乙酰轉(zhuǎn)移酶10通過介導(dǎo)盤狀蛋白結(jié)構(gòu)域受體1 mRNA的ac4C乙?；揎棿龠M(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性行為

張 雪， 湯 華

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系， 天津 300070)

RNA的轉(zhuǎn)錄后修飾對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能具有重要的調(diào)控作用，目前已知的天然RNA修飾類型超過150種[4]。ac4C乙?；揎?N4-acetylcytidine, ac4C)是一種存在于真核及原核生物中保守的化學(xué)修飾，作為一類新發(fā)現(xiàn)的RNA修飾，其機(jī)制和功能受到越來越多的關(guān)注。早期研究認(rèn)為，ac4C主要存在于tRNA和18 S rRNA[5]上，而近期研究顯示，其亦可通過提高靶基因的mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率促進(jìn)其表達(dá)[6]。乙酰轉(zhuǎn)移酶-10(N-acetyltransferase 10, NAT10)被認(rèn)為是RNA ac4C修飾酶，是目前鑒定的一種同時(shí)具有乙?；附Y(jié)構(gòu)域和RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[7]。研究表明，NAT10介導(dǎo)的乙?；揎椗c胃癌[8]、獲得性免疫缺陷綜合征[9]等多種疾病相關(guān)。然而，NAT10是否可以通過其乙?；揎椬饔糜绊憣m頸癌的惡性行為尚不清楚。

盤狀蛋白結(jié)構(gòu)域受體(discoidin domain receptors, DDRs)是一組酪氨酸激酶的亞家族，由DDR1和DDR2組成[10]，DDR1是一種可被多種膠原結(jié)合并被激活的酪氨酸激酶受體，由胞外區(qū)、胞內(nèi)激酶區(qū)和跨膜區(qū)三部分組成。有研究報(bào)道，DDR1在膀胱癌[11]、胃癌[12]和非小細(xì)胞肺癌[13]等多種惡性腫瘤中高度表達(dá)，可調(diào)控遷移、侵襲等多種腫瘤的生物學(xué)功能[11,12]。但是，DDR1在宮頸癌中的生物學(xué)功能及作用仍需進(jìn)一步的研究探索。

本文通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，NAT10在宮頸癌組織及細(xì)胞中呈高表達(dá)，并且NAT10高表達(dá)的宮頸癌病人預(yù)后較差。繼而在宮頸癌細(xì)胞中過表達(dá)和敲低NAT10，檢測NAT10對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性行為的影響。進(jìn)一步研究證明NAT10乙?；揎桪DR1 mRNA, 并提高了其表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌的惡性行為。本研究可能為NAT10介導(dǎo)的mRNA乙酰化修飾在宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的作用中提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞購于美國菌種保藏中心(ATCC)細(xì)胞庫并由實(shí)驗(yàn)室保存。HeLa細(xì)胞使用的完全培養(yǎng)基由6 % 胎牛血清(FBS)、100 μg/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素的RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配置。永生化人宮頸上皮細(xì)胞S12培養(yǎng)液為DMEM、F12培養(yǎng)液(1∶3)混合后的培養(yǎng)液加入5 % FBS、5 μg/mL胰島素、8.4 ng/mL 霍亂毒素、24.3 μg/mL腺嘌呤、0.5 μg/mL氫化可的松和10 ng/mL 表皮生長因子配置而成，S12細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室前期儲(chǔ)存。細(xì)胞均培養(yǎng)于含5 % CO2的37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofection 2000試劑制造商提供的操作指南進(jìn)行。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

NAT10相關(guān)質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，并儲(chǔ)存于實(shí)驗(yàn)室-20 ℃條件下。對(duì)于過表達(dá)DDR1質(zhì)粒的構(gòu)建，以DDR1 cDNA(SRCL03623，天津賽爾生物)為模板，擴(kuò)增得到DDR1 PCR產(chǎn)物，并插入到BamHⅠ 和XhoⅠ 酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)成pcDNA3/3xFlag-DDR1(Flag-DDR1)質(zhì)粒。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)DDR1的編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)的cDNA片段，插入到pSilencer 2.1-U6 neo載體的BamHⅠ 和HindⅢ 酶切位點(diǎn)之間構(gòu)成DDR1敲低質(zhì)粒。設(shè)計(jì)并合成包含DDR1乙?；吧秃屯蛔冃臀稽c(diǎn)的互補(bǔ)DNA片段，其分別插入到pcDNA3/EGFP載體的BamHⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)之間，構(gòu)成pcDNA3-DDR1-EGFP-ac4C-wt和pcDNA3-DDR1-EGFP-ac4C-mut EGFP報(bào)告系統(tǒng)質(zhì)粒。引物序列見Table 1。

Table 1 Sequences of each primer

1.3 Western免疫印跡分析

將細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收取蛋白質(zhì)樣品。棄去舊培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(1×PBS)清洗1～2次，加入蛋白質(zhì)裂解緩沖液，獲得蛋白質(zhì)樣品后用于SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，再用合適比例的抗體4 ℃條件下孵育過夜：NAT10(SRP07792, 1∶300)；DDR1(SRP10937, 1∶100)；E-鈣黏著蛋白(SRP05266, 1∶500)；波形蛋白(SRP01327, 1∶1 000)；HA-tag(SRPM00080, 1∶200)；EGFP(SRP12235, 1∶4 000)；GAPDH(SRP00849, 1∶3 000)均購于天津賽爾生物公司，F(xiàn)lag(1∶4 000)購于美國Sigma公司。1×TBST清洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中室溫孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光液后在暗室曝光成像。使用Image J分析數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.4 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用Trizon試劑提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA，使用HiScript?Ⅱ Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)將細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)制造商提供的操作說明書，使用2x Universal SYBR Green Fast qPCR Mix試劑盒(ABclonal, America)進(jìn)行qPCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔt算法處理，使用β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。引物序列見Table 2。

Table 2 Sequences of each primer

1.5 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后提取細(xì)胞的總RNA。根據(jù)試劑盒的操作說明書，使用Magna RIPTMRNA-Binding Protein Immunoprecipitation試劑盒(Millipore; America)處理細(xì)胞。結(jié)合RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測富集于Flag抗體或ac4C乙?；贵w和抗鼠IgG抗體包被的磁珠的DDR1 mRNA的水平。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔt算法處理，使用β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。引物序列見Table 3。

迎旭凌絕嶝，映泫歸溆浦。鉆燧斷山木，掩岸墐石戶。結(jié)架非丹甍，藉田資宿莽。同游息心客，曖然若可睹。清霄揚(yáng)浮煙，空林響法鼓。忘懷狎鷗鰷，攝生馴兕虎。望嶺眷靈鷲，延心念凈土。若乘四等觀，永拔三界苦。[13](卷三《登石室飯僧詩》，P1164)

Table 3 Sequences of each primer

1.6 RNA半衰期檢測

將細(xì)胞接種在6孔板中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞32 h 后分別加入終濃度為5 μg/mL 的轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D(actinomycin-D, Act-D)，處理細(xì)胞不同時(shí)間(0 h、1 h、2 h、4 h)后收集樣品RNA。再提取上述細(xì)胞的總RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測DDR1 mRNA水平。

1.7 MTT實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞接種在24孔板中，轉(zhuǎn)染24 h后消化細(xì)胞并用1 mL無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。按照每孔6 000個(gè)/孔的HeLa 細(xì)胞(100 μL)接種在96孔板中，每一組設(shè)置5個(gè)副孔。分別在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時(shí)加入10 μL 的噻唑藍(lán)(5 mg/mL)并培養(yǎng)6 h。棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 二甲基亞砜，隨后避光震蕩混勻5 min，立即使用酶標(biāo)儀檢測570 nm處的吸光度。

1.8 集落形成檢測

按照每孔1 000個(gè)HeLa細(xì)胞的比例，將細(xì)胞接種在含有2 mL完全培養(yǎng)液的12孔板中，37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)10～12 d棄去培養(yǎng)液，1×PBS清洗細(xì)胞，結(jié)晶紫染色5 min，用流水緩慢清洗干凈結(jié)晶紫后晾干，拍照計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染的細(xì)胞消化后每孔使用1 mL無血清培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)，隨后按照每孔6×104個(gè)細(xì)胞(200 μL/孔HeLa細(xì)胞)接種在含有或不含Matrigel凝膠的Transwell小室上層內(nèi)，well下層每孔加入700 μL 含30%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48或72 h。使用固定液(甲醇：冰乙酸=3∶1)室溫固定30 min，1×PBS清洗4次，結(jié)晶紫染色5 min，流水沖洗干凈后晾干。用樹膠封片后在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照。使用Image J定量分析細(xì)胞遷移或侵襲數(shù)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 6.0分析軟件處理數(shù)據(jù)，組間數(shù)據(jù)比較采用Student′st檢驗(yàn)分析。所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。P<0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乙酰轉(zhuǎn)移酶10促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長和增殖活性

通過GEO數(shù)據(jù)庫(GSE9750)分析NAT10在宮頸癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常宮頸組織相比NAT10在宮頸癌組織中呈高表達(dá)(P<0.05)(Fig.1A)。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫及Kaplan-Meier Plotter生存曲線分析(https://kmplot.com/analysis/)發(fā)現(xiàn)，NAT10高表達(dá)的宮頸癌病人的總生存率與NAT10低表達(dá)病人相比較低(P<0.05)(Fig.1B, C)。RT-qPCR的結(jié)果顯示，NAT10在宮頸癌細(xì)胞HeLa中的表達(dá)相對(duì)于永生化人宮頸上皮細(xì)胞S12中的表達(dá)增加至(147.6% ± 12.4%)(Fig.1D)。為了探究NAT10在宮頸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，本文通過Western免疫印跡及RT-qPCR驗(yàn)證NAT10過表達(dá)及敲低質(zhì)粒的有效性，在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NAT10過表達(dá)質(zhì)粒(Flag-NAT10)使NAT10的表達(dá)水平升高約1.66倍，轉(zhuǎn)染NAT10敲低質(zhì)粒(shR-NAT10)使NAT10的表達(dá)水平下降至0.50倍(Fig.1E, F)。

為了研究NAT10對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長與增殖的影響，本文通過MTT實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測NAT10對(duì)HeLa細(xì)胞的生長增殖能力的影響。MTT的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Flag-NAT10使HeLa細(xì)胞的生長活性增加至(164.0% ± 11.8%)，敲低NAT10則使宮頸癌細(xì)胞的生長活性降低到(59.5% ± 6.5%)(Fig.1 G)。過表達(dá)NAT10增加了細(xì)胞的增殖能力約(161.0% ± 6.1%)，敲低NAT10導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降至(52.3% ± 10.0%)(Fig.1 H)。這些結(jié)果表明，NAT10在宮頸癌中高表達(dá)，并且促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長活性和增殖能力。

Fig.1 NAT10 enhances cervical cancer cell growth (A) The expression of NAT10 in cervical cancer and non-tumor cervical tissues from GSE9750 database containing 33 cervical cancer tissue samples and 24 normal cervical epithelial tissue samples. (B) TCGA database showed the overall survival of CC patients according to the level of NAT10. (C) Kaplan-Meier Plotter survival curve analysis showed the overall survival of CC patients. (D) RT-qPCR indicated the expression of NAT10 between HeLa cells with normal cervical cells S12. (E, F) Western blotting analysis and RT-qPCR indicated the level of NAT10 with NAT10 overexpression or knockdown in HeLa cells. (G) MTT assays showed the viability of HeLa cells after transfected with NAT10 overexpression or knockdown in HeLa cells. (H) Colony formation assays were used to detected the cell growth capacity of HeLa cells in the transfection of NAT10 overexpression or knockdown. Data were presented as means ± SD (n=3). ***P <0.001 vs. control. **P <0.01 vs. control. *P <0.05 vs. control. ns, no significance

2.2 乙酰轉(zhuǎn)移酶10促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲

為了探究NAT10對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)NAT10使HeLa細(xì)胞的遷移能力增加約2.5倍，敲低NAT10，HeLa細(xì)胞的遷移能力降低至(48.3% ± 5.9%)(Fig.2A)；過表達(dá)NAT10使細(xì)胞侵襲能力增加(165.7% ± 15.5%),侵襲能力降低(45.6% ± 13.8%)(Fig.2B)。越來越多的證據(jù)[14,15]表明，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)參與了多種腫瘤的癌變和轉(zhuǎn)移。因此，本文通過Western免疫印跡檢測了NAT10對(duì)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏著蛋白和間皮細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)NAT10使波形蛋白的表達(dá)水平升高約1.58倍；敲低NAT10，波形蛋白的表達(dá)下降至0.61倍(Fig.2C)，過表達(dá)NAT10使E-鈣黏著蛋白的表達(dá)水平降低至0.36倍；NAT10下調(diào)則使E-鈣黏著蛋白的表達(dá)水平升高1.76倍(Fig.2D)。這些結(jié)果均表明，NAT10過表達(dá)可以增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

Fig.2 NAT10 promotes the migration, invasion and EMT of cervical cancer cells (A) The Transwell migration assay were performed to detected the migration ability of HeLa cells with overexpression or knockdown of NAT10. (B) The Transwell invasion assay was used to detect the invasion capacity of HeLa cells after overexpression or knockdown of NAT10. (C, D) Western blotting assay revealed the protein level of the molecular marker of EMT (C: Vimentin and D: E-cadherin) in HeLa cells with overexpression or knockdown of NAT10. Data were presented as means ± SD (n=3). **P <0.01 vs. control. *P <0.05 vs. control

2.3 乙酰轉(zhuǎn)移酶10促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞中盤狀蛋白結(jié)構(gòu)域受體1的表達(dá)水平

為了探究NAT10調(diào)控宮頸癌細(xì)胞惡性行為的具體機(jī)制，本文借助Venny 2.1.0工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) 將TCGA數(shù)據(jù)庫、GEO數(shù)據(jù)庫(GSE7410)以及RNA-seq的結(jié)果[6]取交集，Venny圖顯示共有38個(gè)交集靶基因(Fig.3A)。隨后，對(duì)這38個(gè)基因進(jìn)行GO富集分析(Fig.3B)，結(jié)果顯示，與腫瘤細(xì)胞惡性行為相關(guān)的細(xì)胞功能主要有細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞黏附及增殖調(diào)控，本文發(fā)現(xiàn)，DDR1涉及以上3種生物學(xué)功能，因此，選擇DDR1作為接下來的研究對(duì)象。GEPIA2數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)[16]顯示，DDR1在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(Fig.3C)。接下來的RIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示過表達(dá)NAT10，富集的DDR1 mRNA的水平相比對(duì)照而言上升約4倍(Fig.3D)。Western免疫印跡結(jié)果顯示，過表達(dá)NAT10后導(dǎo)致DDR1的蛋白質(zhì)水平增加到約2倍，敲低NAT10則使DDR1的蛋白質(zhì)水平降低至0.43倍(Fig.3E)。并且，RT-qPCR的結(jié)果顯示敲低NAT10，使DDR1 的mRNA水平降低至(68.5% ± 4.9%)；過表達(dá)NAT10則使DDR1的mRNA水平上升至(150% ± 9.8%)(Fig.3F)。這些結(jié)果表明，NAT10促進(jìn)了HeLa細(xì)胞中DDR1的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平。

Fig.3 NAT10 upregulates DDR1 expression in HeLa cells (A) The Venny 2.1.0 was used to show a 3-set Venn diagram presented the intersection from the TCGA database, GSE7410 and RNA-seq. (B) Gene Ontology enrichment on the subset of 38 genes from (A). (C) GEPIA2 database showed the expression of DDR1 in cervical cancer and non-tumor cervical tissues. (D) RIP and RT-qPCR assays detected the level of DDR1 mRNA after HeLa cells transfected with or without NAT10 overexpression. (E) Western blotting revealed the protein expression of DDR1 in HeLa cells after transfection of NAT10 overexpression or knockdown. (F) RT-qPCR detected the mRNA level of DDR1 in HeLa cells with NAT10 overexpression or knockdown. Data were presented as means ± SD (n=3). *P <0.05 vs. control

2.4 乙酰轉(zhuǎn)移酶10通過乙?；揎椪{(diào)控宮頸癌細(xì)胞中盤狀蛋白結(jié)構(gòu)域受體1的表達(dá)水平

為了明確NAT10對(duì)DDR1的這種調(diào)控作用是否依賴于其介導(dǎo)的乙?；揎棧疚倪M(jìn)行了RNA乙?；庖叱恋砗蚏T-qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)NAT10之后，乙?；?ac4C)抗體富集的DDR1 mRNA的水平相比于對(duì)照組而言升高約4倍；NAT10敲低之后使DDR1 mRNA的乙?；较陆导s9倍(Fig.4A)。本文在乙?；A(yù)測網(wǎng)站PACES(http://www.rnanut.net/paces/)[17]預(yù)測了DDR1可能的乙?；稽c(diǎn)(Fig.4B)。結(jié)果顯示，DDR1潛在的乙?；稽c(diǎn)位于CDS區(qū)，這與之前的研究結(jié)果[6]是一致的，同時(shí)利用EGFP報(bào)告系統(tǒng)構(gòu)建該位點(diǎn)的野生型及突變型質(zhì)粒(Fig.4B)。為了確定該潛在位點(diǎn)是否是NAT10修飾DDR1的真正乙?；稽c(diǎn)，本文在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)NAT10，并與DDR1野生型位點(diǎn)及其突變位點(diǎn)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)，EGFP報(bào)告系統(tǒng)熒光強(qiáng)度(Fig.4C)及Western免疫印跡(Fig.4D)結(jié)果顯示，相比于空白組而言，過表達(dá)NAT10使DDR1-EGFP-ac4C-wt位點(diǎn)的EGFP表達(dá)增加了約1.6倍，對(duì)DDR1-EGFP-ac4C-mut的表達(dá)水平無明顯影響。有文獻(xiàn)報(bào)道，ac4C乙?；揎椏梢栽黾觤RNA的穩(wěn)定性并上調(diào)靶基因的表達(dá)[6]，因此，本文檢測了NAT10對(duì)DDR1 mRNA半衰期的影響。使用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理HeLa細(xì)胞不同的時(shí)間，RNA半衰期結(jié)果表明，敲低NAT10降低了DDR1 mRNA的穩(wěn)定性(P<0.05)(Fig.4E)。綜上所述，NAT10可能通過對(duì)DDR1的乙酰化修飾延長其mRNA穩(wěn)定性，從而促進(jìn)DDR1在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)。

Fig.4 NAT10 promotes the expression of DDR1 in cervical cancer cells via acetylating its mRNA (A) After transfection of empty vectors or NAT10 overexpression or knockdown plasmids in HeLa cells, RNA immunoprecipitation and RT-qPCR experiments were used to detect the binding strength between the NAT10 protein and DDR1 mRNA. (B) The acetylation site prediction website PACES predicted the potential acetylation sites on DDR1 mRNA, and the map of wild-type and mutant plasmids of EGFP reporter systems at DDR1 potential acetylation site was showed. (C, D) HeLa cells were transfected with pcDNA3-EGFP, DDR1-EGFP-ac4C-wt, DDR1-EGFP-ac4C-mut and NAT10 with or without overexpression for 48 hours. The EGFP fluorescence intensity was detected by fluorescence microscope, and then prepared the protein sample to detected the protein level of EGFP in HeLa cells by Western blotting analysis. (E) RT-qPCR was used to measure the DDR1 mRNA stability of HeLa cells transfected with NAT10 knockdown after actinomycin D (5 μg/mL) treatment at the indicated periods (0, 1, 2, 4 hours). Data were presented as means ± SD (n=3). *P <0.05 vs. control. ns, no significance

2.5 盤狀蛋白結(jié)構(gòu)域受體1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性行為及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程

大量研究[11, 18]表明，DDR1參與腫瘤細(xì)胞黏附、遷移與侵襲、增殖與凋亡等過程。本文通過構(gòu)建DDR1過表達(dá)及敲低質(zhì)粒，并通過Western免疫印跡和RT-qPCR檢測DDR1的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比DDR1的表達(dá)增加了約2倍，敲低DDR1使DDR1的表達(dá)下降約0.5倍(Fig.5A)。MTT實(shí)驗(yàn)(Fig.5B)及集落形成實(shí)驗(yàn)(Fig.5C)結(jié)果表明，過表達(dá)DDR1使HeLa細(xì)胞的生長活性增加(149.5% ± 1.1%)，增殖能力增加(148% ± 4.4%)，敲低DDR1則導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞的生長活性和增殖能力分別降低(73.4% ± 3.9%)和(66% ± 3.8%)。為了評(píng)估DDR1在調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用，本文進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)DDR1使宮頸癌細(xì)胞的遷移能力增加(173% ± 12%)(Fig.5D)，使侵襲能力增加(166% ± 8.1%)(Fig.5E)，敲低DDR1則導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞的遷移能力降低(43.6% ± 19%)(Fig.5D)以及侵襲能力降低(44.3% ± 6.5%)(Fig.5E)。同樣，通過Western免疫印跡檢測DDR1對(duì)EMT標(biāo)志物E-鈣黏著蛋白和波形蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)DDR1使波形蛋白的表達(dá)水平增加了1.48倍(Fig.5F)，使E-鈣黏著蛋白的表達(dá)水平降低0.27倍(Fig.5G)；敲低DDR1則導(dǎo)致波形蛋白的表達(dá)降低至0.42倍(Fig.5F)，導(dǎo)致E-鈣黏著蛋白的表達(dá)水平增加至1.64倍(Fig.5G)。這表明DDR1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性行為。

Fig.5 DDR1 promotes the malignant behavior and EMT process of cervical cancer cells (A) Western blotting assays and RT-qPCR assays showed the level of DDR1 in HeLa transfected with DDR1 overexpressed or knockdown. (B) MTT assays showed the cell viability of HeLa cells with DDR1 overexpression or knockdown. (C) Colony formation assay was used to detect the cells growth capacity of HeLa cells in the transfection of DDR1 overexpression or knockdown. (D, E) Transwell assay was used to perform the migration (D) and invasion (E) ability of HeLa cells after DDR1 overexpressed or knockdown. (F, G) Western blotting revealed the expression of molecular marker of EMT (F: Vimentin and G: E-cadherin). Data were showed as means ± SD (n=3). **P <0.01 vs. control. *P <0.05 vs. control. ns, no significance

3 討論

宮頸癌是一種由多因素、多步驟導(dǎo)致的惡性疾病，涉及轉(zhuǎn)錄基因改變、遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)等多個(gè)復(fù)雜過程的相互作用。越來越多的證據(jù)表明，表觀遺傳修飾與宮頸癌的生物學(xué)發(fā)生密切相關(guān)[19]，例如m6A甲基化修飾[20]、組蛋白修飾[21]和DNA甲基化[22]等。正如m6A甲基化修飾的調(diào)控[23]，ac4C乙?；揎検窃赗NA乙?；D(zhuǎn)移酶的作用下，胞嘧啶的N4位發(fā)生乙?；囊环N保守化學(xué)修飾。NAT10是一種賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，是Gcn5相關(guān)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Gcn5-related N-acetyltransferase, GNAT)家族中的一員[24]。近幾年發(fā)現(xiàn)，NAT10是目前發(fā)現(xiàn)的一個(gè)mRNA乙酰化修飾“writer”，其介導(dǎo)的乙?；揎椧驯蛔C實(shí)參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。在本研究中，最先揭示了NAT10在宮頸癌組織中顯著上調(diào)，并且NAT10高表達(dá)與宮頸癌病人的預(yù)后不良相關(guān)。本文的研究發(fā)現(xiàn)，NAT10對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力具有促進(jìn)作用。此外，本文的結(jié)果證明NAT10對(duì)宮頸癌細(xì)胞的遷移侵襲能力的影響可能與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。這些結(jié)果證實(shí)，NAT10在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著“促癌基因”的角色，影響宮頸癌癌細(xì)胞的多種生物學(xué)行為。

NAT10已被報(bào)道在多種疾病中發(fā)揮著重要作用。既往的研究表明，NAT10與 Hutchinson-Gilford早衰癥[25,26]有關(guān)，抑制NAT10的表達(dá)水平可以恢復(fù)非經(jīng)典核輸入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1 (Transportin-1, TNPO1) 的核質(zhì)比，從而改善早衰癥病人的癥狀。NAT10通過介導(dǎo)P53[27]以及DNA損傷反應(yīng)蛋白CW型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白2(microrchidia family CW-type zinc finger 2, MORC2)[28]的組蛋白乙?；揎梾⑴cDNA損傷修復(fù)進(jìn)程。最近，有文獻(xiàn)報(bào)道NAT10可以催化mRNA發(fā)生乙?；揎棧⑴c多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。例如，NAT10在胃癌中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，通過乙?；揎棦跣湍z原蛋白α1(collagen type Ⅴ alpha 1, COL5A1)導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)，顯著促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及EMT進(jìn)程[8]；ac4C乙?；降纳仙泊龠M(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，NAT10可能成為治療骨質(zhì)疏松的分子靶點(diǎn)[29]。這些研究表明，NAT10的異常表達(dá)在疾病中發(fā)揮著重要的作用。我們的研究證明，NAT10通過介導(dǎo)DDR1 mRNA的乙?；揎棿龠M(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性行為。

盤狀蛋白結(jié)構(gòu)域受體被報(bào)道可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與其周圍膠原基質(zhì)的相互作用從而在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮作用[30]。最近的研究表明，DDR1的表達(dá)水平在許多腫瘤細(xì)胞中升高，作為“傳感器”在細(xì)胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要的作用[31]。此外，DDR1可以與膠原蛋白結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)激酶，進(jìn)而促進(jìn)下游通路的激活，調(diào)控腫瘤的多種生物學(xué)功能。DDR1與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的正反饋激活促進(jìn)肝癌的EMT進(jìn)程及谷氨酰胺的代謝[32]。本文發(fā)現(xiàn)，DDR1在宮頸癌組織中顯著上調(diào)，DDR1的過表達(dá)可以顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。NAT10可以通過對(duì)DDR1的位點(diǎn)進(jìn)行乙酰化修飾促進(jìn)其表達(dá)，從而可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性行為及EMT進(jìn)程。

綜上所述，我們的研究結(jié)果證明，NAT10可以對(duì)DDR1進(jìn)行乙?；揎?，并延長mRNA穩(wěn)定性進(jìn)而促進(jìn)其表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。但是，由于調(diào)控mRNA乙酰化修飾的其他蛋白質(zhì)仍未知，可能存在其他的蛋白質(zhì)參與該調(diào)控過程，這仍需要進(jìn)一步研究進(jìn)行探索。綜上所述，我們的研究可能為由NAT10介導(dǎo)的乙酰化修飾在調(diào)控宮頸癌的生物學(xué)功能方面提供了新的分子機(jī)制。