仍有損傷現(xiàn)象，48 h～72 h隨著BMAL1晝夜節(jié)律的恢復(fù)，肌纖維超微結(jié)構(gòu)損傷也明顯減輕。提示時(shí)鐘基因?qū)S持骨骼肌質(zhì)量及結(jié)構(gòu)具有重要作用，當(dāng)晝夜節(jié)律紊亂時(shí)，骨骼肌會發(fā)生細(xì)胞水平的結(jié)構(gòu)和功能改變，包括最大肌力的降低、肌絲結(jié)構(gòu)紊亂以及線粒體形態(tài)的異常［18］。有報(bào)道證明［1］，骨骼肌損傷后，BMAL1的表達(dá)發(fā)生上調(diào)并且促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的生長，而在BMAL1-/-小鼠模型觀察到衛(wèi)星細(xì)胞的再生缺陷，這說明BMAL1是肌肉修復(fù)所需的促生肌反應(yīng)的組成部分。此外，John等學(xué)者用轉(zhuǎn)錄組確定骨架蛋白同樣具有晝夜節(jié)律［19］。已有證據(jù)顯示BMAL1調(diào)控MyoD促進(jìn)肌生成［18］，并且MyoD可激活DESMIN的表達(dá)［20］，這提示大負(fù)荷運(yùn)動后核心時(shí)鐘基因BMAL1可能通過調(diào)控DESMIN蛋白表達(dá)從而影響骨骼肌修復(fù)過程。

為進(jìn)一步探究BMAL1與DESMIN的關(guān)系，本研究進(jìn)行免疫熒光共定位，結(jié)果顯示運(yùn)動后BMAL1和DESMIN在0 h、12 h、24 h出現(xiàn)共定位，在12 h合光強(qiáng)度達(dá)到最低，在24 h達(dá)到最高值。我們推測，BMAL1受到運(yùn)動刺激，自身表達(dá)發(fā)生上升，雖然它能調(diào)控骨骼肌修復(fù)和再生，但由于骨骼肌損傷的修復(fù)和再生階段是一個(gè)比較復(fù)雜的過程，在骨骼肌發(fā)生損傷后，其蛋白質(zhì)合成受抑制而分解加強(qiáng)，出現(xiàn)蛋白質(zhì)的凈降解［15］，因此DESMIN在蛋白表達(dá)結(jié)果上顯示為運(yùn)動后0 h、12 h表達(dá)下降，在共定位結(jié)果上顯示為運(yùn)動后12 h合光強(qiáng)度最弱；在24 h蛋白質(zhì)合成率逐漸增加后蛋白表達(dá)才顯示為上升，在共定位結(jié)果上顯示為運(yùn)動后24 h合光強(qiáng)度最強(qiáng)。

綜上所述，大負(fù)荷離心運(yùn)動可誘導(dǎo)骨骼肌時(shí)鐘基因BMAL1節(jié)律紊亂，我們初步探討了時(shí)鐘基因BMAL1與骨架蛋白DESMIN在大負(fù)荷運(yùn)動后骨骼肌損傷修復(fù)過程中存在一定相關(guān)性，為恢復(fù)肌肉運(yùn)動能力以及運(yùn)動員如何緩解高強(qiáng)度訓(xùn)練后時(shí)鐘基因?qū)ι眢w機(jī)能的影響提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)及參考。但關(guān)于BMAL1基因是通過何種途徑來調(diào)控DESMIN的，其分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。