小分子藥物BNTA通過上調(diào)Insig1緩解高膽固醇引起的骨關(guān)節(jié)炎

王俊雁， 曹宸喜， 胡曉青， 程 錦， 敖英芳

(北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，北京大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)傷病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100191)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，主要特征為關(guān)節(jié)軟骨漸進(jìn)性的降解和破壞。其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且已成為全球第3大致殘?jiān)颍o社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1,2]。

骨關(guān)節(jié)炎最重要的病理變化即為關(guān)節(jié)軟骨的退變，其本質(zhì)是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)分解代謝和合成代謝的失衡，造成分解代謝強(qiáng)于合成代謝，導(dǎo)致軟骨組織出現(xiàn)降解[3]。當(dāng)軟骨細(xì)胞的合成代謝和分解代謝保持動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，細(xì)胞的分泌活動(dòng)正常，因而ECM的主要成分—即II型膠原纖維(type II collagen, col2)和蛋白質(zhì)多糖(aggrecan, ACAN)的含量正常。當(dāng)軟骨細(xì)胞的合成代謝降低，或者分解代謝活動(dòng)增強(qiáng)時(shí)，軟骨組織ECM出現(xiàn)漸進(jìn)性降解和破壞，進(jìn)而導(dǎo)致OA的發(fā)生和進(jìn)展。

骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的危險(xiǎn)因素眾多。以往研究認(rèn)為，OA軟骨退變與衰老、創(chuàng)傷及生物力學(xué)異常有關(guān)。膽固醇(cholesterol)是維持人體正常生理過程的重要脂類，正常血總膽固醇含量為140～200 mg/dl，當(dāng)血液中膽固醇含量增高時(shí)會(huì)引起高膽固醇血癥，其與動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松等疾病密切相關(guān)。而近期有研究認(rèn)為，膽固醇代謝異常同樣與OA軟骨退變存在相關(guān)性，且可能為OA發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4,5]。軟骨細(xì)胞內(nèi)的高膽固醇堆積會(huì)導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species, ROS)增高，激活異常氧化應(yīng)激，損害線粒體功能，進(jìn)而破壞軟骨細(xì)胞ECM合成代謝與分解代謝的平衡，加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[6-8]。

在既往研究中，我們發(fā)現(xiàn)一種新的改善骨關(guān)節(jié)炎病情的化合物(disease-modifying OA drugs, DMOADs)— N-[2-bromo-4-(phenylsulfonyl)-3-thienyl]-2-chlorobenzamide(BNTA)，其在創(chuàng)傷誘導(dǎo)的大鼠OA模型中能有效改善中關(guān)節(jié)軟骨組織ECM的含量，改善大鼠關(guān)節(jié)的疼痛癥狀及軟骨下骨的硬化程度，延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[9]。研究證實(shí)，BNTA可有效清除細(xì)胞內(nèi)過量的ROS，改善異常氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞的合成代謝，抑制分解代謝和炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療OA的效果。但對于BNTA能否改善高膽固醇誘發(fā)的OA，我們?nèi)孕柽M(jìn)一步研究。本研究旨在探討小分子藥物BNTA是否能改善膽固醇代謝，緩解高膽固醇引起的骨關(guān)節(jié)炎。

1 材料與方法

1.1 BNTA來源、性質(zhì)及使用方法

本研究中所使用的BNTA由上海陶素生化公司合成。BNTA化學(xué)式為N-[2-bromo-4-(phenylsulfonyl)-3-thienyl]-2-chlorobenzamide。配制方法：使用DMSO溶解化合物，用生理鹽水或完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)基中加入溶解的BNTA，配制成所需濃度，在更換培養(yǎng)基時(shí)加入；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用生理鹽水稀釋至所需濃度，采用膝關(guān)節(jié)腔局部注射方式給藥。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)療程為4周，用以觀察BNTA對高膽固醇引起的OA的短期療效，給藥濃度為0.15 mg/kg，每周2次，給藥劑量及頻次參考先前的研究[9]。

1.2 動(dòng)物模型

本研究所使用的SD大鼠購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部。選取6周雄性SD大鼠，給予高膽固醇飲食喂養(yǎng)10周，構(gòu)建高膽固醇飲食大鼠OA模型[10,11]。正常飲食組(Control Diet, CD)大鼠飼喂AIN-93 G飼料，高膽固醇飲食組(High-Cholesterol Diet, HCD)飼喂AIN-93 G+2%膽固醇飼料。本研究中的大鼠分為4組，每組6只。第1組為正常飲食組(CD組)；第2組為高膽固醇飲食組，飼喂10周后無特殊處理(NC組)；第3組為高膽固醇飲食組，飼喂10周后關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射與BNTA組等量的生理鹽水(Vehicle組)；第4組為高膽固醇飲食組，飼喂10周后關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.15 mg/kg BNTA治療(BNTA組)，每周2次，共4周。

1.3 原代軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)

大鼠原代軟骨細(xì)胞取自體重150 g左右的雄性SD大鼠，將大鼠斷頸處死，分離其股骨頭及股骨髁表面軟骨，剪碎后使用0.2%二型膠原酶在37 ℃培養(yǎng)箱中消化4 h，離心后棄上清，使用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸，鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

為研究BNTA對高膽固醇引起的骨關(guān)節(jié)炎的治療作用，本研究采用不同濃度膽固醇刺激大鼠軟骨細(xì)胞3 d。第2 d時(shí)，在治療組細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入BNTA治療24 h，處理完成后，固定細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

使用TRIzol試劑分離并提取大鼠軟骨細(xì)胞總RNA，每6 cm培養(yǎng)皿加入1 mL TRIzol試劑。依次加入三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇純化RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，對純化的RNA (1 μg)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA制備成15 μl體系，充分混合，加入96孔板中，離心后放入PCR儀，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。使用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RT-qPCR)系統(tǒng)(Applied Biosystems)檢測軟骨細(xì)胞中各基因mRNA相對表達(dá)量。擴(kuò)增條件為95℃ 2 min，(95℃ 15 s，60℃ 30 s)共40個(gè)循環(huán)，并繪制溶解曲線?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量以倍數(shù)變化率表示，用2-ΔΔCT公式計(jì)算，以Rn18 s作內(nèi)參。本研究中涉及大鼠的引物序列見Table 1。

Table 1 Primer sequences for rat genes

1.5 甲苯胺藍(lán)染色

配制甲苯胺藍(lán)染液，過濾去除沉淀。使用10%中性甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS沖洗3次后加入甲苯胺藍(lán)染液，染色5 min，充分洗去染液，滴加少量蒸餾水在顯微鏡下觀察。

1.6 油紅O染色

使用10%中性甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS沖洗3次加入60%異丙醇浸洗5 min，棄去異丙醇后加入新配制的油紅O染液浸染20 min，充分洗去油紅O染液，用蘇木素染液復(fù)染核2 min，洗凈后加少量蒸餾水在顯微鏡下觀察。甲苯胺藍(lán)染色及油紅O染色使用Image J軟件對染色強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算方法為染色面積/細(xì)胞總面積(%area)。每個(gè)樣品至少采圖6個(gè)視野。

1.7 免疫組化染色

石蠟切片使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各15 min，依次浸入100%、95%、85%、70%、50%酒精各5 min，PBS洗滌后浸入3% H2O2中避光浸泡15 min，PBS洗滌后使用4%胃蛋白酶修復(fù)抗原1 h，PBS洗滌并使用PBST打孔15 min，使用5%BSA封閉1 h，1∶100稀釋一抗，4 ℃孵育過夜。PBS洗滌并加入1∶200稀釋的二抗，孵育2 h，PBS洗滌并使用DAB顯色2 ～ 10 min，ddH2O終止反應(yīng)。使用梯度酒精脫水，二甲苯透明10 min，中性樹脂封片。

1.8 Western 印跡分析

配膠：配制分離膠和濃縮膠。上樣：將20 μg對應(yīng)體積蛋白質(zhì)樣品和10 μL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量(marker) 按照要求依次加入上樣孔。依次進(jìn)行電轉(zhuǎn)、電泳和封閉。孵一抗：用5%脫脂奶粉稀釋一抗，置于搖床中4 ℃孵育過夜。洗膜：用TBST在搖床上室溫(21 ℃)洗膜3次，每次10 min。孵二抗：選用與一抗對應(yīng)辣根酶標(biāo)記二抗，加入PVDF膜中，置于搖床中室溫(21 ℃)孵育1 h。二次洗膜：用TBST在搖床上室溫(21 ℃)洗膜3次，每次10 min。化學(xué)發(fā)光：ECL顯色液反光底物A液和B液等體積混合，滴加于PVDF膜上孵育30 s。隨后用BIO-RAD ChemiDoc XRS+ system凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光成像。

1.9 OARSI評(píng)分

本研究采用國際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(huì)軟骨退變評(píng)分系統(tǒng)(Osteoarthritis Research Society International score，OARSI)來評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)軟骨的退變程度[12]。OARSI等級(jí)(grade)分為6級(jí)，評(píng)分越高，軟骨退變越嚴(yán)重。0級(jí)：正常，軟骨表面和軟骨細(xì)胞均正常；1級(jí)：關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)少量纖維化，不平坦，但未見軟骨損失，未累及但中層和深層軟骨；2級(jí)：關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)裂隙和軟骨損失，中層軟骨受累，出現(xiàn)纖維化、軟骨細(xì)胞增殖和死亡、軟骨基質(zhì)染色異常等；3級(jí)：裂隙累及深層軟骨，軟骨細(xì)胞死亡和增殖主要沿裂隙分布；4級(jí)：裂隙周圍的基質(zhì)丟失，關(guān)節(jié)軟骨侵蝕；5級(jí)：關(guān)節(jié)軟骨剝蝕，未礦化的透明軟骨全層侵蝕，礦化的軟骨和軟骨下骨裸露于關(guān)節(jié)表面；6級(jí)：關(guān)節(jié)變形，關(guān)節(jié)面纖維軟骨化、骨贅形成等。

本研究中OARSI評(píng)分由2名具有臨床工作經(jīng)驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科醫(yī)生對照評(píng)分細(xì)則在光學(xué)顯微鏡(X100)下獨(dú)立完成，取評(píng)分均值作為最終得分，未告知樣本分組。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS(版本20.0，IBM Corp)進(jìn)行。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。每個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)點(diǎn)代表獨(dú)立的生物學(xué)樣本。本研究采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗(yàn)，Levene檢驗(yàn)用于數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn)。兩組數(shù)據(jù)之間的差異采用two-tailed Student’st-tests，三組及以上數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA，兩種影響因素水平的組間比較采用2×2析因方差分析。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義差異。結(jié)果中表示為：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2 結(jié)果

2.1 BNTA可緩解高膽固醇大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的病理表現(xiàn)

為探究BNTA對高膽固醇引起的骨關(guān)節(jié)炎的作用，通過飼喂高膽固醇飲食構(gòu)建了大鼠OA模型，并通過關(guān)節(jié)腔局部注射的方式給予BNTA治療。大鼠膝關(guān)節(jié)石蠟切片番紅O染色顯示，高膽固醇飲食大鼠較正常飲食大鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的OA表型。表現(xiàn)為關(guān)節(jié)表面不光滑、番紅O染色及二型膠原纖維(type II collagen, col2)免疫組化染色強(qiáng)度降低，Mmp13(matrix metalloproteinases 13)免疫組化染色強(qiáng)度增高，說明關(guān)節(jié)軟骨ECM蛋白多糖含量減少，而BNTA治療能顯著增加蛋白質(zhì)多糖和二型膠原含量，有效改善上述膝關(guān)節(jié)軟骨組織的退行性病變，緩解OA進(jìn)展(Fig.1A)。采用OARSI評(píng)分對大鼠膝關(guān)節(jié)OA的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果顯示，高膽固醇飲食組大鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)(medial tibial plateau，MTP)和內(nèi)側(cè)股骨髁(medial femoral condyle，MFC)的OARSI評(píng)分均高于正常飲食組大鼠，BNTA治療組評(píng)分有所改善，表明BNTA治療組的膝關(guān)節(jié)軟骨組織退行性病變較輕(Fig.1B)。對Col2和Mmp13免疫組化進(jìn)行評(píng)分同樣顯示該趨勢(Fig.1C)。結(jié)果提示，BNTA能緩解大鼠高膽固醇引起的OA的進(jìn)展。

Fig.1 BNTA alleviates the pathological manifestations of OA in the OA model of high cholesterol rats (A) Safranin O staining of paraffin sections of rat knee tissue, scale bar = 500 or 100 μm, and immunohistochemical staining of Col2 and Mmp13, scale bar = 50 μm. Six-week-old Sprague-Dawley rats were fed with high-cholesterol diets for 10 weeks, and then treated with local injection of BNTA in the joint cavity twice a week for 4 weeks. CD, control diet, HCD, high fat diet; NC, no special treatment, Vehicle, injection of the same amount of normal saline as BNTA treatment group, BNTA, injection of 0.15 mg/kg BNTA treatment. (B) The OARSI score of knee joints in rats. (C) Positive cell statistics of Col2 and Mmp13. (n=6). ns, no statistical difference; *, P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001; ****, P<0.0001

2.2 BNTA可緩解高膽固醇刺激引起的骨關(guān)節(jié)炎表型，減少大鼠軟骨細(xì)胞脂質(zhì)積聚

隨后評(píng)估了大鼠軟骨細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)量，包括合成代謝相關(guān)基因：col2、sox9(Sry-box transcription factor 9)、acan(aggrecan)和分解代謝相關(guān)基因：mmp13、adamts5(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 5)。結(jié)果顯示，高膽固醇刺激可下調(diào)軟骨細(xì)胞ECM合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)，上調(diào)ECM分解代謝相關(guān)基因的表達(dá)。BNTA治療能逆轉(zhuǎn)大鼠軟骨細(xì)胞中高膽固醇刺激引起的OA表型，說明BNTA可以改善軟骨細(xì)胞代謝過程，緩解大鼠軟骨細(xì)胞中的OA進(jìn)展(Fig.2A)。免疫熒光結(jié)果也反映了上述趨勢在蛋白質(zhì)水平的變化(Fig.2B)。

Fig.2 BNTA ameliorates the OA phenotype of rat chondrocytes induced by high cholesterol (A) The expression of col2, acan, sox9, mmp13, adamts5 genes in rat chondrocytes was detected by RT-qPCR. (B) Immunofluorescence staining of col2, sox9 and mmp13, scale bar = 75 μm. The high cholesterol group (chl) was treated with 50 μg/mL cholesterol for 72 hours, and the BNTA treatment group (chl +BNTA) was treated with 50 μg/mL cholesterol for 72 hours. BNTA was added at a 0.1 μmol/L concentration for 24 hours, and the control group (con) was added with the same amount of saline. Ns, no statistical difference; ***, P <0.001; ****, P <0.0001

為探究BNTA對大鼠軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用和對大鼠軟骨細(xì)胞脂質(zhì)積聚情況的影響，我們在原代培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中添加50 μg/ml濃度高膽固醇刺激，隨后采用0.1 μmol/L BNTA治療。治療完成后，固定細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)和油紅O染色。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，膽固醇處理后，軟骨細(xì)胞減少，染色強(qiáng)度下降，說明軟骨細(xì)胞ECM出現(xiàn)降解和蛋白質(zhì)多糖丟失。相較于單純膽固醇處理組，BNTA治療組中膽固醇引起的細(xì)胞數(shù)量減少程度和甲苯胺藍(lán)染色強(qiáng)度下降程度均減輕，提示BNTA治療能改善大鼠軟骨細(xì)胞中膽固醇引起的ECM降解和細(xì)胞死亡，延緩OA進(jìn)展；油紅O染色顯示，高膽固醇刺激后軟骨細(xì)胞內(nèi)脂滴顯著增加，BNTA治療后脂滴含量明顯減少，提示BNTA治療能緩解高膽固醇刺激引起的細(xì)胞內(nèi)異常脂質(zhì)積聚(Fig.3)。

Fig.3 BNTA ameliorates increased lipid accumulation in rat chondrocytes induced by high cholesterol stimulation Toluidine blue stain and Oil Red O staining of rat chondrocytes (A), and statistical analysis (B). Primary rat chondrocytes (p1) were cultured and treated with 50 μg/mL cholesterol for 72 hours in the high cholesterol group, 50 μg/mL cholesterol for 72 hours in the BNTA treatment group, followed by 0.1 μmol/L BNTA treatment for 24 hours, and the control group was treated with the same amount of saline. Toluidine blue stain and Oil Red O staining were performed after the intervention. The red dots in the figure are lipid droplets. Scale bar = 200 or 100 μm, ns, no statistical difference; ***, P <0.001; ****, P <0.0001

2.3 BNTA對高膽固醇刺激的大鼠軟骨細(xì)胞膽固醇代謝相關(guān)基因的影響

在上述結(jié)果中，本文觀察到BNTA能顯著改善軟骨細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積聚。為明確BNTA的作用機(jī)制，檢測了膽固醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。膽固醇穩(wěn)態(tài)主要由2個(gè)關(guān)鍵角色維持，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2-切割激活蛋白質(zhì)復(fù)合物(sterol regulatory element-binding protein 2-cleavage-activating protein complex, SREBP2-SCAP復(fù)合物)和轉(zhuǎn)錄因子肝X受體(liver X receptor，LXR)。SREBP2-SCAP復(fù)合物對膽固醇穩(wěn)態(tài)的調(diào)控依賴于胰島素誘導(dǎo)基因1 (Insig1)等調(diào)控因子，當(dāng)Insig1表達(dá)上調(diào)時(shí)，可通過抑制SREBP2、上調(diào)Insig1降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇[13]。而LXR作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，激活時(shí)可促進(jìn)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞和腸道細(xì)胞的膽固醇外排[14]。

RT-qPCR結(jié)果顯示，高膽固醇刺激時(shí)，促進(jìn)膽固醇外排的基因ABCA1、LXR-α、LXR-β表達(dá)顯著升高，BNTA治療后無顯著改變；BNTA處理后，細(xì)胞內(nèi)膽固醇生物合成相關(guān)基因SREBP2表達(dá)下調(diào)，Insig1表達(dá)上調(diào)，提示BNTA能影響膽固醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)，通過上調(diào)Insig1表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)的膽固醇穩(wěn)態(tài)緩解高膽固醇刺激引起的脂質(zhì)積聚(Fig.4A)。Western印跡結(jié)果也反映了上述基因在蛋白質(zhì)水平的變化趨勢。結(jié)果顯示，高膽固醇可引起SREBP2明顯上調(diào)，BNTA治療后可下調(diào)SREBP2(Fig.4B)。

2.4 BNTA可上調(diào)高膽固醇大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中的Insig1表達(dá)

為進(jìn)一步明確BNTA對高膽固醇誘導(dǎo)的OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Insig1的影響，本文進(jìn)行了insig1免疫組化染色。結(jié)果顯示，高脂飲食組相對正常飲食組大鼠Insig1表達(dá)顯著下調(diào)，BNTA治療可增高高脂飲食組大鼠的Insig1表達(dá)，提示BNTA能通過升高Insig1，影響膽固醇穩(wěn)態(tài)，緩解OA進(jìn)展(Fig.5)。

Fig.5 BNTA treatment up-regulated Insig1 expression in the OA model of rats with high cholesterol diets Six-week-old Sprague-Dawley rats were fed with high-cholesterol diets for 10 weeks, and then treated with local injection of BNTA in the joint cavity twice a week for 4 weeks. CD, control diet, HCD, high fat diet; NC, no special treatment, Vehicle, injection of the same amount of saline as the BNTA treatment group, BNTA, injection of 0.15 mg/kg BNTA treatment. Scale bar = 50 μm, **, P <0.01; ****, P <0.0001

3 討論

近年來，以膽固醇代謝紊亂為主的代謝綜合征在OA的發(fā)病機(jī)制研究中逐漸受到重視。研究表明，高膽固醇飲食可誘發(fā)大鼠膝關(guān)節(jié)退行性病變，且可作為誘發(fā)OA的獨(dú)立因素[15,16]。本研究采用高膽固醇飲食誘導(dǎo)大鼠OA模型，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究高膽固醇與OA的關(guān)系。組織學(xué)分析顯示，大鼠飼喂10周，HCD組軟骨破壞程度明顯高于CD組，蛋白質(zhì)多糖含量顯著減少，OA表型加重。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，采用外源性膽固醇刺激大鼠軟骨細(xì)胞。結(jié)果顯示，軟骨ECM合成代謝基因Col2，Acan，Sox9表達(dá)下調(diào)，軟骨ECM分解代謝相關(guān)基因Adamts5，Mmp13表達(dá)上調(diào)。體外細(xì)胞結(jié)果與體內(nèi)結(jié)果一致，即經(jīng)高濃度膽固醇處理的軟骨細(xì)胞，軟骨基因改變，表現(xiàn)出退行性改變，證實(shí)高膽固醇是OA的危險(xiǎn)因素，可引起OA軟骨的退行性變。

本研究通過關(guān)節(jié)腔注射給藥方式探究小分子藥物BNTA在高膽固醇大鼠OA模型中的作用。組織學(xué)評(píng)估證實(shí)，BNTA治療可改善高膽固醇引起的大鼠骨關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)表面情況改善、蛋白質(zhì)多糖含量增加等。RT-qPCR結(jié)果顯示，BNTA治療可以逆轉(zhuǎn)高膽固醇刺激所引起的ECM合成代謝與分解代謝相關(guān)基因改變，延緩OA進(jìn)展。以上結(jié)果表明，BNTA對高膽固醇誘發(fā)的OA具有緩解作用。

既往研究表明，軟骨細(xì)胞內(nèi)的膽固醇堆積會(huì)造成線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損傷，激活炎癥信號(hào)通路，使軟骨細(xì)胞發(fā)生不可逆損傷，引發(fā)軟骨退變[17]。膽固醇的穩(wěn)態(tài)受多種細(xì)胞表面受體調(diào)節(jié)。SREBP2-SCAP復(fù)合物定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，發(fā)揮膽固醇傳感器的作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平較高時(shí)，Insig蛋白將SREBP蛋白固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，阻止靶基因轉(zhuǎn)錄，從而阻止膽固醇的生物合成；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平較低時(shí)，Insig允許SREBP被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄并恢復(fù)膽固醇穩(wěn)態(tài)。研究認(rèn)為，高膽固醇可增加大鼠軟骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚，而調(diào)節(jié)血脂的藥物能通過抑制SREBP2降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇[18,19]。LXR作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在肝、脂肪組織和巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)，高濃度膽固醇可激活LXR，促進(jìn)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1表達(dá)上調(diào)，增加膽固醇外排[20,21]。在OA關(guān)節(jié)軟骨組織中，膽固醇外流相關(guān)基因ABCA1和肝X受體(LXRα和LXRβ)表達(dá)明顯低于正常，而LXR激動(dòng)劑能通過促進(jìn)膽固醇外排治療OA[22,23]。

本研究結(jié)果顯示，高膽固醇刺激可引起軟骨細(xì)胞脂質(zhì)異常積聚。BNTA治療后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚顯著減少。在軟骨細(xì)胞中，高膽固醇刺激上調(diào)Insig1、LXR-α、LXR-β和ABCA1，可能由于細(xì)胞內(nèi)短期膽固醇增高使細(xì)胞發(fā)生代償調(diào)節(jié)，上調(diào)Insig1減少膽固醇生物合成，激活LXR促進(jìn)膽固醇外排。BNTA治療可減少軟骨細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積聚，顯著上調(diào)Insig1，抑制SREBP2。在高膽固醇大鼠OA模型中，HCD組的大鼠Insig1表達(dá)下降，可能由于長期高膽固醇飲食導(dǎo)致血脂升高，細(xì)胞長期處于高膽固醇環(huán)境，調(diào)節(jié)機(jī)制受損，阻止膽固醇生物合成的Insig1蛋白表達(dá)下降。而BNTA治療后Insig1表達(dá)升高，OA緩解。以上結(jié)果提示，BNTA對高膽固醇引起的OA的治療作用可能與上調(diào)Insig1，減少膽固醇的生物合成相關(guān)。本研究仍存在一定局限性，未對BNTA是否對SREBP2-Insig1具有直接調(diào)控作用進(jìn)行驗(yàn)證，這將在未來的研究中進(jìn)行補(bǔ)充和深入探究。

綜上所述，本研究通過體外和體內(nèi)研究證實(shí)，高膽固醇可誘發(fā)OA，引起軟骨細(xì)胞脂質(zhì)積聚增加。BNTA治療能緩解高膽固醇引起的OA，通過升高Insig1改善軟骨細(xì)胞內(nèi)的異常脂質(zhì)積聚。本研究提示，小分子藥物BNTA治療能影響細(xì)胞中的膽固醇代謝，對高膽固醇引起的OA具有治療潛力。