葡萄糖6-磷酸脫氫酶調(diào)控細(xì)胞周期蛋白E1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2促進細(xì)胞增殖及其在腎透明細(xì)胞癌中的預(yù)后價值

楊 哲， 倪月莉， 王舒婕， 劉文靜， 朱玉芝， 車 蓉,4)，段友斌， 況應(yīng)敏， 朱月春， 張 巧*

(1)昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物系， 昆明 650500；2)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科， 昆明 650032；3)北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 北京 100191；4)曲靖醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床學(xué)院兒科，云南， 曲靖 655000；5)昆明市血液中心， 昆明 650106；6)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院器官移植科， 昆明 650032)

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是一類起源于泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤，約占腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)的75% ～ 90%[1]。越來越多的證據(jù)表明，ccRCC是一種細(xì)胞代謝性疾病，具有早診率低、高轉(zhuǎn)移、治療耐藥和預(yù)后差的特點。因此，以更新的視角揭示其發(fā)生發(fā)展機制是ccRCC研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題[2,3]。葡萄糖6-磷酸脫氫酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase, G6PD)為磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，在包括肺癌、乳腺癌、ccRCC等腫瘤中表達增高[4-6]，參與腫瘤細(xì)胞整體代謝重編程[7, 8]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，G6PD在ccRCC中異常高表達，并提示患者不良預(yù)后[6, 9]。G6PD與ccRCC細(xì)胞增殖及侵襲遷移等惡性表型均密切相關(guān)[10, 11]。其高表達受到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, pSTAT3)與核因子kappa B(nuclear factor kappa B, NF-κB)信號通路的協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄調(diào)控[12]。然而，G6PD異常激活促進ccRCC細(xì)胞增殖的分子機制仍有待揭示。

細(xì)胞周期調(diào)控因子在腫瘤發(fā)生的各個階段均發(fā)揮作用[13]。其中，RCC等多種惡性腫瘤中可見G1/S期調(diào)控因子表達異常[14]，提示細(xì)胞周期缺陷與癌基因激活密切相關(guān)。然而，ccRCC異常G1/S期轉(zhuǎn)化的分子調(diào)控機制僅被部分闡明[14]。有研究指出，作為2個重要的G1/S過渡調(diào)控因子，細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)和細(xì)胞周期蛋白E1(cyclin E1)常在腫瘤增殖和進展中異常表達并發(fā)揮促癌作用[14]。我們已證實，G6PD可以通過上調(diào)pSTAT3活性來刺激細(xì)胞周期蛋白D1過表達，從而促進ccRCC細(xì)胞增殖[10]。但隨著研究的不斷深入，更多證據(jù)表明，細(xì)胞周期蛋白D1在ccRCC中高度表達，但卻提示ccRCC患者預(yù)后良好[15, 16]。因此，本文推測，G6PD介導(dǎo)的ccRCC增殖可能取決于其他更為重要的潛在調(diào)控機制。

為提高ccRCC早診率并改善患者預(yù)后，人們在ccRCC生物分子標(biāo)志物的研究和鑒定中作出了巨大努力。然而，迄今為止卻未見某一特定生物標(biāo)志物在ccRCC診斷、分類和預(yù)后的臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出令人滿意的效果[17, 18]。因此，闡明ccRCC發(fā)生發(fā)展機制，并進一步分析和鑒定新的潛在分子標(biāo)志物是ccRCC基礎(chǔ)與臨床研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵。本研究拓展了G6PD促進ccRCC增殖的作用及其機制，分析了G6PD促進細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化并上調(diào)的相關(guān)調(diào)控因子，包括細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin dependent kinase4, CDK4)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6(cyclin dependent kinase6, CDK6)、細(xì)胞周期蛋白E1和CDK2。結(jié)果表明，G6PD、 細(xì)胞周期蛋白E1和CDK2在ccRCC組織中高表達，并提示ccRCC患者的不良預(yù)后。G6PD與 細(xì)胞周期蛋白E1和CDK2表達呈正相關(guān)，并且G6PD可能通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白E1和CDK2表達而改變細(xì)胞周期分布并促進細(xì)胞增殖。上述發(fā)現(xiàn)提示，G6PD、細(xì)胞周期蛋白E1和CDK2有望成為ccRCC新的診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物，并將為ccRCC有效靶向診療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

786-O、ACHN 和 Caki-1 細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明動物研究所。細(xì)胞系的選擇以及G6PD 過表達和敲低構(gòu)建過程詳見本課題組已發(fā)表文獻[10]。細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10% FBS(10099141，GIBCO，USA)的DMEM 培養(yǎng)基(1195500 bt，GIBCO，USA)。當(dāng)細(xì)胞融合約為 80%時，棄去培養(yǎng)基，將細(xì)胞用 PBS 洗滌2次，然后加入 1 mL 0.25%胰蛋白酶(25200072，GIBCO，USA)消化細(xì)胞1～2 min。當(dāng)大部分細(xì)胞脫落時，加入含有血清的新鮮培養(yǎng)基，并按 1∶3 的比例轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)條件為 37 ℃，5%CO2，飽和濕度。

靶向人細(xì)胞周期蛋白E1 基因的siRNA干擾片段(序列： 5′-CACCCTCTTCTGCAG CCAA-3′)，靶向人CDK2基因的siRNA干擾片段(序列5′-GCCACAAUGUUU AUAAAGGCCAAAT-3′)以及干擾對照(non-silencer)由廣州銳博生物科技有限公司合成。取1×105個處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種至6孔板，將培養(yǎng)板放置37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞密度達到約50%時進行轉(zhuǎn)染。以6孔板每孔為例，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合體1：取濃度為20 μmol/L siRNA或Non-silencer 2.5 μL稀釋于125 μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基(31985062，GIBCO，USA)中，輕混勻。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合體2：取2.5 μL LipofectamineTM2000(11668019，Invitrogen，USA)稀釋于125 μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕混勻，室溫孵育5 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合體1和2混合，輕混勻，室溫孵育5 min。再加入到含750 μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕混勻，37 ℃，二氧化碳培養(yǎng)箱孵育4 h后換成含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基，再培養(yǎng)72 h后進行鑒定及后續(xù)相關(guān)實驗。

1.2 細(xì)胞增殖能力檢測

MTS檢測：將100 μL細(xì)胞懸液(1×104/孔)接種到96孔板中培養(yǎng)24 h。在不同時間點向每個孔中添加 10 μL MTS 試劑(CK04-1000，Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)，37 ℃溫育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度。

平板克隆形成：取1 000個處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種至6孔板，補足含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基至2 mL，輕混勻，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d，對細(xì)胞進行換液，連續(xù)觀察約14 d或待絕大多數(shù)單個克隆中細(xì)胞數(shù)大于50為止。取出6孔板，棄上清，PBS洗滌3次。用4%多聚甲醛室溫固定15 min；棄4%多聚甲醛，PBS洗滌3次；加入1 mL 0.1%結(jié)晶紫染液，室溫染色30 min；棄染液，用流水緩慢洗去多余染液，通風(fēng)干燥后進行拍照及統(tǒng)計。

1.3 細(xì)胞周期檢測

將細(xì)胞接種在6孔板中生長12 h。在 0.2%FBS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。再將細(xì)胞在10%FBS培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞棄上清。預(yù)冷的70%乙醇重懸細(xì)胞，4 ℃過夜。收集細(xì)胞沉淀，加入100 μL RNase A液，37 ℃水浴30 min，加入400 μL碘化丙啶溶液，4 ℃避光溫育30 min，PARTEC CyFlow Space 流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞周期分析。

1.4 實時 RT-PCR 檢測

應(yīng)用Trizol(15596-018，Invitrogen，USA)進行細(xì)胞內(nèi)總RNA提取。根據(jù) Thermo RT Kit(K1622，Thermo，USA)說明書進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用 SYBR Green qPCR Super Mix(04913850001，Roche，Switzerland)進行Real-time RT-PCR PCR檢測。所用引物如下：G6PD：F: 5′-TCATCATCATGGGTG CATCGG-3′，R: 5′-CTTGAAGAAGGGCTCACTCTGT TTG-3′；Cyclin D1: F: 5′-GCGTACCCTGACACCCC TCTC-3′, R: 5′-CTCCTCTTCG CCTGATCC-3′；Cyclin E1：F: 5′-ACT CAACGTGCAAGCCTCG-3′，R: 5′- GCTCAAGAAAGTGCTGATCCC-3′；CDK2: F: 5′-CC AGGAGTTACTTCTATGCCTGA-3′，R: 5′- TTCATCC AGGGGAGGTACAAC-3′；CDK4: F:5′-TCAGCCAG CTTGACTGTTCCA-3′，R: 5′- GCCTAGATTTCCTTC ATGCCA-3′；CDK6: F: 5′-TGACCAGCAGCGGACA AATAA-3′，R: 5′-TGTACCACAGCGTGACGACCA-3′；U6：F: 5′-GAAGAGACCCCTGACCCT AA-3′，R: 5′-GAAGAGACCCCTGACCCTAA-3′。

1.5 Western 印跡分析

應(yīng)用 RIPA 蛋白質(zhì)裂解物(1 mL RIPA 裂解物添加10 μL PMSF)提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，并通過 BCA 方法進行蛋白質(zhì)定量。制備10%分離凝膠和5%壓縮凝膠，進行SDS-PAGE。分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜浸泡在5%脫脂奶粉中封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜。使用洗膜緩沖液(Tris-buffered saline Tween，TBST)洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗于37 ℃溫育1 h，再次用TBST洗膜3次。加入配制好的電化學(xué)發(fā)光(electrochemical luminescence，ECL)工作液，置于成像系統(tǒng)中采集圖像信號，通過 ImageJ 灰度掃描軟件分析結(jié)果。所用抗體包括：G6PD 抗體(ab133525，Abcam，Cambridge，UK)，Cyclin D1 抗體(ab16663, Abcam), Cyclin E1抗體(ab33911，Abcam)，CDK2抗體(AF6237，Affinity，OH, USA)，CDK4抗體(DF6102，Affinity)，CDK6抗體(DF6448，Affinity)和 β-肌動蛋白(β-actin)(#4967，Cell Signaling Technology，Beverly, MA, USA)。二抗羊抗兔IgG(sc2004, Santa Cruz Biotechnology)以及羊抗鼠IgG(sc2005, Santa Cruz Biotechnology)。

1.6 TCGA數(shù)據(jù)集分析

應(yīng)用R軟件登錄The Cancer Genome Atlas(TCGA, https://tcga-data. nci. nih. gov/tcga/tcgaHome2. jsp)數(shù)據(jù)庫。下載72例正常腎組織及535腎透明細(xì)胞癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及患者的年齡、性別、TNM分期、病理分級等資料。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及患者信息相匹配后，提取G6PD、Cyclin D1、CDK4、CDK6、CyclinE1以及CDK2 mRNA的表達值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.7 免疫組化分析

首先將來自于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科的20例ccRCC和正常癌旁對照組織的石蠟標(biāo)本切片進行脫蠟。在室溫下，用3%H2O2孵育10 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶。按照試劑盒說明書，應(yīng)用通用兩步檢測試劑盒(PV-9000，ZSGB-BIO，北京，中國)進行免疫組化染色。所用抗體包括：Cyclin E1抗體(bsm-52048R，Bioss，Beijing，China)，CDK2抗體(bs- 0757R，Bioss，Beijing，China)。最后，使用 DAB 檢測試劑盒(DAB-2031，MXB Biotechnology，F(xiàn)uzhou，China)對組織進行染色，之后脫水，固定和照相。根據(jù)先前的文獻描述，通過染色強度乘以染色細(xì)胞的百分比可以計算出所檢測因子的染色評分[6, 11]。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0版(IBM，Armonk，NY)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。由于TCGA數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布且方差不均勻，因此使用Mann-whitney U檢驗分析ccRCC與正常對照組織中Cyclin D1，CDK4，CDK6，Cylin E1以及CDK2的表達差異。通過Mann-whitney U檢驗(2組)或Cruskal-wallis H(K)檢驗(3組)分析ccRCC患者的Cyclin D1，CDK4，CDK6，Cyclin E1和CDK2表達與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析評估G6PD與Cyclin D1，CDK4，CDK6，Cyclin E1以及CDK2不同分子之間的表達相關(guān)性。將上述各個因子以表達水平均值劃分的高表達組和低表達組，應(yīng)用Kaplan-Meier分析和log-rank檢驗，分析各因子高/低表達組之間的生存預(yù)后差異。應(yīng)用單因素和多因素Cox回歸模型分析G6PD，Cyclin D1，Cyclin E1，CDK2，CDK4，CDK6表達及其他臨床病理特征與ccRCC總生存率的關(guān)系。應(yīng)用χ2檢驗進行免疫組織化學(xué)分析。應(yīng)用t檢驗進行其他分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 降低葡萄糖6-磷酸脫氫酶抑制細(xì)胞周期進展及腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖

本室先前的研究報道指出，葡萄糖6-磷酸脫氫酶在ccRCC中存在高表達，并提示患者不良預(yù)后[6]。G6PD可能通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1和CDK4表達而影響ACHN細(xì)胞周期分布并促進ccRCC細(xì)胞增殖[10, 12]。為進一步證實G6PD可調(diào)控細(xì)胞周期并影響ccRCC細(xì)胞生長，本文在G6PD敲低的Caki-1細(xì)胞進行了細(xì)胞周期檢測。結(jié)果表明，Caki-1-G6PDsi細(xì)胞G1期比例顯著增加，而進入S和G2/M期的細(xì)胞數(shù)量則明顯降低(Fig.1A-C)。繼而檢測了G6PD敲低以及G6PD競爭性抑制劑6AN對ccRCC細(xì)胞生長的抑制作用。結(jié)果正如Fig.1D所示，G6PD敲低可顯著抑制Caki-1細(xì)胞的增殖能力；并且其競爭性抑制劑6AN可顯著抑制細(xì)胞增殖，并具有時間和劑量依賴性。以上結(jié)果表明，G6PD有可能通過促進 G1/S期轉(zhuǎn)化而改變細(xì)胞周期分布，進而促進ccRCC細(xì)胞增殖。

Fig.1 G6PD changed cell-cycle distribution and promoted ccRCC cell proliferation (A-C) The effect of G6PD knockdown on Caki-1 cell-cycle distribution was detected by flow cytometry. (D-E) MTS assay was used to analyze the inhibitory effects of G6PD knockdown and G6PD competitive inhibitor 6AN on the proliferation of Caki-1 (D) and 786-O (E) cells, respectively. Data were represented as means ± SD (n=3). **P <0.01 vs. NCsi

2.2 葡萄糖6-磷酸脫氫酶促進腎透明細(xì)胞癌內(nèi)細(xì)胞周期蛋白D1，E1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2，4，6的表達

為了進一步揭示G6PD在ccRCC細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)化及促腫瘤生長中的潛在作用機制，本文通過實時RT-PCR和Western印跡方法在ACHN-G6PD，Caki-1-G6PDsi和對照細(xì)胞中檢測了參與增殖以及細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因。結(jié)果表明，細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)化和增殖相關(guān)基因Cyclin D1，CDK4，CDK6，Cyclin E1以及CDK2在mRNA和蛋白質(zhì)的水平，均與G6PD的表達呈顯著正相關(guān)(Fig.2)。提示上述因子可能為G6PD的下游靶基因，并參與了G6PD調(diào)控的ccRCC細(xì)胞周期改變及促增殖作用。

Fig.2 G6PD promoted the expression of Cyclin D1, CDK4, CDK6, Cyclin E1 and CDK2 in ccRCC cells (A-D) Expression levels of Cyclin D1, CDK4, CDK6, Cyclin E1 and CDK2 in G6PD-overexpressed ACHN cells, G6PD knocked down Caki-1 cells and their relative control cells at the mRNA and protein expression levels were examined by Real-time RT-PCR (A-B) and Western blot analysis (C-D), respectively. Data were represented as means ± SD (n=3). * P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001 vs. NCsi or Vector

2.3 細(xì)胞周期蛋白E1和CDK2在腎透明細(xì)胞癌中異常高表達并與葡萄糖6-磷酸脫氫酶表達呈正相關(guān)

前述結(jié)果提示，G6PD 可能通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1，CDK4，CDK6，Cyclin E1和CDK2表達而促進 ccRCC 細(xì)胞增殖。然而，這些因子在ccRCC中的表達情況，與ccRCC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性以及它們與G6PD之間的調(diào)控關(guān)系尚不清楚。據(jù)此，本文從TCGA中提取72例正常腎組織和535例ccRCC患者的轉(zhuǎn)錄物組測序數(shù)據(jù)，進行相關(guān)統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，與正常對照組相比，ccRCC 中Cyclin D1，Cyclin E1 和 CDK2的mRNA 水平顯著升高，而CDK4的表達無明顯差異，CDK6的表達卻顯著降低(Fig. 3)。

Fig.3 Cyclin D1, Cyclin E1 and CDK2 were upregulated in ccRCC (A-E) mRNA expression levels of Cyclin D1 (A), CDK4 (B), CDK6 (C), Cyclin E1 (D) and CDK2 (E) in normal kidney tissues (n=72) and ccRCC specimens (n=535) were analyzed by TCGA dataset mining. ns, not significant, **P <0.01, ***P <0.001 vs. Normal tissues

在上述因子與臨床參數(shù)相關(guān)性的分析中發(fā)現(xiàn)，CDK4與所有的臨床參數(shù)無相關(guān)性，而CDK6除與M 階段存在相關(guān)性外，與其他參數(shù)無相關(guān)性。CDK2與患者的T 階段和Fuhrman 等級呈正相關(guān)。Cyclin D1和Cyclin E1的表達與患者的T 階段，N 階段，F(xiàn)uhrman 等級以及TNM 階段密切相關(guān)。此外，Cyclin D1和Cyclin E1還分別與患者的性別和M 階段存在相關(guān)性(Table1)。綜上，Cyclin D1，Cyclin E1 和 CDK2可能在G6PD調(diào)控促進ccRCC增殖過程中發(fā)揮著更為重要的作用。

Table 1 Correlations between the expression of Cyclin D1, CDK4, CDK6,Cyclin E1, CDK2 and important clinicopathological variables in ccRCC

為了進一步揭示 G6PD 與上述因子之間的關(guān)系，本文應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析評估了TCGA轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中G6PD與Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1以及CDK2不同分子之間的表達相關(guān)性。結(jié)果表明，G6PD與Cyclin D1呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.0001)，G6PD與CDK4，CDK6之間無顯著相關(guān)性(P>0.05)，G6PD與Cyclin E1(P<0.0001)以及CDK2(P<0.05)顯著正相關(guān)(Fig. 4A-E)，表明ccRCC 中Cyclin E1和CDK2的過表達可能取決于G6PD的表達失調(diào)。進一步通過免疫組化分析了Cyclin E1 和 CDK2在ccRCC腫瘤及癌旁組織中的表達情況。發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比，ccRCC腫瘤組織中Cyclin E1和 CDK2蛋白表達水平均顯著升高(Fig. 4 G-I)。以上結(jié)果表明，高表達的Cyclin E1和 CDK2與ccRCC中G6PD過表達呈正相關(guān)，并可能協(xié)同參與了ccRCC腫瘤增殖。

Fig.4 Cyclin E1 and CDK2 were highly expressed and positively correlated with the expression of G6PD in ccRCC (A-E) Spearman correlation analyses between G6PD and Cyclin D1, CDK4, CDK6, Cyclin E1 or CDK2 at the mRNA expression levels were conducted through TCGA dataset mining. (F-H) Expression levels of Cyclin E1 and CDK2 in adjacent and ccRCC tumor specimens were examined by immunological histological chemistry (IHC) analysis (n=20). Representative images were shown (F). χ2 test was used for IHC analysis (G-H). *P <0.05, **P <0.01 vs. Adjacent

2.4 細(xì)胞周期蛋白 E1與CDK2高表達提示腎透明細(xì)胞癌患者不良預(yù)后

為評估及明確上述因子在ccRCC預(yù)后中的意義，根據(jù)各基因表達水平的均數(shù)，將TCGA數(shù)據(jù)集中528例具有隨訪時間的ccRCC病例分為高表達組和低表達組，繪制了Kaplan-Meier生存曲線并進行l(wèi)og-rank檢驗。結(jié)果表明，Cyclin D1高表達卻提示ccRCC患者整體預(yù)后更為良好(Fig. 5A)，而CDK4和CDK6表達水平在ccRCC患者總生存率預(yù)測中無意義(Fig. 5B-C)。相反，Cyclin E1和CDK2表達水平較高的ccRCC患者較其表達水平較低患者的總生存時間均明顯縮短(Fig. 5D-E)。

Fig.5 High expression of Cyclin E1 and CDK2 were positively correlated with the poor prognosis of ccRCC patients Kaplan-Meier analysis of Cyclin D1 (A), CDK4 (B), CDK6(C), Cyclin E1 (D) and CDK2(E)mRNA expression level and survival probability of ccRCC patients (n=528)

進一步單因素Cox 回歸分析結(jié)果表明，手術(shù)年齡，T 階段，M 階段，腫瘤偏側(cè)性，F(xiàn)uhrman 等級，TNM 階段以及 G6PD，Cyclin D1，Cyclin E1和CDK2表達水平與ccRCC患者預(yù)后存在相關(guān)性，而其他臨床參數(shù)(包括性別，N 階段，CDK4，CDK6的表達)則不是重要的預(yù)后因素。繼而應(yīng)用多因素 Cox 回歸分析G6PD、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2表達水平，以及其他6個重要臨床參數(shù)與ccRCC預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果表明，G6PD和 CDK2表達水平以及手術(shù)年齡、M 階段以及Fuhrman 等級與ccRCC患者預(yù)后密切相關(guān)，并有可能成為其獨立生存預(yù)后因素(Table 2)。綜上所述，G6PD有可能通過促進Cyclin E1和CDK2表達升高而在 ccRCC腫瘤增殖中發(fā)揮作用，并且三者的異常高表達有望成為ccRCC患者不良預(yù)后的獨立生存預(yù)測因素。

Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of the association of G6PD, CyclinD1, CyclinE1, CDK2, CDK4 and CDK6 expression and other clinicopathologic features with overall survival in ccRCC analyzed by TCGA data mining

2.5 細(xì)胞周期蛋白E1、CDK2表達降低可逆轉(zhuǎn)葡萄糖6-磷酸脫氫酶促進腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的能力

為了進一步確定G6PD在ccRCC中有可能通過促進Cyclin E1和CDK2高表達而發(fā)揮促進腫瘤細(xì)胞增殖的能力，本文選擇G6PD本底表達較高的Caki-1細(xì)胞進行了Cyclin E1和CDK2干擾實驗，同時在G6PD過表達的ACHN細(xì)胞中進行了二者的敲低，之后對其干擾效率、細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖能力進行檢測。結(jié)果表明，降低Cyclin E1和CDK2表達可顯著增加Caki-1細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例，降低S和G2/M細(xì)胞比例；同時可見Caki-1細(xì)胞增殖能力的顯著降低。在G6PD過表達的ACHN細(xì)胞中進行Cyclin E1和CDK2的敲低，可見G6PD過表達引起的細(xì)胞周期改變以及增殖能力的增強被明顯逆轉(zhuǎn)(Fig.6)。綜上推測，G6PD對于ccRCC細(xì)胞周期調(diào)控以及對細(xì)胞增殖能力的促進作用，可能部分通過Cyclin E1和CDK2介導(dǎo)。

Fig.6 Cyclin E1 or CDK2 knockdown could reverse G6PD promoted ccRCC cell proliferation (A) The effect of Cyclin E1 siRNA and CDK2 siRNA on Caki-1 and G6PD-overexpressing ACHN cells was analyzed by Western blot assay. (B-C) The effect of Cyclin E1 siRNA (B) and CDK2 siRNA (C) on Caki-1 and G6PD-overexpressing ACHN cell-cycle distribution was detected by flow cytometry assay. (D) Plate clone formation assay was used to analyze the inhibitory effects of Cyclin E1 siRNA and CDK2 siRNA on the proliferation of Caki-1 and G6PD-overexpressing ACHN cells. Data were represented as means ± SD (n=3).*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001 vs. NCsi, Vector+NCsi or G6PD+NCsi

3 討論

ccRCC是一種初診轉(zhuǎn)移率高、治療耐藥、預(yù)后差的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。目前，治療ccRCC的最基本方案依然是腎切除術(shù)。然而，約30% ccRCC患者在首次確診時即出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，約40%患者將出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。并且，ccRCC的放化療敏感性較低，患者預(yù)后仍然較差，中位生存期僅約13個月[18, 19]。因此，以更新的視角揭示ccRCC發(fā)病機制，并進一步確定其有效診療和預(yù)后分子標(biāo)志物是ccRCC研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵。本研究旨在探討ccRCC增殖的潛在機制，并尋找與ccRCC腫瘤生長和臨床參數(shù)相關(guān)的新的生物標(biāo)志物，以期為ccRCC的早期診斷和預(yù)后判斷提供線索，為新的有效診療方案的研發(fā)提供理論依據(jù)。

近年來，腫瘤代謝重編程研究備受關(guān)注，ccRCC從根本上被認(rèn)為是一種細(xì)胞代謝性疾病[2, 20]。我們前期研究表明，G6PD在ccRCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮致癌作用，通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1和金屬基質(zhì)蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP2)的表達促進ccRCC的增殖和侵襲[9, 11]。然而，G6PD介導(dǎo)的ccRCC腫瘤發(fā)生的潛在機制仍有待進一步闡明。據(jù)報道，Cyclin D1在包括RCC在內(nèi)的多種腫瘤中存在高表達，并有可能成為其潛在生物標(biāo)志物。然而，Cyclin D1在RCC中的預(yù)后意義卻存在爭議。有研究表明，Cyclin D1低表達與ccRCC患者腫瘤體積增大、核分級程度高、患者預(yù)后差相關(guān)[15]。最近一項針對18項涉及2 282例RCC患者的meta分析指出，Cyclin D1高表達與患者無病生存率呈正相關(guān)。在ccRCC這一亞組分析中，Cyclin D1對患者無病生存率有良好的預(yù)后作用，但ccRCC中Cyclin D1的表達與總生存率之間無相關(guān)性[16]。本文的研究表明，Cyclin D1在ccRCC中的確高表達，但卻提示ccRCC患者預(yù)后良好。

作為重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，細(xì)胞周期蛋白D1的經(jīng)典功能是與CDK4/6形成復(fù)合物，促進細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)化[16]。然而，我們的研究結(jié)果顯示，CDK4的表達在ccRCC與正常對照組織之間無顯著差異，而CDK6的表達在ccRCC標(biāo)本呈現(xiàn)低表達。同時，這兩個因素對ccRCC生存率的影響均無預(yù)后意義。此外，有研究報道稱，下調(diào)Cyclin D1可增加細(xì)胞侵襲，改善乳腺癌患者的預(yù)后[16]。上述結(jié)果提示，Cyclin D1除具有致癌作用外，還可能在抑制ccRCC惡性轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮功能。因此，以上證據(jù)表明，G6PD還可能通過調(diào)控除Cyclin D1以外的其他細(xì)胞周期及增殖相關(guān)因子而參與ccRCC的腫瘤發(fā)生。本研究率先指出，參與G1/S轉(zhuǎn)化的另外一對調(diào)節(jié)因子Cyclin E1和CDK2在ccRCC中高表達，并有可能成為ccRCC診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。這與本文的研究結(jié)果G6PD可促進細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)化，以及Cyclin El和CDK2高表達促進ccRCC發(fā)生發(fā)展[14, 21]的報道相一致。研究表明，Cyclin El在ccRCC中表達升高可促進其發(fā)生發(fā)展，提示患者不良預(yù)后，并與腫瘤分化程度降低[22]以及患者阿昔替尼耐藥性增加相關(guān)[23]。CDK2的活性與ccRCC患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后顯著相關(guān)，有望成為ccRCC復(fù)發(fā)的強預(yù)后因子。與高CDK2活性的ccRCC患者相比，低CDK2活性的ccRCC患者表現(xiàn)出明顯較好的5年無復(fù)發(fā)生存率[21]。另外，RCC中CDK2 mRNA表達及穩(wěn)定性增強與Wilms腫瘤關(guān)聯(lián)蛋白(Wilms’ tumor 1-associating protein, WTAP)的表達增加密切相關(guān)，WTAP可結(jié)合在CDK2轉(zhuǎn)錄本的3′-UTR區(qū)而增加其mRNA穩(wěn)定性[24]，并且RCC患者進展受到miR-501-3p/WTAP/CDK2軸調(diào)控[25]。此外，本文的細(xì)胞水平檢測結(jié)果指出，Cyclin E1和CDK2在ccRCC中表達升高可能是由G6PD異常激活所介導(dǎo)。并且，Cyclin E1、CDK2表達降低可逆轉(zhuǎn)G6PD促進ccRCC細(xì)胞增殖的能力。上述結(jié)果表明，Cyclin E1和CDK2作為細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵分子，可能是G6PD促進ccRCC腫瘤增殖的更為關(guān)鍵的下游靶基因。

然而，作為一種主要定位于細(xì)胞質(zhì)的酶，G6PD如何調(diào)控核內(nèi)因子Cyclin E1和CDK2的表達尚不清楚。眾多研究指出，ROS失調(diào)是導(dǎo)致異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因素[26, 27]。ROS可通過調(diào)控一系列與增殖相關(guān)基因例如CyclinD1的表達，以及包括pSTAT3和MAPK在內(nèi)的多條信號通路協(xié)同作用，促進多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10, 11]。同時，G6PD通過平衡ROS的產(chǎn)生或消除，在ROS穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]。我們先前的研究證實，G6PD可促進NADPH產(chǎn)生并增加NOX4酶活性，并因此通過G6PD-NADPH-NOX4依賴性方式增強RCC細(xì)胞的ROS生成[10]。上述證據(jù)提示，G6PD上調(diào)ccRCC細(xì)胞的Cyclin E1和CDK2表達可能與G6PD異常激活導(dǎo)致的ROS失調(diào)有關(guān)。

有研究表明，pSTAT3信號通路在ccRCC中異常激活[29, 30]，并可能與Cyclin E1和CDK2表達升高存在聯(lián)系[31, 32]。此外，我們先前的研究指出，G6PD高表達導(dǎo)致的ccRCC中ROS異常累積，除了可激活pSTAT3外，還可使得NFκB信號通路活性異常升高[12]。NFκB的異常活化在ccRCC中扮演著促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要角色，與ccRCC的腫瘤增殖、侵襲遷移、血管生成、藥物治療等方面密切相關(guān)[33-35]。我們應(yīng)用NFκB信號通路的激活劑(TNFα)和抑制劑(BAY11-7082)分別處理ccRCC細(xì)胞，可見Cyclin E1和CDK2表達的顯著升高和降低；并且上述激活劑和抑制劑可分別逆轉(zhuǎn)ROS清除和累積對二者表達的影響。進一步的生物信息學(xué)分析提示，Cyclin E1和CDK2基因的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)存在NFκB信號功能分子的保守性結(jié)合位點(結(jié)果未展示)，提示這一信號通路可能在G6PD調(diào)控的Cyclin E1和CDK2高表達中發(fā)揮重要作用。然而，pSTAT3、NFκB或者其他信號通路中，究竟哪些功能分子在這一異?！癎6PD-ROS-？- Cyclin E1/CDK2”通路中發(fā)揮媒介作用，其潛在的調(diào)控機制尚不清楚，需在后續(xù)研究中進一步闡明。

ccRCC是主要的RCC組織學(xué)亞型，而其他亞型包括乳頭狀腎細(xì)胞癌和嫌色腎細(xì)胞癌則占RCC的不足20%[36]。本課題組先前研究指出，G6PD在RCC中的蛋白質(zhì)表達水平顯著高于鄰近的正常腎組織，但在這3種亞型之間未見顯著差異[10]。其他研究也表明，在不同 RCC 亞型之間，Cyclin E1和CDK2蛋白質(zhì)表達水平無明顯差異[14, 21]。在之前的研究中，我們在一系列RCC研究常用細(xì)胞系中進行了 G6PD 活性的檢測，包括 ACHN(乳頭狀 RCC 細(xì)胞系)、786-O(ccRCC 細(xì)胞系)和Caki-1(ccRCC 細(xì)胞系)，其中，786-O和Caki-1細(xì)胞中可見脂肪含量的明顯增加[37]。結(jié)果表明，與正常對照細(xì)胞系 HK2(腎近端腎小管上皮細(xì)胞)相比，上述3株RCC細(xì)胞的 G6PD 活性顯著升高[10]。其中，G6PD在Caki-1 細(xì)胞中的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平最高，而 ACHN的G6PD 表達水平和活性較低，786-O細(xì)胞居中。因此，在接下來的研究中，我們分別在ACHN和Caki-1細(xì)胞中進行了G6PD 過表達和敲低穩(wěn)定細(xì)胞的構(gòu)建。Caki-1和ACHN均是由原發(fā)性RCC患者中分離出來的腎來源的永生細(xì)胞，分別來自轉(zhuǎn)移性皮膚部位和胸腔積液的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞。ACHN 和 Caki-1 細(xì)胞生長迅速，并可在免疫缺陷裸鼠中具有致瘤性。目前，這二者已被廣泛引用并應(yīng)用于ccRCC 的各類研究，包括腫瘤發(fā)生發(fā)展、放化療治療、人干擾素以及其他藥物篩選的研究[36]。盡管我們的研究和其他報道表明，G6PD，Cyclin E1 和 CDK2在人 RCC 組織中過表達，并且在各種 RCC 亞型之間無明顯的表達差異[6, 10, 14, 21]，但上述分子在Caki-1 和 ACHN 細(xì)胞中的表達水平卻極為相反。不同的細(xì)胞來源或細(xì)胞譜系可能是這些促癌因子在不同RCC細(xì)胞中表達完全不同的原因。同時，RCC本身的異質(zhì)性可能更有助于造成這種差異。因此，關(guān)于RCC的異質(zhì)性及腫瘤發(fā)生的確切分子機制，仍需進一步研究予以揭示。

綜上，本研究拓展了G6PD在ccRCC發(fā)生發(fā)展中的作用及機制，并分析評估了G6PD上調(diào)的細(xì)胞周期及增殖相關(guān)基因，包括 Cyclin D1，CDK4，CDK6，Cyclin E1和CDK2。結(jié)果表明，Cyclin E1和CDK2在ccRCC 中高表達，并提示ccRCC患者不良預(yù)后。Cyclin E1和CDK2均與G6PD表達呈正相關(guān)。G6PD可能更傾向于通過上調(diào)Cyclin E1和CDK2來促進G1/S細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化，進而促進ccRCC細(xì)胞增殖。G6PD，Cyclin E1和CDK2高表達提示患者不良預(yù)后，并有望成為ccRCC新的診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物，這一發(fā)現(xiàn)將為ccRCC有效診療提供新線索。