混合藻體溶液中藻體濃度檢測(cè)方法優(yōu)化的研究

馮唐鍇++江雪++王炳山++蔡新安++張耀++付金梅

摘 要：文章試圖聯(lián)用分光光度法和干重法，優(yōu)化水中混合藻體生物量的檢測(cè)方法，為自然水域混合藻體生物量監(jiān)控提供有效措施。文章主要研究了混合藻體溶液可見光最大吸收峰值波長(zhǎng)的測(cè)定方法、沉降時(shí)間對(duì)藻體溶液吸光值的影響，以及初步建立了混合藻體溶液“吸光值-干重”相關(guān)性的線性方程。

關(guān)鍵詞：分光光度法；藻體；濃度；干重；吸光值

中圖分類號(hào)：X832 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2017）20-0020-02

前言

大量有害藻體在水中堆積生長(zhǎng)并死亡后，會(huì)產(chǎn)生有害藻毒素、降低水的氧容量、散發(fā)硫化氫等有毒氣體給水體帶來(lái)異味、細(xì)菌大量繁殖、水生動(dòng)植物死亡、甚至產(chǎn)生致癌物危害水體安全[1]。因此，污水中藻體含量的檢測(cè)對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化污染監(jiān)控有重要意義。水體藻類生物量檢測(cè)的基本方法有分光光度法、干重法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等[2]。目前水中藻類生物量檢測(cè)的研究，多使用單一藻類為研究對(duì)象。但天然水體中是混合藻體，因此單一藻類檢測(cè)結(jié)果并不見得適用于自然水體中藻類含量的檢測(cè)。有文章[3]提到使用改良的細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定自然水體中混合藻類的生物量。受此啟發(fā)，本文設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)了分光光度法配合干重法探索溶液中混合藻體生物量的檢測(cè)方法，希望利用這種檢測(cè)方法能夠更加快速便捷的檢測(cè)自然水體中總藻的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 混合藻體溶液的配置

本文所用的含混合藻體的水樣是從景德鎮(zhèn)學(xué)院生物與園林實(shí)訓(xùn)基地的蓄水池中取得的水樣，將該水樣接種至人工藻體培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后經(jīng)過高鹽除蟲、蒸餾水清洗并濃縮富集后，將藻體濃縮液儲(chǔ)藏于5℃冰箱中，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)按需取用。

1.1.2 儀器與設(shè)備

752sp型紫外分光光度計(jì)，GZX-9140 MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，BSA223S型電子天平，SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵、ZD-85恒溫振蕩器、直徑7.0cm定性濾紙，SB-348A曝氣增氧裝置、海爾BCD-186KB型冰箱、HCMJQ-100B型高壓滅菌鍋。布氏漏斗、塑料藻體培養(yǎng)容器、日光燈、蒸餾水及燒杯、試管、玻璃棒等其他實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿。

1.2 方法

1.2.1 混合藻體的取樣、放大培養(yǎng)和濃縮保存

含有混合藻體的水樣取自景德鎮(zhèn)學(xué)院生物與園林實(shí)訓(xùn)基地蓄水池。取500ml水樣接種至10L本課題組人工配置的藻體培養(yǎng)液中，白天自然光輔助日光燈照明，24h曝氣不間斷連續(xù)培養(yǎng)。每周向培養(yǎng)體系中補(bǔ)充人工培養(yǎng)液500ml。每?jī)芍軓呐囵B(yǎng)容器底部收集藻體，并轉(zhuǎn)移至200ml高鹽溶液（近飽和鹽水），常溫（25℃左右）振蕩處理1天，除蟲抑菌。高鹽處理后，抽濾藻體溶液，濾紙上的藻體轉(zhuǎn)入500ml蒸餾水清洗，震蕩2天充分除鹽，再次抽濾后的藻體轉(zhuǎn)至500ml高溫高壓消毒蒸餾水中。多次重復(fù)收集藻體，5℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 吸光值-藻體質(zhì)量相關(guān)性曲線的建立

（1）混合藻體溶液吸收波峰的研究

取少量藻體，在蒸餾水中配制兩種任意濃度的藻體溶液，混勻后直接取樣粗測(cè)不同波長(zhǎng)可見光的吸光值，檢測(cè)波長(zhǎng)分別設(shè)置為420nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm。

結(jié)果顯示樣品在450nm～500nm之間有最大吸收峰值。進(jìn)一步在420nm～520nm處每隔10nm對(duì)樣品溶液進(jìn)行精測(cè)，結(jié)果顯示，混合藻體溶液的可見光吸收峰值在480nm～490nm范圍內(nèi)。

（2）沉降時(shí)間與吸光值的關(guān)系研究

任意配制三種不同濃度的混合藻體溶液，混勻后對(duì)三個(gè)樣品分別測(cè)定吸光值。取2ml溶液置于分光光度計(jì)比色皿中檢測(cè)485nm波長(zhǎng)光吸收，每隔1min測(cè)定一次，記錄吸光值數(shù)據(jù)，作圖分析。

（3）藻體溶液吸光值-藻體干重相關(guān)性曲線的建立

藻體溶液吸光值與其所含藻體干重相關(guān)性的研究分兩步進(jìn)行：

a.取少量混合藻體，晾干后配制成200ml藻體溶液（濃度設(shè)定為C），混勻。取100ml、50ml、25ml、12.5ml藻體溶液，后三份溶液皆定容為100ml，故其濃度分別被稀釋為0.5C，0.25C，0.125C，搖勻，靜置10min。測(cè)定四個(gè)混合藻體溶液樣品的吸光值，作圖分析。

b.按照由少到多的規(guī)律，隨機(jī)取少量濃縮混合藻體，晾干后配制成50ml混合藻體溶液，合計(jì)11個(gè)樣品，分別測(cè)定其吸光值及所含藻體干重，作圖分析。

每個(gè)樣品溶液所含藻體干重的測(cè)定方法：從配置好的50ml藻體溶液中取2ml樣品檢測(cè)吸光值，測(cè)定完畢后將加入比色皿的2ml藻體溶液回收，與其余48ml溶液合并。比色皿中殘留的藻體用蒸餾水沖洗3次，清洗液一并并入原50ml藻體溶液。取一張抽濾濾紙，烘干（于恒溫干燥箱中60℃烘2小時(shí)），盡量去除水分，稱取重量（g1）。利用該濾紙進(jìn)行抽濾。抽濾過程中倒入藻體溶液時(shí)應(yīng)盡量緩慢，溶液接觸濾紙的位置應(yīng)該位于濾紙的中央，盡量防止溶液濺出至濾紙外，降低誤差。將帶有藻體的濾紙自然晾干后，從布氏漏斗中取出，烘干（于恒溫干燥箱中60℃烘2小時(shí)），稱重（g2）。即得藻體干重g=g2-g1。

2 結(jié)果與分析

混合藻體溶液中藻體的生物量與其所含光合色素的量通常會(huì)具有正相關(guān)性，光合色素的量與其吸光值的大小通常也具有正相關(guān)性。因此可利用分光光度計(jì)測(cè)定藻體溶液光合色素（主要為葉綠素a）的光吸收情況，從而間接反應(yīng)溶液中藻體的濃度大小[4、5]。不同藻類細(xì)胞中所含光合色素的種類和數(shù)量不同，不同色素對(duì)不同波長(zhǎng)的光吸收情況不同，因此混合藻體與單一色素甚至單一藻體相比，其對(duì)光吸收的峰值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)肯定都不會(huì)相同。因此，本文首先對(duì)混合藻體溶液的光吸收峰值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)進(jìn)行了研究。

2.1 混合藻體溶液最大吸收峰值對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)位置的研究

2.1.1 粗測(cè)混合藻體溶液最大吸收峰值對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)大小

本文首先對(duì)兩個(gè)不同濃度的藻體溶液樣品在420nm～700nm波段可見光區(qū)的吸光度進(jìn)行了檢測(cè)，測(cè)出每隔50nm波長(zhǎng)間距的混合藻體光吸收情況。根據(jù)該數(shù)據(jù)作混合藻體溶液在不同波長(zhǎng)吸光值的變化趨勢(shì)圖，可以發(fā)現(xiàn)，最強(qiáng)吸收峰在500nm左右。

2.1.2 精測(cè)混合藻體溶液最大吸收峰值對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的大小

根據(jù)粗測(cè)結(jié)果，縮小范圍，在420nm～520nm波段處每隔10nm對(duì)上述兩個(gè)樣品溶液進(jìn)一步精測(cè)并作不同濃度混合藻體溶液在不同波長(zhǎng)的吸光值變化趨勢(shì)圖?？梢园l(fā)現(xiàn)，本研究中兩個(gè)不同濃度混合藻體溶液的最大吸收峰皆位于480nm～490nm之間。但是由于兩個(gè)樣品的濃度有一定區(qū)別，測(cè)定過程中存在誤差，所以兩條曲線的最高峰值并未完全重合。因此，折中選取485nm作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的吸光值檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 沉降時(shí)間與吸光值的關(guān)系

在上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中發(fā)現(xiàn)，對(duì)新配制混勻的藻體溶液立即檢測(cè)吸光值，同一樣品用于多次檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)不同，隨著時(shí)間推移數(shù)據(jù)呈逐漸減小趨勢(shì)。本文據(jù)此配制了三個(gè)不同濃度的混合藻體溶液，測(cè)定其不同沉降時(shí)間條件下485nm處的吸光值并作不同濃度混合藻體溶液在不同沉降時(shí)間測(cè)定的吸光值變化趨勢(shì)圖。我們發(fā)現(xiàn)，三個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示了相似的變化趨勢(shì)，即不同濃度的樣品在前5min每隔1min檢測(cè)，吸光值呈下降趨勢(shì)。但是5min以后，三個(gè)樣品的吸光值先后趨于穩(wěn)定，且不同樣品吸光值大小關(guān)系不隨時(shí)間改變。因此，測(cè)定混合藻體溶液吸光值前，應(yīng)先將配制好的待測(cè)樣品靜置一段時(shí)間，待其溶液達(dá)到平衡狀態(tài)以后，再行檢測(cè)。靜置五分鐘后三個(gè)樣品溶液的吸光值就已趨于穩(wěn)定，但是考慮到隨著藻體濃度進(jìn)一步提高，可能靜置五分鐘仍不夠。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)都選擇在配制混勻混合藻體溶液后靜置10min再開始檢測(cè)。

2.3 混合藻體溶液濃度、藻體干重與吸光值相關(guān)性研究

為了測(cè)定混合藻體溶液藻體生物量與吸光值的關(guān)系，本文選取了不同濃度的樣品，研究混合藻體溶液在485nm處吸光值的變化情況。

2.3.1 混合藻體濃度與其吸光值變化關(guān)系研究

通過測(cè)定某混合藻體溶液（濃度以C表示）及其成倍稀釋溶液（濃度分別為C/2，C/4，C/8）485nm處的吸光值。根據(jù)該數(shù)據(jù)作藻體濃度與吸光值相關(guān)性變化趨勢(shì)圖，可以看出該混合藻體溶液吸光值大小與其濃度成正比線性關(guān)系。

2.3.2 混合藻體溶液吸光值與其所含藻體干重相關(guān)性的研究

本文進(jìn)一步對(duì)11個(gè)不同濃度的混合藻體溶液進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得其藻體溶液485nm吸光值與其所含藻體干重?cái)?shù)據(jù)。根據(jù)該數(shù)據(jù)，做混合藻體溶液吸光值與其藻體干重的相關(guān)性變化趨勢(shì)圖（圖1），并生成回歸直線方程。從圖中可以看出，吸光值與藻體干重也具有正比關(guān)系，所有數(shù)據(jù)皆圍繞回歸直線呈正態(tài)分布。生成的線性方程為：

Y=0.6216X+0.0200，R2=0.9187

其中，Y為吸光值大小，X為溶液中藻體干重，R為y的期望值。

3 結(jié)束語(yǔ)

本文利用分光光度法，建立了一套鑒定水中藻體含量的方法。該方法可在除藻抑藻工作中，作為檢測(cè)除藻抑藻效果的重要方法。但是在研究中存在一些不足，需要改進(jìn)和提高，主要包括以下幾個(gè)方面：

3.1 不同水體需測(cè)定不同的最大可見光吸收峰值波長(zhǎng)

本文測(cè)定的最大吸收峰值波長(zhǎng)適用于本研究樣本來(lái)源的水體，但是不見得適用于其他水體。因此，在測(cè)定不同水體吸光值時(shí)，建議都應(yīng)重新確定其光吸收峰值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)大小。鑒于此，我們還應(yīng)進(jìn)一步研究天然水體與利用該水體接種后人工培養(yǎng)的混合藻體溶液在藻體種類和數(shù)量上是否存在較大差異，這種差異也可能對(duì)“吸光值-藻體干重”回歸直線和方程的建立及應(yīng)用產(chǎn)生一定的影響。

3.2 混合藻體溶液“吸光值-干重”相關(guān)性回歸曲線及方程需要進(jìn)一步完善

本文建立的混合藻體溶液“吸光值-干重”相關(guān)性回歸直線及方程的準(zhǔn)確性和精確度有待進(jìn)一步提高。主要問題在于：（1）測(cè)定藻體干重的方法仍有改進(jìn)空間；（2）取得的有效數(shù)據(jù)數(shù)量較少，因此形成的回歸直線和方程的代表性不足。在今后的研究中，我們將進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)方法，補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以形成更加完善的天然水體混合藻類濃度的檢測(cè)方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]王家玲，李順鵬，黃正.環(huán)境微生物學(xué)[M].第二版.北京：高教出版社，2004：372-382.

[2]黃美玲，何慶，黃建榮，等.小球藻生物量的快速測(cè)定技術(shù)研究[J].河北漁業(yè)，2010，196（4）：1-3.

[3]王瓚，喬俊蓮，王國(guó)強(qiáng)，等.濃縮過濾-超聲振蕩法檢測(cè)水中藻類[J].中國(guó)給水排水，2008，24（14）：86-87.

[4]段剛，劉曉海，高云濤，等.分光光度法測(cè)定滇池藻類生長(zhǎng)的研究[J].化學(xué)與生物工程，2006（23）：4，55-57.

[5]陳晨，馬曉雁，李軍，等.水中典型致臭藻類培養(yǎng)濃度與吸光度、濁度關(guān)系探討[J].四川環(huán)境，2010，29（4）：31-34.