4種雞源致病性沙門氏菌多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

劉東海，王慧真，姜婷婷，鄧云貴，李 想，張凱迪，劉彥威,2,3，劉 娜,2,3，崔國林,2,3*

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2.河北省禽病工程技術(shù)研究中心，河北邯鄲 056038；3.邯鄲市動物醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北邯鄲 056038)

沙門氏菌病是導(dǎo)致雞只健康問題和蛋肉品質(zhì)下降的主要細(xì)菌類傳染病，沙門氏菌(Salmonella)血清型眾多，至今有2600多種[1]，且均具有致病性[2]。腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis，SE)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium,ST)、雞白痢沙門氏菌(Salmonellapullorum,SP)和雞傷寒沙門氏菌(Salmonellagallinarum,SG)是我國當(dāng)前養(yǎng)雞場主要沙門氏菌流行血清型。雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌表型形似、O抗原相同，分別引起雛雞白痢和禽傷寒，導(dǎo)致雞群高死亡率[3]。腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌具有廣泛宿主嗜性，感染成年雞后一般呈隱性經(jīng)過，但可垂直傳染給下一代或通過肉和蛋等制品引起人類食物中毒。在世界各地食物中毒事件中，沙門氏菌食物中毒居首位，其中腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌排在前兩位[4]。在已經(jīng)完成雞白痢沙門氏菌凈化的養(yǎng)雞場，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌成為主要沙門氏菌流行血清型，且因其極強的水平傳播能力，不易通過類似雞白痢沙門氏菌種源途徑凈化。

多重PCR方法具有快速、靈敏、通量高等優(yōu)點，已廣泛用于沙門氏菌檢測。沙門氏菌血清型眾多，在食品、環(huán)境、不同種動物中的主要流行血清型各異，不同領(lǐng)域研究者已建立多種血清型沙門菌多重PCR鑒定方法。如區(qū)分食品中腸炎、鼠傷寒、傷寒、嬰兒沙門氏菌的多重PCR方法[4-5]；區(qū)分禽腸炎、鼠傷寒、雞白痢、雞傷寒、都柏林沙門菌氏菌的多重PCR方法[1,3,6-7]。近年來，一些新的具有沙門氏菌型鑒別意義的基因被鑒定，研究據(jù)其建立沙門氏菌多重PCR方法，進(jìn)一步完善沙門氏菌鑒定系統(tǒng)。

invA是沙門氏菌SPI-1組成基因，僅存在于沙門氏菌屬，普遍用于沙門氏菌屬鑒定[8]。試驗發(fā)現(xiàn)lygD基因內(nèi)部Sdf I片段特異性出現(xiàn)于腸炎沙門氏菌，可作為腸炎沙門氏菌鑒別靶標(biāo)[9]。STM4497僅出現(xiàn)于鼠傷寒沙門氏菌，可將其作為鼠傷寒沙門氏菌鑒別靶位[9]。與其他沙門氏菌不同，雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌無鞭毛，鞭毛分泌系統(tǒng)基因flhB缺失197 bp核酸片段[10]，該片段區(qū)域可用于雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌快速鑒定。本研究以invA、lygD(Sdf I)、STM4497、flhB為靶位建立多重PCR，測定該方法的特異性和靈敏度，并對河北地區(qū)蛋種雞細(xì)菌分離株進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 2×TaqMix，康潤生物公司產(chǎn)品；BPW、TTB培養(yǎng)基、沙門氏菌生化鑒定試劑盒，北京陸橋公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京索萊寶公司產(chǎn)品；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，法國科瑪嘉公司產(chǎn)品；沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)血清，寧波天潤公司產(chǎn)品。

1.1.2 菌株來源 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、盲腸腸球菌(Enterococcuscecorum)由本實驗室保存。

腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis，ATCC13076)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium，ATCC14028)、雞白痢沙門氏菌(Salmonellapullorum，ATCC13036)、雞傷寒沙門氏菌(Salmonellagallinarum，ATCC9184)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeroesuis)、科特布斯沙門氏菌(Salmonellakottbus)、都柏林沙門氏菌(Salmonelladublin，CVCC3760)、鴨沙門氏菌(Salmonellaanatum)、山夫登堡沙門氏菌(Salmonellasenftenberg)、埃皮耶姆沙門氏菌(Salmonellaapeyeme)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)蘇敬良教授惠贈。

1.1.3 主要儀器 NanoDrop超微量核酸蛋白定量儀，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；Biometra TOne PCR儀，德國耶拿分析儀器有限公司產(chǎn)品；164-5050電泳儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)，美國GE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 沙門氏菌分離與血清分型 2018年1月至2021年3月，從河北省某大型蛋種雞企業(yè)3家孵化場、4家育雛場、10家產(chǎn)蛋場的終止胚、雛雞、死淘雞、雞糞、雞舍環(huán)境中收集6 500份樣品，經(jīng)BPW預(yù)增菌、TTB選擇性增菌、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)和純化后，用沙門氏菌生化試紙條進(jìn)行菌種鑒定，用沙門氏菌O1～O12混合標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行凝集試驗，如出現(xiàn)凝集，用沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)血清O4、O9、Hi、Hg、Hm進(jìn)行凝集試驗，確定分離株血清型。

1.2.2 引物設(shè)計 選擇沙門氏菌屬的腸炎、鼠傷寒、雞白痢/雞傷寒沙門氏菌特異性基因，用Primer Premier 6軟件設(shè)計引物(表1)。

表1本研究使用的引物

1.2.3 細(xì)菌DNA模板提取 腸炎沙門氏菌(ATCC13076)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC14028)、雞白痢沙門氏菌(ATCC13036)、雞傷寒沙門氏菌(ATCC9184)挑取單菌落，接種TSB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)后，吸取1 mL 菌懸液，12 000 r/min 離心2 min，棄上清，用PBS緩沖液1 mL 洗滌菌體2次，12 000 r/min 離心2 min，棄上清液，沉淀重懸于200 μL三蒸水中，再按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒步驟提取細(xì)菌基因組，經(jīng)NanoDrop超微量核酸蛋白定量儀測定核酸濃度，置-20℃保存。

1.2.4 PCR反應(yīng)程序 以腸炎沙門氏菌(ATCC13076)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC14028)、雞白痢沙門氏菌(ATCC13036)、雞傷寒沙門氏菌(ATCC9184)基因組(100 ng/μL)為模板，建立20 μL反應(yīng)體系：2×TaqMix 10 μL，模板1 μL，invAF 0.4 μL，invAR 0.4 μL，STM4497F 1 μL，STM4497R 1 μL，SdfF 0.4 μL，SdfR 0.4 μL，flhBF 0.4 μL，flhBR 0.4 μL，無菌水4.6 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳(120 V 30 min)后，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5 靈敏度檢測 設(shè)定每個反應(yīng)體系中腸炎、鼠傷寒、雞白痢/雞傷寒沙門氏菌基因組DNA含量分別為5、0.5、0.05、0.005 ng，利用優(yōu)化的多重PCR方法檢測，確定多重PCR方法對細(xì)菌基因組DNA靈敏度。設(shè)定每個反應(yīng)體系中腸炎、鼠傷寒、雞白痢/雞傷寒沙門氏菌細(xì)菌數(shù)量分別為1×105CFU、1×104CFU、1×103CFU、1×102CFU、1×101CFU、1×100CFU、1×10-1CFU、1×10-2CFU，利用優(yōu)化的多重PCR方法檢測，確定多重PCR方法對細(xì)菌靈敏度。

1.2.6 特異性檢測 用優(yōu)化的多重PCR方法，分別檢測葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、糞腸球菌、卡他莫拉菌、支氣管敗血波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、盲腸腸球菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、科特布斯沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、鴨沙門氏菌、山夫登堡沙門氏菌、埃皮耶姆沙門氏菌，確定多重PCR方法特異性。

1.2.7 臨床樣本檢測 用優(yōu)化的多重PCR方法，檢測1.2.1中沙門氏菌分離株，調(diào)查河北地區(qū)規(guī)模化蛋種雞生產(chǎn)鏈中沙門氏菌污染和感染現(xiàn)狀。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR方法的建立

根據(jù)沙門氏菌屬的腸炎、鼠傷寒、雞白痢/雞傷寒沙門氏菌特異性基因和多重PCR產(chǎn)物長度需求，分別重新設(shè)計invA、Sdf、flhB引物序列，使兩條電泳帶距離不小于100 bp。引物濃度均為0.2 μmol/L和0.5 μmol/L時，STM4497基因亮度較弱；保持其他引物濃度為0.2 μmol/L，提高STM4497引物濃度至0.5 μmol/L時，各菌株條帶亮度均較強。確定invA、Sdf I、STM4497、flhB引物濃度分別為0.2 、0.2、0.5、0.2 μmol/L(圖1A)。55℃～62℃時雞白痢/雞傷寒沙門氏菌flhB條帶亮度無明顯差異，鼠傷寒沙門氏菌flhB條帶亮度在58℃升至最高，Sdf I和STM4497條帶均較亮。確定最優(yōu)退火溫度為58℃(圖1B、圖1C)。

A.引物濃度篩選 1～2.引物濃度均為0.2 μmol/L和0.5 μmol/L；3.invA、Sdf I、flhB引物濃度為0.2 μmol/L，STM4497引物濃度為0.5 μmol/L B～C.退火溫度篩選 1～8.55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃；N.無菌水

2.2 靈敏度分析

SdfI、flhB、STM4497引物的檢測靈敏度為0.05 ng，invA引物的檢測靈敏度為0.5 ng，綜合判定多重PCR的核酸濃度檢測靈敏度為0.5 ng(圖2A)。沙門氏菌菌落數(shù)目靈敏度檢測見圖2B、圖2C，SdfI引物的檢測靈敏度可至10 CFU，STM4497、flhB、invA引物的檢測靈敏度可至100 CFU，綜合判定多重PCR的菌落數(shù)目檢測靈敏度為100 CFU。

A.基因組DNA靈敏度檢測，1～4.反應(yīng)體系模板含量分別為5、0.5、0.05、0.005 ng；B～C.細(xì)菌靈敏度檢測，1～8反應(yīng)體系細(xì)菌數(shù)目分別為1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100、1×10-1 、1×10-2 CFU

2.3 特異性分析

腸炎和鼠傷寒沙門氏菌均出現(xiàn)特異性的3個條帶，雞白痢和雞傷寒沙門氏菌均出現(xiàn)特異性的2個條帶，其他6種沙門氏菌出現(xiàn)特異性的2個條帶，其他環(huán)境或腸道細(xì)菌均未出現(xiàn)條帶(圖3)。

1～10.雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、科特布斯沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鴨沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、埃皮耶姆沙門氏菌、山夫登堡沙門氏菌；11～19.金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、糞腸球菌、卡他莫拉菌、支氣管敗血波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、盲腸腸球菌；N.無菌水

2.4 臨床樣本檢測分析

從6 500份種雞場樣品中共分離到343株沙門氏菌，分離率為5.28%。通過生化試驗、平板凝集試驗和多重PCR對分離株進(jìn)行鑒定和血清分型，兩種方法的符合率100%(圖4和表2)。沙門氏菌分離株中，腸炎沙門氏菌295株、鼠傷寒沙門氏菌10株、雞白痢/雞傷寒沙門氏菌2株、未定型沙門氏菌36株，分別占沙門氏菌分離株的86.01%、2.92%、0.58%、10.50%。腸炎沙門氏菌是河北地區(qū)蛋種雞生產(chǎn)鏈中沙門氏菌主要流行血清型。

1～16.臨床樣本；SE.腸炎沙門氏菌；ST.鼠傷寒沙門氏菌；SP.雞白痢沙門氏菌；SG.雞傷寒沙門氏菌；N.無菌水

表2臨床分離菌株平板凝集試驗和多重PCR鑒定

3 討論

雞白痢和雞傷寒沙門氏菌屬專嗜性沙門氏菌，主要為垂直引起雞較高死亡率。北美和澳大利亞等已基本清除商品雞中的雞白痢和雞傷寒沙門氏菌[11]，我國規(guī)模化種雞場也基本實現(xiàn)了雞白痢沙門氏菌凈化，但我國商品雞中雞白痢沙門氏菌仍普遍存在[12]。與雞白痢沙門氏菌不同，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌可感染鼠類、鳥類及人等多種生物，既可垂直傳播也可水平傳播感染雞只，是雞白痢沙門氏菌凈化場區(qū)主要流行血清型，不易通過種源凈化清除。不同血清型沙門氏菌感染場區(qū)，防控和凈化策略也不同，及時準(zhǔn)確鑒定場區(qū)沙門氏菌血清型具有重要意義。

傳統(tǒng)沙門氏菌鑒定采用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)純化、生化鑒定和血清平板凝集試驗分型，成本高、工作量大、需專業(yè)操作人員，且平板凝集試驗易出現(xiàn)假陽性?；谏抽T氏菌特異性基因的PCR方法具有快速、靈敏和準(zhǔn)確等優(yōu)點，適于沙門氏菌快速鑒定。多重PCR是在單基因PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測方法，可實現(xiàn)2種以上基因同時檢測，進(jìn)一步提升PCR檢測速度和通量。參考前人發(fā)現(xiàn)的沙門氏菌屬的腸炎、鼠傷寒、雞白痢/雞傷寒沙門氏菌特異性基因設(shè)計引物，成功建立一種同時檢測以上血清型沙門氏菌的多重PCR方法，該方法的檢測靈敏度達(dá)100 CFU細(xì)菌和0.5 ng基因組DNA。非特異性擴增是單重PCR常見的問題，為防范這一問題，研究為每種血清型沙門氏菌設(shè)計不少于兩套引物，極大地提高結(jié)果的特異性，如沙門氏菌屬、雞白痢/雞傷寒沙門氏菌均由invA和flhB2個基因共同鑒定，腸炎沙門氏菌由invA、Sdf I、flhB3個基因共同鑒定，鼠傷寒沙門氏菌由invA、STM4497、flhB3個基因共同鑒定。

用建立的多重PCR方法對2018年-2021年河北地區(qū)某大型蛋種雞企業(yè)生產(chǎn)鏈上下游17家場區(qū)進(jìn)行沙門氏菌流行情況調(diào)查，僅從2018年樣品檢出2株雞白痢/雞傷寒沙門氏菌，2019年-2021年均未檢出，提示雞白痢/雞傷寒沙門氏菌在該企業(yè)已實現(xiàn)凈化；86.01%沙門氏菌分離株屬于腸炎沙門氏菌，提示腸炎沙門氏菌已成為河北地區(qū)規(guī)?；胺N雞場沙門氏菌主要流行血清型，因此沙門氏菌防控策略應(yīng)作出對應(yīng)調(diào)整。