厚殼貽貝鳥(niǎo)氨酸-尿素循環(huán)中的關(guān)鍵代謝物及基因分析

王 瑩， 范孝俊， 劉 菲， 張曉林， 范美華， 嚴(yán)小軍， 廖 智

(浙江海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 海洋生物資源與分子工程研究室, 浙江 舟山 316022)

鳥(niǎo)氨酸-尿素循環(huán)(ornithine-urea cycle，OUC)是生物體新陳代謝過(guò)程中的一個(gè)經(jīng)典代謝途徑，不僅與生物體含氮廢物的排泄直接相關(guān)，也涉及滲透壓調(diào)節(jié)、能量的代謝調(diào)節(jié)等諸多生物學(xué)過(guò)程[1,2]。OUC通常被認(rèn)為是陸生生物的代謝特征之一，其代謝產(chǎn)物尿素是陸生生物含氮廢物的主要排泄形式。而水生生物通常被認(rèn)為以直接排氨為主[3]。但水生生物中也發(fā)現(xiàn)OUC途徑的存在，例如較早就注意到雙殼貝類中具有OUC相關(guān)酶的存在[4]。由于水生生物的生存環(huán)境的特殊性，其含氮廢物的排泄主要以直接排氨為主，尿素形式排泄所占比例極低[5]。此外，近年發(fā)現(xiàn)水生生物的OUC途徑可能與其他生物過(guò)程相關(guān)。例如，在魚(yú)類中，OUC途徑與其免疫反應(yīng)的調(diào)控存在關(guān)聯(lián)[6,7]；在貝類中，OUC途徑可能與其低氧耐受有關(guān)[8]。上述結(jié)果表明，盡管水生生物可能存在OUC途徑，但其途徑可能并非以排泄含氮廢物為主要目的，而是參與了體內(nèi)的其他生物學(xué)過(guò)程。

OUC途徑涉及6種關(guān)鍵的代謝酶，包括氨甲酰磷酸合酶I(carbamoyl phosphate synthase I，CPS-I)、鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(ornithine transcarbamoylase, OTC)、精氨琥珀酸合酶(argininosuccinate synthase，ASS)、精氨琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase，ASL)、精氨酸酶(arginase，ARG)以及脲酶(urease，URE)。目前，水生生物OUC途徑研究在魚(yú)類[9]、藻類[10]以及兩棲類[11]等物種中已有相關(guān)報(bào)道，但是對(duì)于貝類OUC途徑的研究尚不多見(jiàn)。對(duì)于貝類OUC途徑的代謝過(guò)程及其可能的生物學(xué)功能仍缺乏系統(tǒng)和深入的認(rèn)識(shí)。

貽貝(Mytilus)是一類具有全球廣泛性分布且具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雙殼貝類，因其強(qiáng)繁殖能力、強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)性以及濾食性特征，貽貝在自然界的能量流動(dòng)、水質(zhì)保護(hù)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面具有重要的生態(tài)意義，并在自然界中占據(jù)了極為重要的生態(tài)位[12,13]。近年來(lái)，厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)，地中海貽貝(Mytilusgalloprovincalis)等代表性貽貝物種的基因組序列先后被解析[14-16]。值得關(guān)注的是，在貽貝基因組序列中，已發(fā)現(xiàn)OUC途徑相關(guān)基因的存在，包括ASS(數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)：CAC5402095.1)、ASL(數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)：CAC5396990.1)、URE等 (見(jiàn)Fig.1)。但OUC途徑對(duì)貝類的生物學(xué)作用及其相關(guān)機(jī)制目前仍不明確。

Fig.1 Schematic diagram of OUC pathway in M. coruscus Red frame and green frame represent the identified and unidentified genes from M. coruscus genome, respectively

以往的研究表明，貽貝表現(xiàn)出對(duì)海洋酸化的較強(qiáng)耐受性[17]，這一特征導(dǎo)致貽貝成為某些高二氧化碳濃度海域的優(yōu)勢(shì)物種[18,19]。作為生物礦化的典型產(chǎn)物，貽貝貝殼的形成依賴于兩個(gè)方面，一是鈣離子的募集，二是CO32-的產(chǎn)生。因工業(yè)革命使海洋酸化導(dǎo)致海水的平均pH值已下降了約0.1個(gè)單位，繼而導(dǎo)致海水CO32-濃度顯著下降[20,21]。因此，海水酸化會(huì)導(dǎo)致貝類生物礦化受阻而導(dǎo)致大規(guī)模死亡。目前，已知部分低等生物(例如部分植物，細(xì)菌和真菌等)中，尿素代謝途徑所產(chǎn)生的CO32-與其生物礦化直接相關(guān)[22,23]。例如，微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀已經(jīng)被證實(shí)是一種在自然界中廣泛存在的生物礦化過(guò)程[24]。這一過(guò)程的關(guān)鍵在于脲酶(urease, EC3.5.1.5)輔助的碳酸鈣礦化，其機(jī)制在于脲酶催化尿素的降解，產(chǎn)生碳酸和氨，氨進(jìn)一步促進(jìn)pH值的上升。之后上升的pH促進(jìn)碳酸分解為CO32-，繼而與鈣離子結(jié)合形成碳酸鈣[25]。貽貝貝殼的生物礦化對(duì)海水酸化表現(xiàn)出的較強(qiáng)耐受性[17-19]。我們推測(cè)，這可能與其體內(nèi)的尿素循環(huán)有關(guān)。為此，本文以厚殼貽貝為研究對(duì)象，對(duì)其OUC途徑中的關(guān)鍵代謝物和關(guān)鍵基因進(jìn)行分析，以期為了解貝類OUC途徑與生物礦化之間的關(guān)聯(lián)提供新的科學(xué)認(rèn)知。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝外套膜鳥(niǎo)氨酸-尿素循環(huán)關(guān)鍵代謝物分析

成年厚殼貽貝采集自浙江舟山嵊泗海域。以潔凈海水暫養(yǎng)于恒溫水族箱(22 ℃，鹽度25 ‰)中。取厚殼貽貝外套膜與后閉殼肌組織，迅速以液氮研磨，參照潘晨等[26]方法，以超濾法(截留分子量為3 kD)收集各組織小分子提取物，經(jīng)冷凍干燥后凍存?zhèn)溆?。利用微量全自?dòng)氨基酸組成分析儀(LA8080，日本日立公司)進(jìn)行OUC途徑關(guān)鍵代謝物定性與定量分析。標(biāo)準(zhǔn)品為AN-II型標(biāo)準(zhǔn)品混合液(貨號(hào)：011-14463，含標(biāo)準(zhǔn)氨基酸及尿素，鳥(niǎo)氨酸和瓜氨酸等標(biāo)準(zhǔn)品，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)，參照潘晨等[26]方法上機(jī)分析。

1.2 精氨酸補(bǔ)充對(duì)厚殼貽貝各組織鳥(niǎo)氨酸-尿素循環(huán)關(guān)鍵代謝物的影響分析

采用后閉殼肌注射方式，對(duì)厚殼貽貝進(jìn)行精氨酸補(bǔ)充。精氨酸預(yù)先以生理鹽水配制成1 mg/mL，注射體積20 μL。注射后分別在0.5、1、2、4和8 h，取厚殼貽貝外套膜及后閉殼肌組織，經(jīng)液氮研磨和代謝物提取后，上氨基酸分析儀，進(jìn)行尿素、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸和瓜氨酸的含量變化分析。

1.3 厚殼貽貝鳥(niǎo)氨酸-尿素循環(huán)相關(guān)酶的基因序列獲取及序列分析

厚殼貽貝的5種OUC途徑關(guān)鍵基因的序列通過(guò)厚殼貽貝基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)：GCA_011752425.2)，以及組織全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù) (數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)：SRX791940和SRX792025)進(jìn)行篩選，經(jīng)序列驗(yàn)證后，提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，編號(hào)分別為ASS(MZ665473)、ASL(MZ665474)、NOA(MZ665475)、ARG(MZ665476)和URE(MZ665478)。

通過(guò)生物信息學(xué)手段開(kāi)展序列分析。其中，開(kāi)放閱讀框采用Lasergene軟件(版本7.0)分析；蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)通過(guò)Expasy數(shù)據(jù)庫(kù)軟件Protparam (http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行在線分析；同源序列搜索在NCBI網(wǎng)站上，利用BLAST軟件在線(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行；結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)以及SWIEE MODEL (https: //swissmodel.expasy.org/)在線進(jìn)行。

1.4 厚殼貽貝尿素代謝相關(guān)酶的基因表達(dá)分析

分別收集厚殼貽貝外套膜及后閉殼肌組織。組織總RNA提取采用柱式microRNA抽提試劑盒(上海生工)并按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。總RNA逆轉(zhuǎn)錄采用試劑盒 (PrimeScriptTMRT reagent Kit, TaKaRa)進(jìn)行；以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s。循環(huán)數(shù)為35。以厚殼貽貝β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，所用引物見(jiàn)Table 1。熒光定量PCR擴(kuò)增采取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用最小二乘法(2-ΔΔCt法)處理數(shù)據(jù)。

Table 1 Primers for qPCR analysis

1.5 13C穩(wěn)定同位素分析

將13C穩(wěn)定同位素標(biāo)記的尿素(購(gòu)自赫澎生物)，以生理鹽水配置成1 mg/mL濃度，采取后閉殼肌注射方式注射至貽貝體內(nèi)；以同體積生理鹽水注射組為對(duì)照組。取注射后的貽貝貝殼，將貝殼研磨成粉末，參照文獻(xiàn)[27]方法，以0.5 mol/L氫氧化鈉溶液在60 ℃條件下進(jìn)行脫有機(jī)質(zhì)處理。處理后的貝殼粉末樣品經(jīng)離心收集沉淀，并反復(fù)以去離子水洗滌，烘干稱重。稱取一定量的貝殼粉末樣品放置于元素分析儀(Isotope cube，德國(guó)Elementar公司)樣品盤中，樣品中的碳元素轉(zhuǎn)化為純凈的CO2氣體后，上樣同位素質(zhì)譜儀(Biovision，德國(guó)Elementar公司)檢測(cè)。穩(wěn)定同位素測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括B2155(δ13C=-26.98‰)、IAEA-CH-6(δ13C=-10.449‰)以及USGS64(δ13C=-40.81‰)，碳穩(wěn)定同位素的定值參照國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為美洲擬箭石。儀器測(cè)定精度為δ13C <±0.2‰。13C穩(wěn)定同位素比值計(jì)算按照公式δ13C =[(Rs / Rst)-1] ×103計(jì)算。其中, Rs和Rst 分別表示樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的重同位素與輕同位素比值(13C/12C)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用平均值±方差 (mean±SD)記錄數(shù)據(jù)，采用3次平行試驗(yàn)。利用SPSS 22.0軟件包中one-way ANOVA單因素方差檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05代表顯著性差異，P<0.01代表極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 厚殼貽貝存在尿素循環(huán)途徑及其關(guān)鍵基因

目前，厚殼貽貝基因組序列已被解析[15-16]。厚殼貽貝各組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也已公布，包括外套膜[28]、血細(xì)胞[29]和足[30]等組織。通過(guò)對(duì)厚殼貽貝基因組以及組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘，本文對(duì)厚殼貽貝參與OUC途徑的關(guān)鍵基因進(jìn)行了鑒定，結(jié)果如Fig.1所示。由圖可見(jiàn)，厚殼貽貝基因中，參與OUC途徑的包括精氨琥珀酸合酶(ASS)、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶(ARG)以及脲酶(URE)。此外，還發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝中存在一氧化氮相關(guān)蛋白(nitric oxide-associated protein，NOA)，該蛋白質(zhì)催化精氨酸和瓜氨酸之間的代謝。但厚殼貽貝基因中缺乏氨甲酰磷酸合酶-I(CPS-I)和鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶(OTC)(Fig.1)。該結(jié)果表明，厚殼貽貝OUC途徑并不完整，但至少存在從瓜氨酸到精氨琥珀酸，再到精氨酸以及尿素和鳥(niǎo)氨酸，與尿素分解為二氧化碳和氨的代謝途徑。上述5條基因的序列分析結(jié)果見(jiàn)Table 2。結(jié)構(gòu)域及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)Fig.2。Table 2表明，厚殼貽貝OUC途徑5種關(guān)鍵基因的序列主要與其他貽貝屬物種的同源序列具有較高相似性，其序列相似性可達(dá)90%以上。而與其他雙殼貝類的同源序列的相似性在60%～80%之間。與脊椎動(dòng)物的同源序列相比，則其序列相似性低于50%。5種關(guān)鍵基因的序列中，均含有與其功能對(duì)應(yīng)的特征結(jié)構(gòu)域。其中，ASS和ARG含有1個(gè)特征結(jié)構(gòu)域，而ASL和URE均含有4個(gè)特征結(jié)構(gòu)域，NOA則含有3個(gè)特征結(jié)構(gòu)域(Fig.2)。預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)特征提示，厚殼貽貝OUC途徑5種關(guān)鍵基因的表達(dá)產(chǎn)物均形成特定有序的空間構(gòu)象。其中，ASS和ASL為四聚體結(jié)構(gòu)模型，NOA 為單體結(jié)構(gòu)模型，ARG和URE均為三聚體結(jié)構(gòu)模型(Fig.2)。

Fig.2 Domain and tertiary structure prediction of the five proteins encoded by the genes involving in OUC pathway in M. coruscus The domain was predicted by SMART. The spatial structure was predicted by SWISS MODEL server. The models of five proteins are tetramer for ASS and ASL, trimer for ARG and URE, and monomer for NOA, respectively

Table 2 Sequential features of five key genes involving in the OUC pathway in M. coruscus

2.2 精氨酸誘導(dǎo)可促進(jìn)厚殼貽貝組織中尿素代謝的代謝物含量變化

為探討厚殼貽貝OUC途徑關(guān)鍵代謝物的含量以及OUC途徑是否與貽貝生物礦化有關(guān)，考慮到外套膜是貝殼形成最為關(guān)鍵的組織[31]。為此，選擇外套膜作為代表性組織，分析其OUC途徑關(guān)鍵代謝物的含量，同時(shí)以后閉殼肌組織作為參照。利用氨基酸分析儀分別對(duì)外套膜及后閉殼肌組織進(jìn)行了游離氨基酸分析。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫時(shí)間及曲線下面積，重點(diǎn)計(jì)算了精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、瓜氨酸、尿素和天冬氨酸的含量，結(jié)果見(jiàn)Fig.3。由Fig.3可見(jiàn)，OUC途徑關(guān)鍵代謝物在厚殼貽貝外套膜組織中的含量差異較大。其中，尿素在外套膜組織中含量最高，達(dá)到79.54±0.87 μg/g干組織，其含量約為瓜氨酸的260倍，鳥(niǎo)氨酸的20倍。而精氨酸與天冬氨酸則在外套膜中未檢出。在后閉殼肌中，5種代謝物均能檢出。其中，尿素含量最高，達(dá)到69.28±1.16 μg/g干組織；天冬氨酸含量最低，僅為0.18±0.027 μg/g干組織。

Fig.3 The concentration of five metabolites of OUC pathway in mantle and adductor muscle of M. coruscus The concentration of metabolites was determined by an amino acid analyzer using standard urea, citrulline, ornithine, arginine, and aspartate, respectively, and calculated by the area under the curve (AUC) comparing with the standard curve. The data were presented as mean ± SD (n = 3); ND represents no detection

進(jìn)一步采用精氨酸注射誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后，不同代謝物在外套膜和后閉殼肌組織中的含量變化見(jiàn)Fig.4。

由Fig.4可見(jiàn)，精氨酸注射后，外套膜組織中，5種代謝物含量均發(fā)生明顯變化。其中，尿素含量在注射后1 h即達(dá)到峰值。其含量相比對(duì)照組(0 h組)增加約1.8倍；之后在2 h明顯下降(P<0.01)，之后逐步回升至對(duì)照組水平。瓜氨酸含量在精氨酸注射后，在2 h及4 h急劇下降至不能檢測(cè)到。鳥(niǎo)氨酸含量變化不明顯(P>0.05)，維持在3.29 ± 0.025至11.40 ± 1.55 μg/g干組織之間；而精氨酸和天冬氨酸則在對(duì)照組中未能檢出。但在注射精氨酸后，其含量分別增加至19.72 ± 0.05和 21.81 ± 0.01 μg/g干組織，隨后保持平穩(wěn)。后閉殼肌中，精氨酸注射后導(dǎo)致尿素含量出現(xiàn)明顯增加(P<0.01)，其峰值出現(xiàn)在2 h，相比對(duì)照組，含量上升約1.5倍。瓜氨酸含量在注射精氨酸后急劇下降至無(wú)法檢測(cè)；鳥(niǎo)氨酸含量在精氨酸注射后有輕微上升，而精氨酸本身在后閉殼肌注射精氨酸后明顯上升，并在0.5 h后維持穩(wěn)定。天冬氨酸在精氨酸注射后0.5 h出現(xiàn)明顯上調(diào)，隨后急劇下降，在2和4 h已無(wú)法檢測(cè)到。隨后，在8 h恢復(fù)至對(duì)照組水平(Fig.4)。

Fig.4 The content changes of five metabolites of OUC pathway in mantle and adductor muscle M. coruscus was injected with 20 μL arginine (1 mg/mL). The mantle and the adductor muscle were collected, respectively at post-induction of 0, 0.5, 1, 2, 4, and 8 hours. The concentration of metabolites was determined by amino acid analyzer. The data were presented as mean ± SD (n = 3); The statistical analysis of differences was performed by SPSS (v25.0) with one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple range test. * and ** represents the significance of the difference P<0.05 and P<0.01 (n=3), respectively, compared with that in control group (0 h). ND represents no detection

2.3 精氨酸誘導(dǎo)可促進(jìn)厚殼貽貝組織中尿素代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化

對(duì)5種厚殼貽貝OUC途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)差異分析結(jié)果見(jiàn)Fig.5。由圖可見(jiàn)，厚殼貽貝5種OUC途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)量在外套膜及后閉殼肌組織中的表達(dá)譜類似，相對(duì)表達(dá)量較高的分別為NOA、ASL和ARG，而ASS和URE表達(dá)量較低。

Fig.5 The expression level of five genes involving in OUC pathway in mantle and adductor muscle of M. coruscus The relative expression level was calculated by 2-△△Ct method with actin as the reference gene, and presented as mean ± SD (n = 3)

進(jìn)一步采用精氨酸注射誘導(dǎo)，分析誘導(dǎo)后5種OUC途徑關(guān)鍵基因在外套膜及后閉殼肌組織中的表達(dá)量變化，結(jié)果見(jiàn)Fig.6。精氨酸注射后，外套膜組織中，ASS基因的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組出現(xiàn)先顯著上調(diào)(P<0.01)后顯著下調(diào)(P<0.01)；ASL基因的表達(dá)量則在精氨酸注射后2 h出現(xiàn)顯著上調(diào)(P<0.01)，隨后恢復(fù)正常水平；NOA基因的表達(dá)量在注射精氨酸后2 h出現(xiàn)急劇下降，隨后恢復(fù)正常水平；ARG基因的表達(dá)量在注射精氨酸后基本維持穩(wěn)定，僅在2 和4 h有輕微下調(diào)(P<0.05)；URE基因的表達(dá)量則在精氨酸注射2 h后急劇上升(P<0.01)，其表達(dá)量峰值相比對(duì)照組增加約100倍。后閉殼肌中，ASS基因表達(dá)量在注射精氨酸后出現(xiàn)穩(wěn)步下調(diào)；而ASL基因表達(dá)量則穩(wěn)步上調(diào)；NOA基因表達(dá)量在精氨酸注射后2 h急劇下調(diào)(P<0.01)；ARG基因表達(dá)量則在精氨酸注射后出現(xiàn)明顯上調(diào)(P<0.01)，峰值出現(xiàn)在注射后4 h，隨后恢復(fù)正常水平；而URE基因表達(dá)量則在精氨酸注射后出現(xiàn)穩(wěn)步上調(diào)，其峰值出現(xiàn)在8 h(Fig.6)。

Fig.6 The change of expression level of five genes involving in OUC pathway in mantle and adductor muscle after injection of arginine M. coruscus was injected with 20 μL arginine (1 mg/mL), and the mantle and the adductor muscle were collected respectively at post-induction of 0.5 , 1 , 2 , 4 , and 8 hours. The relative expression levels of five genes were calculated by 2-△△Ct method and presented as mean ± SD (n = 3). The statistical analysis of differences was performed by SPSS (v25.0) with one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple range test. *and ** represents the significance of the difference P<0.05 and P<0.01 (n = 3), respectively, compared with that of 0.5 hours

2.4 13C標(biāo)記尿素注射促進(jìn)厚殼貽貝貝殼中δ13C比值上升

厚殼貽貝經(jīng)13C穩(wěn)定同位素標(biāo)記尿素注射后，其貝殼中13C穩(wěn)定同位素分析結(jié)果見(jiàn)Fig.7。由Fig.7可見(jiàn)，厚殼貽貝貝殼中13C/12C的比值(δ13C)在注射不同濃度的13C標(biāo)記尿素后，相比于對(duì)照組(0 h組)均明顯上升(P<0.05)。其上升趨勢(shì)呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性，在24 h后即達(dá)到峰值(P<0.01)；但濃度依賴性不明顯，20 μg及以上注射量并未導(dǎo)致δ13C值發(fā)生明顯變化(P>0.05)。

Fig.7 The changes of 13C/12C (δ13C) in mussel shell after injection of 13C labeled urea M. coruscus was injected with different volume (10, 20, 30, and 40 μL) of 13C labeled urea(1mg/mL). The shell was collected at post-injection of 0, 12, 24, and 48 hours, respectively. The changes of δ13C were determined by an isotope mass spectrometer. The data were presented as mean ± SD (n = 3); Statistical analysis of differences was performed by SPSS (v25.0) with one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple range test. * and ** represents the significance of the difference P<0.05 and P<0.01 (n=3), respectively, compared with that of control group at 0 hour

3 討論

此前研究中，盡管發(fā)現(xiàn)貝類中存在OUC途徑關(guān)鍵基因及其主要代謝物，但是該途徑在貝類中的生理作用及代謝過(guò)程尚不明確。本文通過(guò)對(duì)厚殼貽貝外套膜及后閉殼肌組織OUC途徑的關(guān)鍵代謝物和關(guān)鍵基因分析，首先確認(rèn)了5種OUC途徑關(guān)鍵基因及其主要代謝物在上述組織中的存在。厚殼貽貝外套膜及后閉殼肌組織均具有較高濃度的尿素(Fig.3)，但外套膜中精氨酸含量極低，推測(cè)外套膜組織中，絕大多數(shù)精氨酸可能已分解為尿素并儲(chǔ)存于該組織中。這也表明，外套膜中高濃度的尿素必然有其特定的意義。精氨酸是尿素分子合成的前體物質(zhì)。本文研究確認(rèn)，精氨酸注射可誘導(dǎo)厚殼貽貝外套膜組織產(chǎn)生更多的尿素分子并進(jìn)一步激活URE，進(jìn)而促進(jìn)尿素的降解。但奇怪的是，精氨酸注射雖然導(dǎo)致外套膜中尿素分子含量上升，但精氨酸分解為尿素過(guò)程中的另一種產(chǎn)物，即鳥(niǎo)氨酸的含量卻并未明顯增加；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，外套膜中ARG基因的表達(dá)量?jī)H在精氨酸注射后1 h有輕微上升(Fig.6)，這表明，外套膜中精氨酸注射后尿素濃度的增高可能還有其他因素參與。值得關(guān)注的是，由于精氨酸注射部位是后閉殼肌，本文發(fā)現(xiàn)，后閉殼肌中精氨酸注射導(dǎo)致了ARG的表達(dá)量明顯上升，且其表達(dá)量上升幅度約為外套膜中的20倍(Fig.6)。同時(shí)，后閉殼肌中精氨酸注射也導(dǎo)致了尿素含量的明顯上升，但其上升幅度較外套膜組織要低(Fig.4)。因此，推測(cè)后閉殼肌注射精氨酸，激活了后閉殼肌的精氨酸酶，導(dǎo)致產(chǎn)生更多的尿素，同時(shí)后閉殼肌中的尿素進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至外套膜，從而導(dǎo)致外套膜中尿素含量的急劇增加。此外，外套膜中，鳥(niǎo)氨酸含量的穩(wěn)定可能與其在維持組織細(xì)胞滲透壓中的重要貢獻(xiàn)有關(guān)[32,33]，推測(cè)鳥(niǎo)氨酸可能在外套膜中維持了某種穩(wěn)態(tài)，且精氨酸注射導(dǎo)致產(chǎn)生的多余鳥(niǎo)氨酸可能通過(guò)別的途徑進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。但該推測(cè)尚需后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

瓜氨酸與天冬氨酸均為精氨琥珀酸的合成前體，ASS是催化這一過(guò)程的關(guān)鍵基因。本文發(fā)現(xiàn)，ASS表達(dá)量的上調(diào)可加快精氨琥珀酸的合成速率，導(dǎo)致瓜氨酸的含量的下降；而隨后ASS表達(dá)量的下調(diào)會(huì)使這一反應(yīng)過(guò)程減緩，從而導(dǎo)致瓜氨酸的積累。這可能是外套膜中精氨酸注射后，瓜氨酸含量出現(xiàn)急劇下降以及隨后恢復(fù)正常水平的內(nèi)在原因。此外，天冬氨酸在外套膜中隨著精氨酸注射出現(xiàn)含量的急劇增加以及后續(xù)的穩(wěn)定保持，表現(xiàn)出積累效應(yīng)，這一點(diǎn)尚無(wú)法解釋。但本文注意到精氨酸注射后4 h，外套膜中ASL的基因表達(dá)量出現(xiàn)輕微下調(diào)，推測(cè)精氨琥珀酸的分解速率會(huì)因此下降，從而導(dǎo)致外套膜中精氨琥珀酸的含量會(huì)在后期出現(xiàn)積累，而精氨琥珀酸的積累會(huì)導(dǎo)致天冬氨酸的積累，這一點(diǎn)在最近針對(duì)貝類低氧狀態(tài)下OUC途徑的研究中獲得證實(shí)[8]。與外套膜不同的是，后閉殼肌中ASS基因的表達(dá)量隨著精氨酸的注射表現(xiàn)出下調(diào)，但是ASL基因表達(dá)量則出現(xiàn)穩(wěn)步上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)ASL的上調(diào)導(dǎo)致了精氨琥珀酸的持續(xù)降解，從而導(dǎo)致更多的瓜氨酸和天冬氨酸合成為精氨琥珀酸，因而瓜氨酸和天冬氨酸含量均顯著下降。

值得關(guān)注的是，厚殼貽貝中，精氨酸和瓜氨酸之間存在直接代謝通路(Fig.1)，其關(guān)鍵基因在于NOA。精氨酸注射對(duì)瓜氨酸含量具有明顯抑制作用，推測(cè)精氨酸抑制了NOA的表達(dá)。精氨酸注射后，NOA基因的表達(dá)量下調(diào)證實(shí)了這一推測(cè)(Fig.6)。NOA基因目前被認(rèn)為是植物中通過(guò)催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸并釋放出一氧化氮的關(guān)鍵基因，因而對(duì)植物中一氧化氮合成以及免疫調(diào)節(jié)具有重要作用[34]；而在動(dòng)物中，一氧化氮的產(chǎn)生被認(rèn)為與一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)有關(guān)[35]。盡管NOS基因的同源序列在貽貝屬中已被鑒定到，但該基因在貽貝中的生理學(xué)作用尚未可知。已有研究發(fā)現(xiàn)，貝類中NOS與一氧化氮的合成以及貽貝的免疫和變態(tài)發(fā)育存在密切關(guān)系，但其NOS與NOA基因在序列上具有較大差異，兩者分屬于不同的基因家族[36,37]。本研究中觀察到，精氨酸注射不論是對(duì)瓜氨酸含量還是NOA基因表達(dá)量均具有抑制作用，表明NOA在厚殼貽貝中催化的可能并非精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的過(guò)程，而是催化了瓜氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸的反應(yīng)(Fig.1)。但該推測(cè)尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

OUC途徑的終產(chǎn)物是尿素分子。目前，對(duì)于尿素在貝類中存在的意義通常被認(rèn)為有如下兩種可能，其一是通過(guò)尿素合成，防止缺氧條件下，游離氨對(duì)貝類組織的毒性[8,38]；其二是尿素在貝類中可能作為其共生藻類的氮源[39]。而在部分植物以及微生物研究中，尿素已被證實(shí)是一種生物礦化相關(guān)主要分子[22,40]。厚殼貽貝外套膜中高濃度的尿素分子暗示著在貽貝中，尿素可能也參與了其貝殼的生物礦化過(guò)程。利用13C穩(wěn)定同位素標(biāo)記的尿素注射厚殼貽貝，結(jié)果表明，厚殼貽貝貝殼中13C/12C比值明顯升高(Fig.7)。在本研究中，貽貝貝殼粉末經(jīng)強(qiáng)堿處理以確保貝殼中的有機(jī)物能被全部去除，從而排除了尿素所轉(zhuǎn)化的有機(jī)物在貝殼中的存在[27]。貝殼中13C/12C比值的升高意味著尿素分子中的C元素參與了貝殼碳酸鈣的形成，但具有某種飽和性 (Fig.7)，表明尿素參與貝殼形成具有一定限制。近年來(lái)，人們已開(kāi)始注意到，貝殼形成過(guò)程中的CO32-雖然主要來(lái)源于海水，但內(nèi)源性CO32-對(duì)貝類貝殼形成也可能具有重要作用[41,42]；早期研究中，人們發(fā)現(xiàn)貽貝在海水酸化脅迫下，其貝殼形成雖未明顯受到影響，但其攝食速率和代謝速率會(huì)明顯增加[42,43]。這一現(xiàn)象表明，貽貝貝殼在生物礦化過(guò)程中，其內(nèi)源性CO32-對(duì)其貝殼形成具有重要作用，甚至可以抵消外源性CO32-濃度的下降而導(dǎo)致的生物礦化異常，以此來(lái)對(duì)抗環(huán)境變化對(duì)貝殼形成的不利影響。但目前人們對(duì)于貝類貝殼的形成中其內(nèi)源性CO32-的來(lái)源尚不明確。本研究結(jié)果初步證實(shí)，OUC途徑在貽貝體內(nèi)的存在，以及該循環(huán)的終產(chǎn)物尿素可能參與了貝殼的形成。上述研究為深入了解貽貝OUC途徑與生物礦化之間的關(guān)聯(lián)，以及探討貽貝對(duì)海水酸化耐受性的內(nèi)在分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。