鞣花酸通過轉(zhuǎn)化生長因子-β/絲/蘇氨酸激酶受體通路對心肌梗死大鼠心肌纖維化的改善作用

鄒琳，張昕，李麗

心肌梗死后左心室重構(gòu)是心力衰竭（心衰）的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是左心室大小、形狀、功能、細胞和分子組成等復(fù)雜的短期和長期病理生理變化，這一進程主要依賴于炎癥反應(yīng)和心肌纖維化[1]。心肌纖維化是受損的正常心肌組織被纖維化組織替代，喪失其正常的結(jié)構(gòu)、功能的病理性進程，與膠原蛋白等心肌細胞外基質(zhì)的過度沉積有關(guān)，是獨立于射血分數(shù)之外的心衰患者死亡的重要因素之一。心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展由多種細胞因子介導(dǎo)的多條信號通路參與，其中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β/絲/蘇氨酸激酶受體（Smad）通路是啟動心肌纖維化的核心通路[2]。通過抑制TGF-β/Smad 通路改善心肌纖維化水平，對治療心肌梗死后纖維化具有重要的研究及臨床意義。

鞣花酸是一種分子量為302.28 的多酚類化合物，其分子式為C14H6O8，廣泛存在于石榴等漿果與各類干果中，具有抗炎、抗氧化與抗癌作用。有研究表明，鞣花酸可通過抑制Wingless/Integrated（Wnt）信號通路減輕博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[3]。同時研究表明，鞣花酸可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad 通路誘導(dǎo)人結(jié)直腸腺癌細胞（HCT-116）周期阻滯和凋亡[4]。此外鞣花酸還被證實為傳統(tǒng)蒙藥冠心舒通膠囊的有效成分之一[5]，而冠心舒通膠囊的抗心肌纖維化作用與其拮抗TGF-β/Smad 通路有關(guān)[6]。因此推測鞣花酸也可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad 通路改善心肌梗死大鼠心肌纖維化。本實驗擬采用開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立大鼠心肌梗死模型，觀察鞣花酸是否可通過抑制TGF-β/Smad 通路減輕心肌纖維化程度，改善心臟功能。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：80 只SD 雄性大鼠，SPF 級，體質(zhì)量均為200～220 g，購于內(nèi)蒙古大學實驗動物研究中心，動物許可證號：SCXK（蒙）2016-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始實驗。

主要藥物及試劑：鞣花酸（純度≥98%，貨號：E808704，購自上海麥克林生化科技有限公司）；吡非尼酮（購自北京康蒂尼藥業(yè)有限公司）；白細胞介素（IL）-6（貨號：CK-E30219）、Ⅰ型膠原蛋白α2（COL1α2，貨號：CK-E31131）、Ⅲ型膠原蛋白α1（COL3α1，貨號：CK-E37320）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自上海機純實業(yè)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號：PICPI23223，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司）；蛋白預(yù)染Marker（貨號：SM1811，購自美國Fermentas 公司）；TGF-β1（貨號：Ab215715）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，貨號：Ab9485）抗體均購自美國 Abcam 公司；Smad2（貨號：#5339）、Smad3（貨號：#9523）抗體均購自美國CST 公司；引物由上海信帆生物科技有限公司合成；SYBR Green PCR 試劑盒（貨號：#K0223，購自美國Thermo Fisher Scientific公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：#K1622，購自美國Fermentas 公司）。

儀器：mini protean 3 cell 型電泳儀（購自美國BIO-RAD 公司）；TE77XP 型電轉(zhuǎn)儀（購自美國HOEFER 公司）；MK3 型酶標儀（購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；Vivid E9 型心動超聲儀器（購自美國 GE 公司）；Real-time 檢測儀（購自美國ABI公司）。

1.2 分組、建模及給藥

通過結(jié)扎大鼠心臟冠狀動脈左前降支建立心肌梗死模型。取雄性SD 大鼠80 只，按隨機數(shù)表法挑選20 只作為假手術(shù)組，其余60 只建模。大鼠術(shù)前禁食水12 h，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（注射劑量0.4g/kg）。麻醉后固定于手術(shù)臺上，連接心電圖儀器，備皮、消毒、經(jīng)喉氣管插管，連接小動物呼吸機，調(diào)整呼吸機數(shù)值。開胸，于左心耳和肺動脈圓錐間用6 號手術(shù)線結(jié)扎冠狀動脈左前降支，假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。當結(jié)扎完大鼠體表心電圖Ⅱ?qū)?lián) ST段抬高≥0.1 mV 即表示冠狀動脈結(jié)扎成功。抽出大鼠胸腔內(nèi)氣體，用3 號線縫合肋間隙等組織層，術(shù)后腹腔注射青霉素5 萬U/d 預(yù)防感染。建模后假手術(shù)組全部存活，其余60 只建模后存活47 只，13 只均于結(jié)扎后24 h 內(nèi)死亡。各組大鼠術(shù)后正常給予食水，成模大鼠按隨機數(shù)表法分為3 組：心肌梗死模型組（n=15）、吡非尼酮組（n=16）、鞣花酸組（n=16）。稱取300 mg 吡非尼酮和20 mg 鞣花酸，融入5 ml超純水中，造模4 d 后吡非尼酮組按照300 mg/kg 吡非尼酮，鞣花酸組按照20 mg/kg 鞣花酸，灌胃給藥，每日1 次，其余兩組給予等量超純水灌胃，共4 周。

1.3 大鼠心臟多普勒超聲檢測

大鼠末次給藥12 h 后，10%水合氯醛0.4g/kg腹腔注射麻醉。麻醉后固定、備皮，采用心臟多普勒超聲檢測大鼠左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室射血分數(shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（FS）。每只大鼠測8個心動周期，取平均值。操作和分析由心功能科?？漆t(yī)師完成。

1.4 大鼠心肌組織處理

處死大鼠，剪下心臟，生理鹽水灌洗心腔，洗凈心腔內(nèi)殘余血液，將結(jié)扎處以下心室壁從心底到心尖切為三等份，分別用于ELISA、蛋白免疫印跡（Western blot）、實時熒光定量PCR（qPCR）檢測。將處理好的心肌組織置于-80℃保存。

1.5 ELISA 檢測IL-6、COL1α2、COL3α1

取一部分凍存的心肌組織移入玻璃勻漿器，每1 g 心肌組織加入 5 ml（pH=7.4，濃度為10 mM）的磷酸緩沖鹽溶液（PBS），置于冰上充分研磨，勻漿液5000 rpm/min，離心5 min，收集上清液。參考文獻[7]步驟，使用ELISA 試劑盒檢測大鼠心肌組織中IL-6、COL1α2、COL3α1 水平。每組取10 個樣本進行實驗。

1.6 Western blot 法檢測心肌組織中TGF-β、Smad2、Smad3 蛋白水平

取-80℃保存的心肌組織，置于冰上研磨，加入裂解液。裂解后的樣品4℃ 12 000 rpm/min，離心15 min，取上清進行BCA 蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果取所需蛋白加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min后離心取上清上樣。10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-多聚酰胺凝膠電泳分離，半干式轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入特異性一抗TGF-β1、Smad2、Smad3（稀釋倍數(shù)均為1:1000），和膜室溫孵育2 h；孵育一抗的膜用TBST 緩沖液洗滌3 次，每次5min，隨后1:1000 稀釋HRP 標記的二抗，與膜37℃孵育1 h，用TBST 洗滌3 次，每次5 min。條帶用發(fā)光液發(fā)光，照片用Gel-Pro Analyzer 4.0 軟件分析。每組取4 個樣本進行實驗。

1.7 qPCR 法檢測心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達水平

取適量大鼠心肌組織，提取組織總RNA。將提取的總RNA 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，進行PCR 實驗。按照試劑盒說明書進行實驗，采集熒光信號40 個循環(huán)。目的基因TGF-β1正向引物5' GGACTACTACGCCAAAGAAG 3'，反向引物5' TGTTGCTCCACAGTTGAC 3'；目的基因Smad 2 正向引物5' TCCATCTTGCCATTCACTC 3'，反向引物 5' TCCTGTCCATTCTGTTCTC 3'；目的基因Smad 3正向引物5' TTCACCCTGGGATGTAAG 3'，反向引物5' GGCTCCTCATTTCACAAC 3'；內(nèi) 參GAPDH 正 向引物 5' GTCGGTGTGAACGGATTTG 3'，反向引物 5'TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3'。目的基因的相對表達水平用2-△△CT表示。每組取3 個樣本進行實驗。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示；多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠心臟彩色多普勒超聲檢測結(jié)果（表1）

表1 四組大鼠心臟彩色多普勒超聲檢測結(jié)果（）

表1 四組大鼠心臟彩色多普勒超聲檢測結(jié)果（）

注：LVEDD：左心室舒張末期內(nèi)徑；LVESD：左心室收縮末期內(nèi)徑；LVEF：左心室射血分數(shù)；FS：左心室短軸縮短率。與假手術(shù)組比較*P＜0.05，與心肌梗死模型組比較△P＜0.05

與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠LVEDD、LVESD 均顯著增大（P均＜0.05），LVEF、FS 均顯著降低（P均＜0.05）。與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組和鞣花酸組大鼠的LVEDD、LVESD均顯著縮?。≒均＜0.05），LVEF、FS 均顯著升高（P均＜0.05）。鞣花酸組與吡非尼酮組的LVEDD（P=0.636）、LVESD（P=0.917）、LVEF（P=0.872）、FS（P=0.710）差異均無統(tǒng)計學意義。

2.2 四組大鼠ELISA 檢測結(jié)果（表2）

表2 ELISA 法檢測四組大鼠心肌組織IL-6、COL1α2、COL3α1 水平（，n=10）

表2 ELISA 法檢測四組大鼠心肌組織IL-6、COL1α2、COL3α1 水平（，n=10）

注：ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗；IL-6：白細胞介素-6，COL1α2：Ⅰ型膠原蛋白α2；COL3α1：Ⅲ型膠原蛋白α1。與假手術(shù)組比較 *P＜0.05，與心肌梗死模型組比較△P＜0.05

與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠心肌組織IL-6、COL1α2、COL3α1 水平均明顯降低（P均＜0.05）。與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組和鞣花酸組大鼠心肌組織IL-6、COL1α2、COL3α1 水平均明顯升高（P均＜0.05）。鞣花酸組與吡非尼酮組的大鼠心肌組織IL-6（P=0.482）、COL1α2（P=0.994）、COL3α1（P=0.814）水平差異均無統(tǒng)計學意義。

2.3 四組大鼠qPCR 檢測結(jié)果（圖1）

圖1 實時熒光定量PCR 檢測四組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達水平

分析四組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達情況，得到TGF-β1（F=127.124）、Smad2（F=284.247）、Smad3（F=103.582），差異有統(tǒng)計學意義。與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 水平均明顯升高（P均＜0.05）。與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組和鞣花酸組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 水平均明顯降低（P均＜0.05）。鞣花酸組與吡非尼酮組的大鼠心肌組織中TGF-β1（P=0.132）、Smad2（P=0.077）、Smad3（P=0.769）mRNA 水平差異均無統(tǒng)計學意義。

2.4 Western blot 檢測結(jié)果（圖2）

圖2 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測四組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平（n=4）

分析各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平情況，得到TGF-β1（F=107.624）、Smad2（F=353.296）、Smad3（F=74.287），差異有統(tǒng)計學意義。與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平

均明顯升高（P均＜0.05）。與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組和鞣花酸組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白水平均明顯降低（P均＜0.05）。鞣花酸組與吡非尼酮組的大鼠心肌組織中TGF-β1（P=0.094）、Smad2（P=0.646）、Smad3（P=0.084）蛋白水平差異均無統(tǒng)計學意義。

3 討論

鞣花酸是一種廣泛存在于各種軟果、堅果等植物組織中的多酚二內(nèi)酯，是沒食子酸的二聚衍生物。大量研究表明，鞣花酸具有抑制炎性反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激的作用[8-9]。此外研究表明[10]，鞣花酸可以抑制糖尿病大鼠心肌纖維化與心室重構(gòu)，改善其心臟功能。本研究通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈制備心肌梗死模型，以探討鞣花酸改善心肌纖維化的作用與機制。

結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支可模擬臨床急性心肌梗死患者的病理生理進程，引起左心室心肌細胞凋亡及瘢痕形成，在心肌梗死早期即表現(xiàn)為心臟收縮與舒張功能障礙，通過多個細胞通路激活心室重塑進程，被廣泛應(yīng)用于建立心肌纖維化的模型。本研究通過心臟多普勒超聲檢測大鼠心臟功能，結(jié)果顯示結(jié)扎冠狀動脈左前降支后，大鼠左心室腔擴大，LVEF 和FS 明顯降低。與心肌梗死模型組相比，鞣花酸組大鼠左心室腔明顯縮小，LVEF 和FS明顯升高。提示應(yīng)用鞣花酸可改善心肌梗死大鼠的心臟功能。

心肌纖維化是應(yīng)激、損傷或老化等多種因素引起心臟瘢痕形成的生理病理進程，其特征是心臟成纖維細胞的異常增殖活化，在心肌中沉積過量的膠原基質(zhì)。Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白（Col1、Col3）是參與心肌纖維化主要細胞外基質(zhì)蛋白。在生理狀態(tài)下，心肌成纖維細胞不斷合成細胞外基質(zhì)，使其分泌與分解處于動態(tài)平衡狀態(tài)，以維持正常的心臟環(huán)境。當心肌梗死發(fā)生后，心臟成纖維細胞異常增殖活化以抵抗心肌細胞凋亡，并使膠原纖維大量分泌，合成大于分解，形成心肌纖維化[11]。本研究ELISA 結(jié)果提示，與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠心肌組織中COL1α2、COL3α1 水平明顯增高；與心肌梗死模型組相比較，鞣花酸組大鼠心肌組織中COL1α2、COL3α1 水平明顯降低。提示應(yīng)用鞣花酸可以減輕心肌梗死后的心肌纖維化進程。

IL 是重要的炎性細胞因子，在心肌纖維化的進程中扮演重要角色。有研究表明，敲除IL-6 基因可明顯降低心肌病小鼠的心肌纖維化程度[12]。本研究ELISA 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠血清中IL-6 水平明顯增高；與心肌梗死模型組相比較，鞣花酸組大鼠血清中IL-6 水平明顯降低。提示鞣花酸減輕心肌梗死后心肌纖維化進程與其抗炎作用有關(guān)。

TGF-β/Smad 通路是調(diào)控心肌纖維化進程的關(guān)鍵性信號通路。TGF-β/Smad 信號通路參與心室重構(gòu)與炎癥、心肌細胞凋亡、心肌肥厚、心肌纖維化等多種進程有關(guān)[13]。研究表明，敲除心肌成纖維細胞TGF-β 受體1/2 可以抑制心肌纖維化進程[14]。此外，敲除Smad3 也可以抑制糖尿病心肌病小鼠心肌纖維化進程，同時減輕其心肌病理性肥厚和炎癥反應(yīng)[15]。另外TGF-β1 與Smad3 蛋白水平的下調(diào)可減輕慢性心衰兔模型的心肌纖維化程度，減少心肌細胞的凋亡[16]。本研究Western blot 和qPCR 實驗結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，心肌梗死模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白和mRNA 表達均明顯升高；與心肌梗死模型組相比較，鞣花酸組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白和mRNA 表達均明顯降低。提示鞣花酸改善心肌纖維化與抑制TGF-β/Smad 信號通路相關(guān)。

吡非尼酮可以降低TGF-βmRNA 水平，抑制TGF-β 蛋白的分泌，是經(jīng)典的TGF-β/Smad 信號通路抑制劑[17]。一項臨床實驗表明，吡非尼酮可改善心衰患者的心肌纖維化[18]。本實驗ELISA 結(jié)果顯示，與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組大鼠心肌組織中COL1α2、COL3α1、IL-6 水平均明顯降低，與鞣花酸組相比，吡非尼酮組大鼠心肌組織中COL1α2、COL3α1、IL-6 水平無明顯差異。本實驗Western blot 和qPCR 實驗結(jié)果表明，與心肌梗死模型組相比，吡非尼酮組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白和mRNA 表達均明顯降低；鞣花酸組與吡非尼酮組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白和mRNA 表達均無明顯差異。提示TGF-β/Smad 信號通路參與了心肌梗死后心肌纖維化進程，且在本實驗劑量下鞣花酸與吡非尼酮在調(diào)控TGF-β/Smad 信號通路，改善心臟功能，抑制心肌纖維化的作用無明顯差異。

鞣花酸是多個中藥有效成分之一，在安全性上有其獨特的優(yōu)勢，現(xiàn)階段常作為藥品、保健食品的添加成分。綜上所述，鞣花酸可通過抑制TGF-β/Smad 信號通路，減輕炎癥反應(yīng)，改善心肌纖維化治療心肌梗死，改善心臟功能。為鞣花酸在臨床上的應(yīng)用提出了一定的理論依據(jù)與研究方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突