氮磷比對(duì)微囊藻與柵藻磷賦存及分配的影響*

譚 嘯，石 琳，段志鵬,2，曾慶飛，李聶貴，強(qiáng) 娟

(1：河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院,淺水湖泊綜合治理與資源開(kāi)發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210024) (2：河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，南京 210024) (3：中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008) (4：水利部南京水利水文自動(dòng)化研究所，南京 210012) (5：常州市武進(jìn)區(qū)水利局，常州 213115)

近年來(lái)，隨著污染控制力度與管理措施的加強(qiáng)，我國(guó)一些湖泊的氮磷濃度及比例已悄然發(fā)生變化[1]. 以太湖為例， Qin等[1]研究發(fā)現(xiàn)全湖水體總氮濃度在2007-2019年之間下降了約27%，而水體總磷濃度自2015年以來(lái)出現(xiàn)明顯波動(dòng)上升態(tài)勢(shì)，導(dǎo)致水體氮磷比下降了約35%. 水體顆粒態(tài)磷(PP)約占水體總磷的69%，是影響水體總磷季節(jié)變化和年際變化的主要成分之一[2]. 夏季藻華期間，升溫和溶解氧下降等因素加快了水體微生物反硝化脫氮速率，導(dǎo)致藻細(xì)胞處于低氮磷比環(huán)境[3]. 已有研究表明，氮磷比變化能顯著影響藻類的營(yíng)養(yǎng)攝取與分配[4-5]. 因此，氮磷比下降可能會(huì)對(duì)藻體顆粒態(tài)磷產(chǎn)生潛在影響.

一般認(rèn)為，藻細(xì)胞對(duì)磷的吸收和利用過(guò)程包括胞外聚合物(EPS)吸附、富集和跨膜運(yùn)輸后被藻細(xì)胞利用[6-7]. 一些藻類不僅能在胞內(nèi)儲(chǔ)存磷，還能在胞外富集大量磷元素，且藻體胞外磷(EPS-P)的富集與EPS分泌密切相關(guān)[7]. 研究發(fā)現(xiàn)，氮濃度變化顯著影響了藻細(xì)胞EPS分泌[8-9]. 例如，Duan等[10]發(fā)現(xiàn)，隨著氮濃度降低，微囊藻EPS含量增加一倍，從3.9 pg/cell提高到7.9 pg/cell. De Philippis等[11]也發(fā)現(xiàn)，在氮限制條件下，藍(lán)藻細(xì)胞EPS含量增加了2.2倍. 因此，氮濃度變化可能改變?cè)寮?xì)胞EPS分泌，影響藻細(xì)胞磷的賦存及分配模式. 此外，氮濃度變化還影響藻細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的合成，影響藻細(xì)胞對(duì)磷元素的需求[12-13]. 然而，已有較多研究關(guān)注不同氮濃度對(duì)藻類生長(zhǎng)和EPS產(chǎn)量的響應(yīng)[10-13]，對(duì)于氮濃度變化如何影響藻類磷元素賦存及分配的探究較少，特別是缺少EPS分泌與細(xì)胞磷賦存及分配定量關(guān)系的研究.

水體顆粒態(tài)磷包含可交換態(tài)活性磷、弱結(jié)合態(tài)磷、鐵鋁結(jié)合態(tài)磷、鈣結(jié)合態(tài)磷和有機(jī)磷等形態(tài). 藻細(xì)胞能夠快速吸收水中的可交換態(tài)活性磷，還具有“過(guò)量”儲(chǔ)存磷的能力[14-15]. 鐵鋁結(jié)合態(tài)磷具有潛在生物可利用性[16]. 在一定條件下，鐵鋁結(jié)合態(tài)磷是藻細(xì)胞磷元素的主要來(lái)源[17]. 相比而言，鈣結(jié)合態(tài)磷較穩(wěn)定，不易被藻類吸收利用[18]. 已有研究主要關(guān)注不同形態(tài)磷的釋放風(fēng)險(xiǎn)和生物可利用性，但缺乏藻體磷形態(tài)、含量及分配模式的深入研究.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種

本研究采用的群體微囊藻(Microcystissp.)，藻株由Duan等[10]在2016年從太湖梅梁灣分離純化獲得.自分離以來(lái)，該藻株在5年多時(shí)間內(nèi)一直維持群體形態(tài)，且附生菌含量低[10]. 斜生柵藻(S.obliquus，F(xiàn)ACHB-416)和單細(xì)胞微囊藻(銅綠微囊藻M.aeruginosa，F(xiàn)ACHB-469)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù).

1.2 培養(yǎng)條件

采用BG-11培養(yǎng)基活化上述3種藻. 培養(yǎng)溫度為25℃，光強(qiáng)為45 μmol/(m2?s)，光暗周期為12 h∶12 h. 活化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，再分別將其轉(zhuǎn)接到不同氮磷比的BG-11培養(yǎng)基中，初始接種時(shí)的細(xì)胞濃度均為1×105cells/mL. 參考Redfield定律，設(shè)置改良BG-11培養(yǎng)基中的氮磷濃度和比例. Redfield定律指出藻細(xì)胞的碳氮磷摩爾比為106∶16∶1，這也是藻類生長(zhǎng)的最佳營(yíng)養(yǎng)比例. 藍(lán)藻生長(zhǎng)適宜的氮磷比為10∶1～16∶1[19]，當(dāng)?shù)妆鹊陀?0∶1且其它條件適宜時(shí)，氮元素會(huì)成為限制因子[20-21]. 因此，本研究設(shè)置N∶P=20作為高氮磷比組(初始氮濃度為84 mg/L)，設(shè)置N∶P=2作為低氮磷比組(初始氮濃度為8.4 mg/L)，兩組的初始磷濃度均為9.3 mg/L. 在批次培養(yǎng)中，監(jiān)測(cè)藻細(xì)胞濃度變化，當(dāng)3種藻的生長(zhǎng)曲線均進(jìn)入穩(wěn)定期初期時(shí)，收獲藻細(xì)胞，分析生理生化指標(biāo)，包括測(cè)定光合活性、色素含量、EPS含量和各組分磷含量. 以上每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行.

1.3 細(xì)胞濃度、比生長(zhǎng)速率和群體形態(tài)分析

采用分光光度計(jì)(島津UV-2450，日本)測(cè)定藻細(xì)胞濃度，監(jiān)測(cè)藻細(xì)胞生長(zhǎng). 首先分別在687、683、750 nm建立斜生柵藻、單細(xì)胞微囊藻和群體微囊藻的藻懸液吸光度與細(xì)胞濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線[22]，兩者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2值分別為0.999(斜生柵藻)、0.998(單細(xì)胞微囊藻)和0.999(群體微囊藻). 群體微囊藻的細(xì)胞濃度測(cè)定時(shí)需首先將群體分散為單細(xì)胞. 具體操作方法為[23]：取2 mL群體微囊藻懸液，超聲處理30 s(35 kHz，0.013 W/cm3)，然后采用去離子水稀釋10倍，搖勻制備藻懸液，在750 nm測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 當(dāng)比生長(zhǎng)速率接近零時(shí)，被認(rèn)定達(dá)到穩(wěn)定期初期. 通過(guò)計(jì)算比生長(zhǎng)速率，可以準(zhǔn)確判斷藻類生長(zhǎng)曲線是否到達(dá)穩(wěn)定期初期. 具體參考以下公式[24]：

μ=(lnNt-lnN0)/Δt

(1)

式中，N0為藻細(xì)胞初始濃度(cells/mL)，Nt為培養(yǎng)t天后的藻細(xì)胞濃度(cells/mL)，Δt為樣品采集時(shí)間間隔(d).

通過(guò)顯微拍照法(AxioCam ICc3，德國(guó)卡爾·蔡司)記錄群體微囊藻的形態(tài)變化.

1.4 EPS的提取與形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

1.4.1 EPS的提取與測(cè)定 參考文獻(xiàn)[25]，采用熱硼酸法高效無(wú)損地提取藻細(xì)胞EPS. 具體方法為：取35 mL藻懸液5000轉(zhuǎn)/min離心10 min，去除上清液，收集藻細(xì)胞；加入35 mL硼酸緩沖液(0.49 mmol/L H3BO3、0.2 mmol/L Na2B4O7·10H2O和85.6 mmol/L NaCl的混合溶液，pH=8.5 )，搖勻后，65℃水浴加熱30 min. 其間，每隔10 min搖勻一次. 水浴結(jié)束后，取出冷卻至室溫，11000轉(zhuǎn)/min低溫(4℃)離心15 min，吸取清液，用玻璃纖維濾膜過(guò)濾(0.45 μm，上海新亞)，測(cè)定濾液中的總有機(jī)碳(TOC)含量(TOC-VCPN，日本島津)，用來(lái)表征EPS含量[23]. 同時(shí)采用預(yù)先酸洗(1% HCl溶液)并干燥后的0.45 μm玻璃纖維濾膜，過(guò)濾收集藻細(xì)胞沉淀，用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的磷含量(INT-P).

1.4.2 EPS形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 取群體微囊藻樣品凍干24 h(LGJ-12凍干機(jī)，北京松源)，采用掃描電鏡(ZEISS EVO18，德國(guó)卡爾·蔡司)，通過(guò)SE1檢測(cè)器記錄群體微囊藻的EPS形態(tài)(電壓20 kV，工作距離8.5 mm，放大1000～5000倍).

1.5 藻細(xì)胞磷含量與分布的測(cè)定

采用預(yù)先酸洗(1% HCl溶液)并干燥后的0.45 μm玻璃纖維濾膜，過(guò)濾35 mL藻液收集藻細(xì)胞用于藻體磷含量(CTP)測(cè)定，通過(guò)鉬藍(lán)比色法[26]測(cè)定CTP和INT-P含量. 將CTP含量減去INT-P含量得到藻體胞外磷(EPS-P)含量.

在進(jìn)行截骨之前，先置入內(nèi)固定器械，然后再進(jìn)行椎板切除，椎弓根螺釘置入范圍包括截骨區(qū)域及其上下共3個(gè)椎體。椎板切除范圍應(yīng)包括計(jì)劃截骨區(qū)域上下各1個(gè)節(jié)段，這樣能有效防止截骨過(guò)程中脊髓的皺褶、短縮。完成椎板切除術(shù)后，應(yīng)去除一半或者全部的橫突，以獲得從側(cè)方進(jìn)入椎體的空間。上位椎體的下關(guān)節(jié)突和下位椎體的上關(guān)節(jié)突應(yīng)該各去除一半，以保證在截骨閉合后這個(gè)空間能同時(shí)容納上下2條神經(jīng)根走行。然后用磨鉆或者骨鑿去除兩側(cè)的椎弓根，這個(gè)過(guò)程中一定要注意保護(hù)硬膜和上下神經(jīng)根。在以上操作過(guò)程中，通常需要放置一根臨時(shí)棒以保證截骨閉合前脊柱的穩(wěn)定性，避免脊髓的皺褶、短縮。

1.6 葉綠素a含量及熒光參數(shù)測(cè)定

1.6.1 葉綠素a的提取與測(cè)定 參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》[27]測(cè)定和計(jì)算葉綠素a含量. 具體方法為：取5 mL藻液，用0.45 μm玻璃纖維濾膜過(guò)濾，將濾膜放入10 mL離心管，加入5 mL的90%丙酮溶液，完全浸入并在4℃黑暗靜置24 h后，3000轉(zhuǎn)/min離心10 min，吸取上清液，通過(guò)比色法測(cè)定葉綠素a含量.

1.6.2 葉綠素a熒光與JIP-test分析 取2 mL藻液，經(jīng)15 min暗適應(yīng)后，采用葉綠素?zé)晒鈨x(AquaPen-C100，捷克)記錄葉綠素a熒光動(dòng)力學(xué)曲線并進(jìn)行JIP-test分析[28-29].

1.7 群體微囊藻細(xì)胞磷的分級(jí)提取與測(cè)定

參考并改進(jìn)Wu等[15]不同形態(tài)磷的連續(xù)分級(jí)提取法，提取群體微囊藻的各形態(tài)磷. 具體步驟為：(1)可交換態(tài)活性磷(NH4Cl-P)的提?。翰捎?.45 μm玻璃纖維濾膜過(guò)濾35 mL藻液，收集群體微囊藻，按1.4.1節(jié)的方法提取EPS后，將所獲樣品置入離心管，加入35 mL 1.0 mol/L NH4Cl溶液，調(diào)節(jié)pH=7，在25℃孵育2 h后離心(5000轉(zhuǎn)/min，10 min)，取上清液用比色法測(cè)定磷含量[26]. (2)鐵鋁結(jié)合態(tài)磷(Fe/Al-P)的提?。河?.05% NaCl溶液對(duì)步驟(1)中藻體沉淀沖洗2次后加入35 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，25℃孵育16 h后離心(5000轉(zhuǎn)/min，10 min)，取上清液用比色法測(cè)定磷含量[26]. (3)鈣結(jié)合態(tài)磷(Ca-P)的提取：用0.05% NaCl溶液對(duì)步驟(2)中藻細(xì)胞沉淀沖洗2次后加入35 mL 0.5 mol/L HCl溶液，25℃孵育16 h后離心(5000轉(zhuǎn)/min，10 min)，取上清液用比色法測(cè)定磷含量[26]. (4)殘余磷(Residual-P)的提取：用0.05%NaCl溶液對(duì)步驟(3)中藻細(xì)胞沉淀沖洗2次后加入35 mL 1 mol/L H2SO4溶液，25℃孵育24 h后離心(5000轉(zhuǎn)/min，10 min)，取上清液用比色法測(cè)定磷含量[26].

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018整理數(shù)據(jù)并繪圖；采用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Tukey post-hoc檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析，設(shè)定顯著性水平為P<0.05(*)和P<0.01(**).

2 結(jié)果

2.1 氮磷比對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響

藻類比生長(zhǎng)速率(μ)趨于零時(shí)，到達(dá)穩(wěn)定期初期. 低氮磷比組的斜生柵藻和單細(xì)胞微囊藻在第14天到達(dá)穩(wěn)定期初期，此時(shí)比生長(zhǎng)速率分別為0.03和0.12 d-1(圖1A，B). 群體微囊藻在第12天到達(dá)穩(wěn)定期初期，此時(shí)比生長(zhǎng)速率為0.02 d-1(圖1C). 高氮磷比組的3種藻到達(dá)穩(wěn)定期均較晚. 斜生柵藻在第24天到達(dá)穩(wěn)定期初期，此時(shí)比生長(zhǎng)速率為0.05 d-1(圖1A). 單細(xì)胞微囊藻在第24天到達(dá)穩(wěn)定期初期，此時(shí)比生長(zhǎng)速率為0.04 d-1(圖1B). 群體微囊藻在第28天到達(dá)穩(wěn)定期初期，此時(shí)比生長(zhǎng)速率為-0.01 d-1(圖1C). 此外，高氮磷比組的單細(xì)胞微囊藻和群體微囊藻的葉綠素a含量為4.0和5.8 pg/cell，分別是低氮磷比組的1.6和3.7倍(圖1D)，而氮磷比對(duì)斜生柵藻的葉綠素a含量沒(méi)有顯著影響(P>0.05).

圖1 氮磷比對(duì)斜生柵藻(A)、單細(xì)胞微囊藻(B)和群體微囊藻(C)細(xì)胞濃度、比生長(zhǎng)速率及葉綠素a 含量(D)的影響(數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)；*表示P<0.05，**表示P<0.01)Fig.1 Effects of N∶P ratio on cell concentrations and growth rate of S. obliquus (A), unicellular Microcystis (B) and colonial Microcystis (C) and changes in their chlorophyll-a contents (D) (* indicates P<0.05，** indicates P<0.01)

2.2 氮磷比對(duì)葉綠素a熒光及光合活性的影響

高氮磷比和低氮磷比組的斜生柵藻和微囊藻葉綠素a熒光均表現(xiàn)出典型的快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP曲線). 相比而言，低氮磷比組藻類的熒光強(qiáng)度較弱，且氮磷比對(duì)最大熒光強(qiáng)度值(P點(diǎn))的影響不顯著(P>0.05)(圖2A，C，E).

JIP-test參數(shù)中，低氮磷比組的斜生柵藻電子傳遞效率(ETo/TRo)比高氮磷比組高，而OJIP曲線初始斜率(Mo)和最大光量子產(chǎn)量(Fv/Fm)較低. 低氮磷比組的單細(xì)胞微囊藻和群體微囊藻ETo/TRo(單細(xì)胞微囊藻P<0.05，群體微囊藻P<0.01)和Fv/Fm值均較高(P<0.05)(圖2B，D，F(xiàn)).

圖2 氮磷比對(duì)斜生柵藻(A、B)、單細(xì)胞微囊藻(C、D)和群體微囊藻(E、F)葉綠素a快速熒光動(dòng)力學(xué) 曲線與JIP-test參數(shù)的影響(*表示P<0.05，**表示P<0.01)Fig.2 Effects of N∶P ratio on chlorophyll-a fast fluorescence kinetic curve and JIP-test parameters of S. obliquus (A, B), unicellular Microcystis (C, D) and colonial Microcystis (E, F) (* indicates P<0.05, ** indicates P<0.01)

2.3 氮磷比對(duì)藻體胞內(nèi)磷和胞外磷含量及分配模式的影響

低氮磷比組斜生柵藻和群體微囊藻的EPS-P含量分別為0.82和0.31 pg/cell，均顯著高于高氮磷比組(P<0.05). 然而，氮磷比對(duì)單細(xì)胞微囊藻EPS-P含量無(wú)顯著影響(P>0.05). 本研究中，3種藻細(xì)胞的INT-P含量占比均較低，且在低氮磷比和高氮磷比組間無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖3).

EPS與EPS-P含量呈現(xiàn)類似規(guī)律，低氮磷比組的斜生柵藻和群體微囊藻EPS含量明顯高于高氮磷比組(斜生柵藻P<0.05，群體微囊藻P<0.01). 然而，單細(xì)胞微囊藻EPS含量在高氮磷比和低氮磷比組間無(wú)顯著差異(P>0.05).

圖3 氮磷比對(duì)斜生柵藻(A)、單細(xì)胞微囊藻(B)和群體微囊藻(C) EPS-P、INT-P以及EPS含量(D)的影響 (*表示P<0.05，**表示P<0.01)Fig.3 Effects of N∶P ratio on EPS-P and INT-P contents of S. obliquus(A), unicellular Microcystis(B), colonial Microcystis(C) and EPS contents(D) (* indicates P<0.05，** indicates P<0.01)

2.4 氮磷比對(duì)群體微囊藻磷形態(tài)分布的影響

群體微囊藻細(xì)胞磷以可交換態(tài)活性磷(NH4Cl-P)和鐵鋁結(jié)合態(tài)磷(Fe/Al-P)為主. 其中，低氮磷比組NH4Cl-P含量為0.265 pg/cell，約占藻體磷的75%，F(xiàn)e/Al-P含量為0.085 pg/cell，約占藻體磷的24%. 然而，高氮磷比組的NH4Cl-P與Fe/Al-P含量分別為0.068和0.081 pg/cell，共占藻體磷的50%左右(表1).

此外，NH4Cl-P含量分別是低氮磷比組和高氮磷比組群體微囊藻EPS-P的87%和55%，且低氮磷比組NH4Cl-P占比高. 而Fe/Al-P僅占EPS-P含量的13%～43%. 相反，兩組氮磷比條件下的群體微囊藻INT-P主要以Fe/Al-P形態(tài)存在，約占INT-P的80%，而NH4Cl-P僅占INT-P的17%～20%.

表1 氮磷比對(duì)藻體磷(CTP)、藻體胞內(nèi)磷(INT-P)和藻體胞外磷(EPS-P)含量及形態(tài)分布占比的影響

2.5 氮磷比對(duì)微囊藻群體形態(tài)及其EPS結(jié)構(gòu)的影響

光學(xué)顯微鏡照片顯示，高氮磷比組的群體微囊藻密實(shí)且碩大(圖4A)，而低氮磷比組的群體微囊藻較松散(圖4D). 電子顯微鏡照片顯示，高氮磷比組群體微囊藻的EPS呈膜狀片層，包裹著藻細(xì)胞(圖4B，C)，而低氮磷比組的群體微囊藻EPS呈疏松網(wǎng)狀(圖4E，F(xiàn)).

圖4 高氮磷比組(A、B、C)與低氮磷比組(D、E、F)群體微囊藻及EPS的顯微照片F(xiàn)ig.4 Micrographs of colonial Microcystis and its EPS structures in the high (A, B, C) and low (D, E, F) N∶P groups

3 討論

3.1 氮磷比對(duì)藻體磷賦存及分配的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，斜生柵藻和群體微囊藻磷含量(CTP，包括INT-P和EPS-P)在低氮磷比條件下顯著增加(P<0.05). 此時(shí)，斜生柵藻和群體微囊藻磷含量分別為1.06和0.36 pg/cell，是高氮磷比條件下藻體磷含量的2.7和1.4倍. 有研究表明，在氮濃度較低時(shí)，微囊藻細(xì)胞具有快速吸收無(wú)機(jī)磷的能力[30]，藻體磷賦存量顯著增加. 通過(guò)圍隔實(shí)驗(yàn)得到進(jìn)一步證實(shí)，當(dāng)?shù)獫舛容^低時(shí)，藍(lán)藻細(xì)胞大量吸收磷，藻體磷含量從初始的0.21 pg/cell增加到0.33 pg/cell[31]. Oliver和Ganf[12]認(rèn)為，缺氮使藻細(xì)胞生長(zhǎng)受限，磷元素消耗量隨之減少，增加了藻體磷元素的積累. 本研究發(fā)現(xiàn)，低氮磷比改變了藻體磷的分配模式. 在低氮磷比條件下，藻體胞外磷(EPS-P)占藻體磷的80%～90%，而藻體胞內(nèi)磷僅占藻體磷的10%～20%. 同時(shí)發(fā)現(xiàn)藻體胞內(nèi)磷含量對(duì)氮磷比無(wú)顯著響應(yīng)(P>0.05)，而斜生柵藻和群體微囊藻低氮磷比時(shí)的胞外磷含量顯著升高(圖3A，C). 這表明，不同氮磷比對(duì)胞外磷含量的影響是藻體磷含量變化的主要原因. 本研究中，雖然低氮磷比時(shí)斜生柵藻與群體微囊藻磷含量變化趨勢(shì)一致，但相關(guān)研究表明，夏季太湖暴發(fā)藍(lán)藻水華主要為微囊藻群體，綠藻等其他藻類生物量相對(duì)較少[24]. 因此，斜生柵藻等綠藻對(duì)夏季太湖總磷波動(dòng)影響較小.

不同形態(tài)磷的比例會(huì)影響藻類代謝與增殖，也會(huì)影響磷循環(huán)過(guò)程. 陳俊等[32]研究發(fā)現(xiàn)，藻體通過(guò)理化吸附和生物富集作用獲得不同形態(tài)磷(主要是溶解性總磷和溶解性磷酸鹽，分別占藻體磷含量的40%和25%). 本研究發(fā)現(xiàn)，高氮磷比組和低氮磷比組的群體微囊藻含有大量可交換態(tài)活性磷和鐵鋁結(jié)合態(tài)磷，占藻體磷含量的90%以上. 在藻體磷中，低氮磷比時(shí)的可交換態(tài)活性磷含量為0.264 pg/cell，占藻體磷含量的75%以上，且顯著高于高氮磷比時(shí)的可交換態(tài)活性磷含量 (P<0.05). 然而，在高氮磷比組和低氮磷比組的鐵鋁結(jié)合態(tài)磷無(wú)顯著性差異(P>0.05)，含量分別為0.071和0.085 pg/cell. 同時(shí)，氮磷比顯著影響了各形態(tài)磷在藻體胞內(nèi)和胞外的分布模式(表1).

本研究還發(fā)現(xiàn)，可交換態(tài)活性磷為藻體胞外磷的主要組成部分，在低氮磷比時(shí)，其占比顯著升高，這與EPS含量的變化規(guī)律一致(圖3D). 這表明，低氮磷比提升EPS含量，促進(jìn)了藻體對(duì)可交換態(tài)活性磷的吸附和賦存. 然而，藻體胞內(nèi)磷以鐵鋁結(jié)合態(tài)磷為主(表1). 通常，鐵鋁結(jié)合態(tài)磷對(duì)氧化還原電位和pH較敏感[33]. 在氧化還原電位降低(或缺氧)時(shí)，底泥和無(wú)機(jī)顆粒中的鐵鋁結(jié)合態(tài)磷極易釋放[34]. 相比而言，胞內(nèi)鐵鋁結(jié)合態(tài)磷的釋放規(guī)律有所不同，需藻細(xì)胞破裂后才能完全釋放. 此外，藻體鈣結(jié)合態(tài)磷通常處于穩(wěn)定狀態(tài)，在藻類生理代謝或環(huán)境變化時(shí)僅有少部分鈣結(jié)合態(tài)磷轉(zhuǎn)化或釋放[32]，對(duì)藻體磷貢獻(xiàn)較小.

3.2 氮磷比對(duì)藻類光合活性的影響

光合作用是藻類重要的同化過(guò)程，與碳、氮、磷代謝緊密關(guān)聯(lián). 氮濃度直接影響藻細(xì)胞葉綠素a含量[35]. 本研究發(fā)現(xiàn)，微囊藻在低氮磷比時(shí)的葉綠素a含量顯著降低(圖1D). 前人研究表明，盡管反應(yīng)中心葉綠素a含量降低，影響了組裝完整PS II系統(tǒng)的能力和數(shù)量，但并不影響完整光系統(tǒng)的電子傳輸狀態(tài)[36]. Walker等[35]也發(fā)現(xiàn)，葉綠素a含量減少并不會(huì)降低藻類光合效率. 本研究還發(fā)現(xiàn)，氮磷比對(duì)微囊藻Fv/Fm的影響較大(P<0.05)，F(xiàn)v/Fm在低氮磷比組反而較高. 表明在低氮磷比組，藻細(xì)胞光系統(tǒng)II(PS II)的ETo/TRo并未受阻，反而加快了電子傳遞速率，提高了光合效率和糖類合成效率，促使EPS分泌. 這也是低氮磷比組群體微囊藻和斜生柵藻EPS含量增加的原因之一[8, 23].

3.3 氮磷比對(duì)EPS含量及形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

低氮磷比對(duì)斜生柵藻和群體微囊藻EPS含量具有顯著促進(jìn)作用(圖3D)，更多的EPS分泌增加了藻體胞外磷的吸附和儲(chǔ)存，導(dǎo)致其含量增加[37]. 這也可能是低氮磷比抑制了藻細(xì)胞生長(zhǎng)，阻礙了糖類物質(zhì)向其它生物大分子的轉(zhuǎn)化，造成藻細(xì)胞碳元素相對(duì)過(guò)剩[38]，胞內(nèi)過(guò)量的糖類物質(zhì)被分泌至胞外，增加了EPS含量[39]. Huang等[8]發(fā)現(xiàn)，氮限制使微囊藻生長(zhǎng)速率快速下降，糖類向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化過(guò)程受阻，造成胞內(nèi)糖類累積. 然而，由于自身合成和分泌EPS能力較弱，單細(xì)胞微囊藻EPS含量在高氮磷比和低氮磷比組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，這或許是氮磷比對(duì)單細(xì)胞微囊藻胞外磷含量無(wú)顯著影響的原因(圖3B). 相比而言，群體微囊藻的EPS含量均顯著高于單細(xì)胞微囊藻[40]，對(duì)氮磷比的響應(yīng)也更加明顯. 此外，胞外的糖類物質(zhì)在微生物作用下極易腐殖化(humification)[41]，進(jìn)而與金屬陽(yáng)離子和磷酸根離子形成復(fù)合體，提高了EPS對(duì)磷的吸附與賦存能力. 微囊藻分泌的EPS也是附生菌的重要碳源[42]. 雖然自然水體中的藻類與細(xì)菌會(huì)相互粘附[43]，附生菌因此也對(duì)藻體胞外磷總含量有貢獻(xiàn)，但由于本研究中的群體微囊藻胞外磷主要為可交換態(tài)活性磷 (表1)，并且本研究采用了分離純化的群體微囊藻藻株，附生菌數(shù)量相對(duì)較少[10]. 所以，附生菌對(duì)本研究中胞外磷的貢獻(xiàn)比較小.

氮磷比還會(huì)影響群體微囊藻形態(tài)和EPS結(jié)構(gòu). 電子顯微鏡照片顯示，高氮磷比組的群體微囊藻EPS呈膜狀片層，而在低氮磷比組中EPS呈疏松網(wǎng)狀(圖4). 網(wǎng)狀EPS具有更大的比表面積，顯著增加了磷元素的結(jié)合位點(diǎn)和儲(chǔ)存容量. 此外，EPS的主要成分為多糖類和腐殖酸類物質(zhì)，含有較多羧基、羥基等基團(tuán)，與金屬離子結(jié)合后[44]，提升了EPS對(duì)磷的吸附和賦存能力. 例如，金屬陽(yáng)離子能與EPS中的腐殖酸絡(luò)合，進(jìn)而與磷酸根結(jié)合形成“腐殖酸-金屬離子-磷酸根”復(fù)合體[45].

4 結(jié)論

1) 低氮磷比顯著促進(jìn)了群體微囊藻和斜生柵藻EPS分泌，提升了藻體胞外磷含量；2) 氮磷比對(duì)微囊藻和斜生柵藻的胞內(nèi)磷含量無(wú)顯著影響；3) 微囊藻胞內(nèi)磷主要為鐵鋁結(jié)合態(tài)磷，胞外磷主要為可交換態(tài)活性磷，且胞外磷對(duì)藻體磷元素的賦存量與分配模式起關(guān)鍵作用.