大黃藥材HPLC指紋圖譜及其真?zhèn)舞b別研究

章平平，甘 莉，吳少杰，唐傳球

(漢江師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北十堰 442000)

大黃，在國(guó)內(nèi)和國(guó)外都是常用的中藥材，它是一種蓼科草本植物，品種很多，是一味臨床常用藥材，化學(xué)成分復(fù)雜，主要藥效成分為蒽醌類衍生物，主要包括大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素等34種成分。一般將掌葉大黃、藥用大黃和唐古特大黃這3個(gè)品種稱為正品大黃。正品大黃不含土大黃苷，含番瀉苷，瀉下作用強(qiáng)，而非正品大黃不含番瀉苷，只含土大黃苷，無(wú)瀉下作用或?yàn)a下作用很弱；且有資料顯示土大黃不含或少含大黃酸。

雖然蒽醌類成分并不能作為酸模屬土大黃的專屬性成分，但2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定大黃含5種游離蒽醌的總量不得少于0.2%，而其瀉下的主要活性成分番瀉苷的含量未作要求，此外，雖然大黃中多成分的含量測(cè)定方法均有報(bào)道，有薄層色譜法、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法、高效液相色譜-質(zhì)譜法、高效毛細(xì)管電泳法。目前，在大黃中各種蒽醌類物質(zhì)的定量分析中，常采用配備紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀。相比于比色法、化學(xué)光淬滅法和高效毛細(xì)管電泳色譜法，高效液相色譜法(HPLC)分離效果好、靈敏度高、重復(fù)性好、精確度高，而且設(shè)備的價(jià)格也比較低廉，在中藥的復(fù)雜成分分析中廣泛的應(yīng)用。筆者參照中國(guó)藥典及相關(guān)品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)文獻(xiàn)，以10份來(lái)源不同的大黃飲片為研究對(duì)象，采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對(duì)不同來(lái)源的大黃藥材進(jìn)行研究，建立大黃藥材的指紋圖譜，為大黃的質(zhì)量控制提供有效方法。

1 材料與方法

大黃藥材。10個(gè)樣品采購(gòu)于不同的藥店或網(wǎng)上的店鋪，采購(gòu)品種及地點(diǎn)見表1。

主要儀器。顯微鏡Phemix MC-D500U(C)/TP；ThermoU-3000型高效液相色譜儀(美國(guó)，SR-3000 Slvent Rack真空在線脫氣機(jī)，LPG-3400SDN四元梯度泵，WSP-3000 SLANALYTICAL自動(dòng)進(jìn)樣儀，Tcc-3000SD柱溫箱，VWD-3100二極管陣列檢測(cè)器)。

主要試劑。蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、土大黃苷、大黃對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，購(gòu)自默克公司。

表1 大黃飲片來(lái)源Table 1 Sources of rhubarb drink tablets

性狀鑒別。通過(guò)簡(jiǎn)單的試驗(yàn)器材進(jìn)行判別，主要對(duì)可見的形狀、大小、表面特征、斷層面、氣味、口感等判別來(lái)對(duì)藥材進(jìn)行初步鑒別，達(dá)到區(qū)分中藥材的質(zhì)量和真?zhèn)螁栴}。

顯微鑒別。以S10為檢驗(yàn)樣品為例，取飲片粉碎并過(guò)4號(hào)篩，挑取少量放置在載玻片上，滴加甘油醋酸試液，使得粉末均勻散開，并在酒精燈下微熱1 s左右，緩慢蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下進(jìn)行觀察，觀察大黃藥材導(dǎo)管、淀粉粒、草酸鈣簇晶等內(nèi)部物質(zhì)。取少量上述S10粉末，置于蒸發(fā)皿上，用濾紙覆蓋，采用酒精燈加熱，溫度不要過(guò)高，火焰距離蒸發(fā)皿1 cm左右，避免溫度過(guò)高碳化，加熱1 min左右，可以看到有物質(zhì)附在濾紙上，并進(jìn)行顯微觀察。

薄層色譜檢查。

對(duì)照品溶液配制。精密稱取土大黃苷0.11 mg于10 mL容量瓶，甲醇定容，超聲5 min后，即得。

供試品溶液配制。精密稱取0.1 g左右大黃細(xì)粉(過(guò)4號(hào)篩)，置于錐形瓶中，加甲醇10 mL，超聲提取20 min，濾過(guò)，精密移取1 mL濾液，用甲醇定容到10 mL容量瓶，搖勻即得。

對(duì)照藥材溶液配制。精密稱取0.1 g左右大黃細(xì)粉，置于錐形瓶中，加甲醇10 mL，超聲提取20 min，濾過(guò)，精密移取1 mL濾液，用甲醇定容到10 mL容量瓶，搖勻即得，臨用新制。

薄層層析。吸取S1～S10供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、土大黃苷對(duì)照品溶液各5 L，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄層膜上，以甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸(30∶5∶5∶20∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

大黃含量測(cè)定。

對(duì)照品溶液的制備。在電子分析天平中分別稱取蘆薈大黃素對(duì)照品1.65 mg、大黃酚對(duì)照品1.57 mg、大黃酸對(duì)照品0.79 mg、大黃素對(duì)照品0.86 mg、大黃素甲醚對(duì)照品0.68 mg于5個(gè)10 mL容量瓶中，甲醇溶解并用甲醇定容，超聲5 min后，得到各對(duì)照品溶液。再在5 mL容量瓶?jī)?nèi)分別加入上述各溶液1～5 mL，配制成對(duì)照品混合溶液，其中蘆薈大黃素16.219 g/mL、大黃酚15.605 g/mL、大黃酸15.688 g/mL、大黃素16.512 g/mL和大黃素甲醚8.993 g/mL，保存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

供試品溶液的制備。取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)0.100 0 g，置于50 mL離心管中，然后精確地加入25 mL甲醇，記錄此時(shí)的稱定重量，用記號(hào)筆在離心管液面處畫標(biāo)記線，加熱回流1.5 h(在整個(gè)過(guò)程中，確定該液體是輕微沸騰的)，然后將其移出，待溫度冷卻到在室溫下，稱其重量。按標(biāo)志線加適量甲醇，搖晃使其均勻，然后過(guò)濾，取出濾液，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)，裝入玻璃瓶中，待用。

色譜條件。色譜柱為JADE-PAK KM-C(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min。二極管陣列檢測(cè)器(VWD)，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，按照梯度進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相為甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)，流動(dòng)相比例(0～10 min，5～30% A；10～40 min，30%～60%A；40～60 min，60%A；60～70 min，60%～100% A；70～75 min，100% A；75～76 min，100%～5% A；76～87 min，5% A)。

線性關(guān)系考察。按“...”色譜分析條件，精密吸取“...”對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度(，μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積()為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

精密度試驗(yàn)。精密吸取S1號(hào)土大黃供試品溶液10 μL，按“...”色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，并計(jì)算其RSD。

穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取S1號(hào)土大黃供試品溶液10 μL，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時(shí)按“...”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，并計(jì)算其RSD值。

重復(fù)性試驗(yàn)。按“...”方法制備供試品溶液6份(樣品批號(hào)為S1)，按“...”色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均含量和RSD。

含量測(cè)定。該試驗(yàn)對(duì)不同批次大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5個(gè)游離型蒽醌類成分含量進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

性狀鑒定結(jié)果如圖1所示，通過(guò)對(duì)10份大黃的鑒別發(fā)現(xiàn)，大黃在表面顏色、有無(wú)星點(diǎn)及氣味強(qiáng)弱等方面均具有一定差異。掌葉大黃和藥用大黃表面呈現(xiàn)黃棕色至紅棕色，斷面呈淡紅棕色或黃棕色，根莖髓部有星點(diǎn)、具清香氣味；土大黃表面顏色較深，多為黃灰色、棕灰色或棕褐色，斷面無(wú)星點(diǎn)，香氣微弱。

顯微鑒別是當(dāng)前對(duì)中藥材最經(jīng)濟(jì)有效的鑒別方法之一，采用簡(jiǎn)單的顯微儀器設(shè)備，對(duì)藥材的外觀及內(nèi)部的細(xì)胞形態(tài)特征等結(jié)構(gòu)進(jìn)行判別，此檢驗(yàn)過(guò)程快速高效，結(jié)果準(zhǔn)確性高于性狀鑒別，能有效地減少儀器設(shè)備的使用與成本。

采用顯微鑒別可以有效地看到大黃細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)且具有特征性的物質(zhì)。圖2顯示的是以S10樣品為例的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可以明顯地看到大黃的導(dǎo)管、淀粉粒、草酸鈣簇晶以及羽狀的蒸發(fā)晶體，其草酸鈣簇晶少見，棱角短鈍，網(wǎng)紋導(dǎo)管、螺紋導(dǎo)管非木化，糊粉粒甚多，與《中國(guó)藥典》鑒別一欄檢測(cè)要求符合。

按照上述方法，依次鏡檢S1～S9供試品，相比較S10，在導(dǎo)管、淀粉粒、草酸鈣簇晶、羽狀的蒸發(fā)晶體4個(gè)特征上無(wú)明顯差異。

圖1 10個(gè)批次大黃樣品外表面及其斷面Fig.1 External surface and cross section of 10 batches of rhubarb samples

注：a.草酸鈣簇晶；b.螺紋導(dǎo)管；c.淀粉粒；d.升華結(jié)晶 Note：a.Calcium oxalate clusters；b.Threaded conduits；c.Starch grains；d.Sublimation crystals圖2 掌葉大黃S10樣品的顯微鑒別Fig.2 Microscopic identification of S10 sample of Rheum palmatum

從圖3可以看出，土大黃苷有非常清晰的藍(lán)紫色熒光，藥用大黃S4和掌葉大黃S5～S10供試品在相應(yīng)位置無(wú)斑點(diǎn)和吸收峰，表明這7個(gè)樣品未含有土大黃苷，符合大黃鑒別的要求，為正品大黃。而土大黃S1S3供試品在相應(yīng)位置有明顯的斑點(diǎn)和吸收峰，為偽品大黃。該方法可操作性強(qiáng)，能夠達(dá)到快速檢識(shí)的目的。

圖3 S1～S10樣品的聚酰胺薄層色譜檢查Fig.3 Polyamide thin layer chromatography detection of S1-S10 samples

線性關(guān)系考察。按“...”方法操作，以進(jìn)樣濃度(，μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積()為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 5種化合物的線性關(guān)系Table 2 Linear relationship of five compounds

精密度試驗(yàn)。按“...”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積RSD分別為0.2%、0.4%、0.5%、0.2%、0.3%，說(shuō)明該儀器的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“...”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積RSD分別為0.2%、0.3%、0.5%、0.2%、0.5%，表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)。按“...”方法操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積RSD分別為3.8%、2.6%、3.7%、3.7%、3.7%，說(shuō)明該試驗(yàn)的重復(fù)性良好。

以上結(jié)果表明各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積基本一致，相似度均大于0.95，符合指紋圖譜的要求。

含量測(cè)定。2020版《中國(guó)藥典》以5種蒽醌類成分作為含量測(cè)定指標(biāo)成分，規(guī)定大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸和蘆薈大黃素的總量不得低于0.2%。該研究對(duì)5種游離蒽醌類含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表3。從表3可以看出，10個(gè)大黃樣品游離蒽醌的總量均符合2020版《中國(guó)藥典》限量要求，偽品華北大黃S1～S3這3個(gè)批次樣品中游離蒽醌總量為1.49%～2.02%，藥用大黃S4批次樣品中游離蒽醌總量為1.21%，掌葉大黃S5～S10這6個(gè)批次樣品中游離蒽醌總量為1.21%～2.63%。各批次大黃中，含量比較高的成分是大黃素甲醚和大黃素，含量較少的是大黃酚和蘆薈大黃素，但大黃酸10個(gè)樣品各有不同。3個(gè)土大黃藥材(S1～S3)中大黃酸含量極低，不及掌葉大黃(S5～S10)與藥用大黃(S4)的含量的1/10；藥用大黃中大黃酸含量較高，而6個(gè)掌葉大黃藥材中大黃酸含量視產(chǎn)地有較大的差異。

表3 不同批次大黃中5種蒽醌類化合物的含量Table 3 HPLC content determination statistics for 5 components of rhubarb

從圖4可以看出，在相同的檢測(cè)方法下，S1～S3土大黃供試品，相對(duì)于藥用大黃S4和掌葉大黃S5～S10，在50 min前有明顯的區(qū)別，含有大量的活性物質(zhì)。而藥用大黃和掌葉大黃的指紋圖譜相似性高，50～75 min 的色譜峰峰形及相對(duì)比例較穩(wěn)定，且有5個(gè)共有色譜峰，分別為蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚，體現(xiàn)了正品大黃的共同特征。HPLC法簡(jiǎn)便、時(shí)間短、重現(xiàn)性好，專屬性、耐用性強(qiáng)，得到的圖譜質(zhì)量高，可為大黃鑒別標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié)論與討論

注：1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚 Note：1.Aloe emodin；2.Chrysophanic acid；3.Rheum emodin；4.Chrysophanol；5.Emodin monomethyl ether圖4 10批次大黃HPLC指紋測(cè)定色譜圖Fig.4 HPLC fingerprint chromatogram of 10 batches of rhubarb samples

大黃為常用的普通中藥，摻雜及市場(chǎng)上的大黃種類繁多。該研究從不同產(chǎn)地收集、測(cè)定了10份來(lái)自不同藥廠或中藥店鋪飲片，分別為常見的掌葉大黃、藥用大黃和土大黃，通過(guò)RP-HPLC含量檢測(cè)及指紋圖譜建立，反映了大黃藥材的內(nèi)含物質(zhì)間存在差異。《中國(guó)藥典》收錄的掌葉大黃與藥用大黃的相似性高，而與土大黃的相似性不佳，網(wǎng)上銷售的大黃普遍存在使用不符合國(guó)家《中國(guó)藥典》規(guī)范的中藥進(jìn)行銷售，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)網(wǎng)上的藥材管理，有利于中藥市場(chǎng)的把控與發(fā)展。同時(shí)對(duì)控制土大黃藥材的質(zhì)量、保證臨床用藥、建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了一定依據(jù)。