黃芩苷通過(guò)苦味受體促進(jìn)哮喘小鼠呼吸道炎性細(xì)胞凋亡

郭雪冬， 儀慧蘭

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)系， 太原 030006)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是一種由多種炎性細(xì)胞參與的氣道慢性反應(yīng)性炎癥，以炎性細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等)浸潤(rùn)為主要病理特征[1-3]。炎性細(xì)胞的凋亡異常增加了哮喘的炎癥強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間。因此，對(duì)炎性細(xì)胞凋亡的調(diào)控在哮喘氣道炎癥的緩解中具有重要意義[2,3]。

細(xì)胞凋亡受細(xì)胞自身基因的調(diào)控。凋亡抑制基因?qū)σ种萍?xì)胞凋亡發(fā)揮作用，促凋亡基因?qū)?xì)胞凋亡發(fā)生有促進(jìn)作用。其中，Bcl2和Bax被認(rèn)為是抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的最重要的調(diào)控基因。Bcl2主要通過(guò)阻斷細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程，而B(niǎo)ax的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者支氣管活檢標(biāo)本中，Bcl2 mRNA表達(dá)升高，嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少[5]。糖皮質(zhì)激素作為哮喘病臨床控制藥物，可抑制肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡，使患者哮喘癥狀緩解、肺功能改善[1,3]。但長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致多種不良反應(yīng)，例如引起感染擴(kuò)散、血鉀降低和骨質(zhì)疏松等[2,3]。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)新的哮喘治療和干預(yù)藥物是多年來(lái)藥學(xué)研究需要破解的難題。

中草藥在治療哮喘方面效果獨(dú)到，不良反應(yīng)小。研究發(fā)現(xiàn)，穿山龍、淫羊藿苷和麻荊止咳顆粒等中草藥成分和制劑可通過(guò)調(diào)節(jié)哮喘鼠肺內(nèi)Bcl2和Bax的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，促進(jìn)肺組織中炎性細(xì)胞凋亡，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕氣道炎癥，從而發(fā)揮平喘作用[2,3,6]。前期研究表明，實(shí)驗(yàn)小鼠哮喘發(fā)生與其呼吸道苦味受體(bitter taste receptors，Tas2rs)及苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)[7]；而檸檬苦素可使PM 2.5致慢性氣道炎癥大鼠氣管和肺組織中Tas2r14的表達(dá)增加，抑制TNF-α和IL-13產(chǎn)生和釋放[8]。這些結(jié)果提示，中草藥含有的苦味物質(zhì)可能在哮喘治療和干預(yù)中發(fā)揮了作用。選擇適合的苦味劑激活呼吸道苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可能對(duì)哮喘病的預(yù)防和治療有積極的作用[7]。

苦味化合物黃芩苷(baicalin，BA)是中藥材黃芩的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗過(guò)敏等多種藥理活性[9-11]。近期研究表明，黃芩苷具有一定的抗哮喘作用，可通過(guò)降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、IL-13和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，抑制卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道重塑[12]；能通過(guò)苦味信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子通道，舒張哮喘豚鼠支氣管平滑肌[13]；還能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡減輕OVA致敏性哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性[11]。但黃芩苷緩解哮喘的機(jī)制尚不清楚，是否與呼吸道炎性細(xì)胞凋亡及苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)未見(jiàn)報(bào)道。

為進(jìn)一步探討黃芩苷的平喘機(jī)制，本研究以哮喘炎癥反應(yīng)的炎性細(xì)胞為切入點(diǎn)，探討黃芩苷對(duì)呼吸道中炎性細(xì)胞凋亡的影響及其與苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

氯化鈉、氫氧化鋁、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、無(wú)水乙醇、磺基水楊酸、甲醇、伊紅、甲醛、二甲苯、蘇木精，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；黃芩苷(BA)購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；卵清蛋白(OVA，gradeV)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自上海倍卓生物科技有限公司；胱天蛋白酶3(caspase3)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

Table 1 Primer sequences used in real-time RT-PCR

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

選5周齡SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào): SCXK (京) 2016-0006)，飼養(yǎng)于無(wú)特定病原菌的環(huán)境中(溫度：23±1℃，相對(duì)濕度：55%±10%，光照12 h/黑暗12 h)，自由飲用蒸餾水，喂食全價(jià)營(yíng)養(yǎng)大顆粒飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重將小鼠隨機(jī)分為3組(每組6只)：對(duì)照(CK)組、OVA組和OVA + BA組。將動(dòng)物分組日記為第0 d。于第0 d和第7 d，OVA組和OVA+BA組，每只小鼠腹腔注射含100 μg OVA和 2 mg 氫氧化鋁的抗原液200 μL；CK組小鼠腹腔注射200 μL無(wú)菌生理鹽水。第14 d至第20 d，OVA組和OVA+BA組小鼠吸入1% OVA進(jìn)行霧化激發(fā)，每d，0.5 h，連續(xù)7 d。OVA + BA組小鼠在OVA霧化前按40 mg/kg/d的劑量進(jìn)行BA灌胃。

1.3 支氣管肺泡灌洗及炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)

小鼠麻醉后打開(kāi)胸腔結(jié)扎右肺，隨后暴露頸部氣管插管固定，無(wú)菌生理鹽水灌洗左側(cè)肺葉3次，每次1 mL。取10 μL收集的肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。其余BALF 于1 500 r/min低溫離心10 min，沉淀用100 μL生理鹽水重懸，取20 μL涂片，干燥后用Wright-Gimesa染液染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)不同類(lèi)型炎性細(xì)胞數(shù)目。取右肺中葉，固定于4% 的中性甲醛中，右肺其余組織及氣管經(jīng)液氮冷凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 組織切片的制備與觀察

取中性甲醛固定的肺組織，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋并切片(4～5 μm)。蘇木素-伊紅(HE)染色后封片，光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)觀察，DP72數(shù)碼成像系統(tǒng)采集圖像。

1.5 胱天蛋白酶3活性檢測(cè)

取凍存的小鼠肺組織，按照胱天蛋白酶3活性檢測(cè)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)說(shuō)明書(shū)對(duì)胱天蛋白酶3活性進(jìn)行測(cè)定。

1.6 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

取凍存的肺和氣管組織用Trizol法提取總RNA，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，選正常小鼠呼吸道中表達(dá)量相對(duì)較高的4個(gè)Tas2rs(Tas2r108、Tas2r126、Tas2r135和Tas2r143)、苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子味導(dǎo)素 α 亞基(α-gusducin，α-gust)和瞬時(shí)電位陽(yáng)離子通道M5(transient receptor potential cation channel subfamily M member 5，Trpm5)[7]、黏蛋白Muc5ac基因，以及凋亡相關(guān)基因P53、Bax、Bcl2和Casp3，設(shè)計(jì)合成相應(yīng)引物，用CFX96TM Real-Time PCR Detection System(Bio Rad)進(jìn)行基因擴(kuò)增。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法[14]計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)，采用IBM SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，檢驗(yàn)各組間差異顯著性。用不同字母表示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 卵清蛋白誘發(fā)實(shí)驗(yàn)小鼠哮喘

在模型建立的過(guò)程中，隨著OVA霧化激發(fā)次數(shù)增多，OVA組小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、抓耳撓背、弓背直立、豎毛、前肢縮抬、二便失禁等哮喘急性發(fā)作癥狀。與OVA組相比，OVA+BA組小鼠哮喘急性發(fā)作癥狀減輕。CK組小鼠在蒸餾水霧化吸入中未見(jiàn)明顯異常。此外，小鼠的體重(Fig.1A)、肺臟重量(Fig.1B)及肺臟臟器系數(shù)(Fig.1C)在各處理組小鼠間無(wú)顯著差異。說(shuō)明OVA誘導(dǎo)小鼠哮喘及黃芩苷干預(yù)未對(duì)小鼠體重、肺臟重量及肺臟臟器系數(shù)產(chǎn)生明顯影響。

Fig.1 Body weight (A), lung weight (B) and lung/body coefficient (C) of mice CK, control; OVA,asthmatic mice elicited by ovalbumin; OVA+BA, baicalin intervention in OVA-induced asthmatic mice. Data were expressed as mean ± SE (n = 6)

2.2 黃芩苷緩解哮喘小鼠呼吸道炎癥反應(yīng)

鏡檢發(fā)現(xiàn)，CK組BALF中主要為巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞甚少；與CK組相比，OVA組白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)細(xì)胞數(shù)(嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)均顯著增高(P<0.05)，分別為CK組的25.71倍、106.71倍、83.83倍、7.84倍和11.66倍；OVA+BA組白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著低于OVA組(P<0.05)，分別為OVA組的71%、55%和55%。結(jié)果表明，OVA誘發(fā)了小鼠肺部過(guò)敏性炎癥反應(yīng)，黃芩苷干預(yù)能緩解OVA誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。

Fig.2 The number of total cells (A) and differential cells (B) in mouse bronchoalveolar lavage fluid (BALF) CK, control; OVA, asthmatic mice elicited by ovalbumin; OVA+BA, baicalin intervention in OVA-induced asthmatic mice. EOS, eosinophils; NEU, neutrophils; LYM, lymphocytes; MAC, macrophages. Data were expressed as mean ± SE (n = 6). Columns labeled with different letters indicate a significant difference at P<0.05

2.3 黃芩苷緩解哮喘小鼠肺組織損傷并下調(diào)Muc5ac表達(dá)

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，CK組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清楚，肺泡間隔正常，氣道上皮完整，上皮細(xì)胞排列整齊；OVA組肺泡腔明顯狹窄，肺泡間隔增厚，支氣管周?chē)梢?jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管基底膜增厚；OVA+BA組小鼠肺組織病變程度比OVA組明顯減輕，雖然與CK組相比存在肺泡腔狹窄、支氣管基底膜增厚現(xiàn)象，但支氣管周?chē)仔约?xì)胞數(shù)量明顯減少(Fig.3A)。與此同時(shí)，小鼠肺組織中Muc5ac的mRNA水平在OVA組顯著增高，其表達(dá)量約為CK組的53倍(P<0.05)，OVA+BA組顯著低于OVA組，僅為OVA組Muc5ac表達(dá)量的1/3(P<0.05)(Fig.3B)，與肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果一致。

Fig.3 Effect of baicalin on asthmatic mouse lung tissue structure and the mRNA expression of Muc5ac in mouse lungs CK, control; OVA, asthmatic mice elicited by ovalbumin; OVA+BA, baicalin intervention in OVA-induced asthmatic mice.(A) Representative histopathological images of mice lungs with HE staining. Scale bar is 50 μm. Blue arrows indicated thickened subepithelial cell layers, yellow arrows indicated diminished alveolar spaces and black arrows indicated inflammatory cells infiltration. (B) Relative level of Muc5ac expression in mice lungs. β-Actin was used as an internal control. Data were expressed as mean ± SE (n = 6). Columns labeled with different letters indicate a significant difference at P<0.05

上述肺部組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和Muc5ac表達(dá)的改變說(shuō)明，腹腔注射致敏加霧化吸入OVA誘發(fā)了實(shí)驗(yàn)小鼠的哮喘性疾病，黃芩苷干預(yù)能夠降低哮喘小鼠的炎癥水平，改善肺功能，減輕肺損傷。

2.4 黃芩苷減輕哮喘對(duì)小鼠呼吸道Tas2rs及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用

依據(jù)前期檢測(cè)正常小鼠肺組織中Tas2rs的結(jié)果，選擇表達(dá)量較高的4個(gè)Tas2rs基因及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，檢測(cè)其在哮喘模型和干預(yù)組小鼠呼吸道組織中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠氣管組織中所檢4個(gè)Tas2rs基因Tas2r108、Tas2r126、Tas2r135和Tas2r143及苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子α-gust和Trpm5的mRNA水平在OVA組均顯著降低，分別為CK組的10%、42%、16%、42%、29%和9%(P<0.05)，在OVA+BA組均顯著升高，分別為OVA組的7.89倍、1.70倍、3.12倍、1.90倍、1.89倍和6.99倍(P<0.05)(Fig.4)；小鼠肺組織中，OVA組Tas2r108、Tas2r135、α-gust和Trpm5的mRNA水平顯著降低，分別為CK組的50%、53%、71%和36%(P<0.05)；OVA+BA組Tas2r108、α-gust和Trpm5的mRNA水平顯著升高，分別為OVA組的1.32倍、1.22倍和2.17倍(P<0.05)；與OVA組相比，OVA+BA組Tas2r135的mRNA表達(dá)量有所升高，但無(wú)明顯差異；Tas2r126和Tas2r143的mRNA表達(dá)量在各組小鼠肺組織中無(wú)顯著差異(Fig.5)。結(jié)果表明，苦味受體及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在OVA組呼吸道組織中轉(zhuǎn)錄抑制，即苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在哮喘鼠呼吸道中被抑制；其中部分Tas2rs和α-gust、Trpm5可被黃芩苷激活表達(dá)，說(shuō)明黃芩苷可能發(fā)揮苦味受體激動(dòng)劑的作用，黃芩苷干預(yù)組哮喘癥狀減輕則表明，通過(guò)黃芩苷激活苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可對(duì)哮喘病治療發(fā)揮作用。

Fig.4 Relative mRNA expression of Tas2rs (A), α-gust and Trpm5 (B) in mouse trachea CK, control; OVA, asthmatic mice elicited by ovalbumin; OVA+BA, baicalin intervention in OVA-induced asthmatic mice. β-Actin was used as an internal control. Data were expressed as mean ± SE (n = 6). Columns labeled with different letters indicate a significant difference at P<0.05

Fig.5 Relative mRNA expression of Tas2rs (A), α-gust and Trpm5 (B) in mouse lung CK, control; OVA, asthmatic mice elicited by ovalbumin; OVA+BA, baicalin intervention in OVA-induced asthmatic mice. β-Actin was used as an internal control. Data were expressed as mean ± SE (n = 6). Columns labeled with different letters indicate a significant difference at P<0.05

2.5 黃芩苷激活哮喘小鼠呼吸道凋亡通路

小鼠氣管組織中(Fig.6)，OVA組凋亡抑制基因Bcl2表達(dá)水平顯著上升，為CK組的146%(P<0.05)，促凋亡基因P53、Bax及Casp3的表達(dá)水平顯著降低，分別為CK組的26%、20%和30%(P<0.05)；OVA+BA組Bcl2表達(dá)水平顯著下降，為OVA組的81%(P<0.05)，而P53、Bax及Casp3的mRNA水平顯著升高，分別為OVA組的2.91倍、3.97倍和2.42倍(P<0.05)。小鼠肺組織中(Fig.7)，OVA組上述基因表達(dá)趨勢(shì)與氣管組織一致；與OVA組相比，OVA+BA組中Bcl2轉(zhuǎn)錄下調(diào)、P53 轉(zhuǎn)錄上調(diào)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而B(niǎo)ax和Casp3 的表達(dá)水平顯著升高，分別為OVA組的1.60倍和1.20倍(P<0.05)，Bax/Bcl2比值顯著升高，為OVA組的1.38倍(P<0.05)。結(jié)果表明，線(xiàn)粒體凋亡通路關(guān)鍵基因在OVA組小鼠呼吸道組織中轉(zhuǎn)錄抑制，哮喘氣道炎癥與細(xì)胞凋亡通路抑制同時(shí)發(fā)生；黃芩苷干預(yù)組促凋亡基因表達(dá)增強(qiáng)，凋亡抑制基因轉(zhuǎn)錄抑制，線(xiàn)粒體凋亡通路呈激活狀態(tài)。該結(jié)果提示，OVA 組小鼠肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、OVA+BA組小鼠肺組織中炎性細(xì)胞減少可能與細(xì)胞凋亡通路的抑制和激活有關(guān)。

Fig.6 Effect of baicalin on mRNA expression of apoptosis-related genes in mouse trachea CK, control; OVA, asthmatic mice elicited by ovalbumin; OVA+BA, baicalin intervention in OVA-induced asthmatic mice. β-Actin was used as an internal control. Data were expressed as mean ± SE (n = 6). Columns labeled with different letters indicate a significant difference at P<0.05

Fig.7 Effect of baicalin on mRNA expression of apoptosis-related genes in mouse lung CK, control; OVA, asthmatic mice elicited by ovalbumin; OVA+BA, baicalin intervention in OVA-induced asthmatic mice. β-Actin was used as an internal control. Data were expressed as mean ± SE (n = 6). Columns labeled with different letters indicate a significant difference at P<0. 05

胱天蛋白酶3是細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn)，OVA組小鼠胱天蛋白酶3的活化程度顯著低于CK組(P<0.05)，為CK組的56%，而OVA+BA組胱天蛋白酶3的活化程度顯著高于OVA組(P<0.05)，為OVA組的2.9倍(Fig.8)。

Fig.8 The caspase3 activity in mouse lungs CK, control; OVA, asthmatic mice elicited by ovalbumin; OVA+BA, baicalin intervention in OVA-induced asthmatic mice. Data were expressed as mean ± SE (n = 6). Columns labeled with different letters indicate a significant difference at P<0. 05

3 討論

本文用腹腔注射致敏加霧化吸入OVA建立了小鼠哮喘模型。哮喘小鼠出現(xiàn)躁動(dòng)不安、打噴嚏和呼吸急促等反應(yīng)，肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏液高分泌，與前人報(bào)道的OVA致敏鼠哮喘的癥狀類(lèi)似，說(shuō)明本文所建立的小鼠哮喘模型具有較好的代表性[7,11,15]。OVA+BA組小鼠肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及黏液分泌程度較OVA組明顯減輕，說(shuō)明黃芩苷干預(yù)可以減輕小鼠哮喘。與此同時(shí)，呼吸道苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和線(xiàn)粒體凋亡途徑基因在哮喘鼠中被抑制，受黃芩苷干預(yù)而激活。因此，黃芩苷干預(yù)可能激活了哮喘鼠呼吸道苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)了肺部炎性細(xì)胞凋亡、黏液分泌減少，從而減輕肺部炎癥和損傷，緩解哮喘發(fā)作。

氣道黏液高分泌是哮喘的重要病理特征，可引起氣道阻塞，增加支氣管哮喘的病死率[16]。MUC5AC是氣道上皮杯狀細(xì)胞分泌的主要黏蛋白，Muc5ac基因的上調(diào)表達(dá)是OVA致敏哮喘小鼠氣道杯狀細(xì)胞化生的標(biāo)志[16]。前期研究發(fā)現(xiàn)，苦味劑桔梗皂苷能夠抑制哮喘小鼠Muc5ac基因表達(dá)和蛋白質(zhì)積累，降低黏液產(chǎn)生和分泌[17]。本研究中苦味劑黃芩苷能夠抑制哮喘小鼠肺組織中Muc5ac的轉(zhuǎn)錄，減少黏液量。這些結(jié)果表明，苦味物質(zhì)能抑制Muc5ac的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在此過(guò)程中Tas2rs及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子發(fā)揮了重要作用。

苦味受體是一類(lèi)表達(dá)于舌上皮味蕾細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸道和生殖系統(tǒng)等多個(gè)部位的G蛋白偶聯(lián)受體[18]。近年來(lái)大量的研究顯示，苦味受體及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在呼吸道的表皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及免疫細(xì)胞中表達(dá)；在離體人氣道上皮分布有苦味受體，用苦味化合物苦精刺激可引起纖毛搏動(dòng)頻率增加[19]；苦味受體激動(dòng)劑奎寧可使OVA致敏哮喘小鼠呼吸道平滑肌松弛[20]，苦味受體激動(dòng)劑氯喹和奎寧可減輕OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠的氣道炎癥，抑制氣道黏液的積累，降低炎癥反應(yīng)[15]。因此，苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為哮喘的治療提供了新的靶點(diǎn)。苦味受體的表達(dá)具有組織特異性，并與特定生理和病理過(guò)程有關(guān)[21,22]，苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子α-gusducin與TRPM5共表達(dá)，參與細(xì)胞對(duì)苦味信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[7,23]。本文結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[7]，篩選并檢測(cè)了小鼠呼吸道中Tas2r108、Tas2r126、Tas2r135和Tas2r143及苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子α-gust和Trpm5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谙∈蠛粑乐械霓D(zhuǎn)錄均受到抑制，說(shuō)明呼吸道中苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制與哮喘的發(fā)生和演進(jìn)有關(guān)，而黃芩苷干預(yù)組小鼠Tas2rs及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在呼吸道中轉(zhuǎn)錄上調(diào)，表明苦味劑黃芩苷能激活呼吸道苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并對(duì)哮喘的治療和干預(yù)發(fā)揮作用。

哮喘組小鼠肺組織切片中有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡灌洗液中的炎性細(xì)胞總數(shù)顯著升高，其中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)增幅較大；黃芩苷干預(yù)組肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，肺泡灌洗液中的白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著低于OVA組。不同組別的炎性細(xì)胞在組織切片觀察與肺泡灌洗液計(jì)數(shù)中得到的結(jié)果一致，說(shuō)明黃芩苷干預(yù)小鼠哮喘能夠明顯減輕肺部炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。近期研究認(rèn)為，呼吸道炎性細(xì)胞的凋亡異常與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)，并與細(xì)胞凋亡通路的抑制存在一定關(guān)系[2-4]。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡，涉及一系列基因的激活、表達(dá)和調(diào)控。Bcl2和Bax是線(xiàn)粒體凋亡途徑關(guān)鍵決定因素，Bcl2能抑制線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C，使下游胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)無(wú)法激活，抑制細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax的過(guò)度表達(dá)可拮抗Bcl2的保護(hù)效應(yīng)，使細(xì)胞趨于凋亡[24]。Bax/Bcl2比值在調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，Bax和Bcl2表達(dá)的不平衡可能是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要原因[25]。P53可通過(guò)誘導(dǎo)Bax表達(dá)增強(qiáng)，抑制Bcl2轉(zhuǎn)錄激活，提高Bax/Bcl2比值，促進(jìn)線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C釋放，激活下游胱天蛋白酶基因，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24,25]。本文中哮喘鼠呼吸道組織中促凋亡基因P53、Bax和Casp3轉(zhuǎn)錄抑制，凋亡抑制基因Bcl2轉(zhuǎn)錄上調(diào)，凋亡關(guān)鍵蛋白酶胱天蛋白酶3活性下降，顯示哮喘鼠組織中細(xì)胞凋亡通路的抑制，而黃芩苷干預(yù)組小鼠呼吸道中促凋亡基因P53、Bax和Casp3轉(zhuǎn)錄激活，凋亡抑制基因Bcl2表達(dá)抑制，以及胱天蛋白酶3活性的上升，表現(xiàn)為黃芩苷對(duì)線(xiàn)粒體凋亡途徑的活化。相比于前人報(bào)道的哮喘鼠肺組織中Bcl2和Bax的表達(dá)改變[2,3,6]，本文對(duì)細(xì)胞凋亡通路相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果提供了凋亡抑制與哮喘炎癥相關(guān)的新證據(jù)。本文結(jié)果表明，黃芩苷可能通過(guò)激活哮喘小鼠呼吸道中的凋亡通路來(lái)促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡，從而減少哮喘鼠肺部炎癥細(xì)胞，降低炎癥反應(yīng)，緩解哮喘發(fā)作。

綜上所述，哮喘性疾病的發(fā)生與呼吸道炎性細(xì)胞凋亡抑制、苦味受體及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)?？辔缎盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作為機(jī)體生理應(yīng)答的必要組成與機(jī)體健康有直接關(guān)系，黃芩苷干預(yù)能夠激活哮喘小鼠被抑制的苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，下調(diào)凋亡抑制基因的表達(dá)、上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)小鼠呼吸道內(nèi)炎性細(xì)胞的凋亡，減少肺組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而降低哮喘小鼠呼吸道的炎癥反應(yīng)和黏蛋白質(zhì)分泌，減輕呼吸道損傷，緩解哮喘發(fā)作。本結(jié)果為建立以苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為靶標(biāo)的哮喘性疾病治療和干預(yù)的新途徑提供了依據(jù)，也為開(kāi)展中藥苦味成分的靶向治療研究提供了新思路。