耐鹽菌的篩選鑒定及其降解性能分析

孫 晴， 陳 平， 李再興， 陳曉飛， 張婉玉， 邢 茜， 祁浩杰

（1.天俱時(shí)工程科技集團(tuán)有限公司， 河北 石家莊 050000；2.河北科技大學(xué)， 河北 石家莊 050091)

0 引言

隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程快速推進(jìn)， 廢水造成的污染也日益嚴(yán)峻[1]。 其中高鹽廢水占廢水總排放量的5%以上，并且以每年2%的速度快速上升[2]。 高鹽廢水是指總鹽(以NaCl 計(jì))質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于或等于1%的廢水，其可使水體富營(yíng)養(yǎng)化和土地鹽堿化。此類廢水主要來(lái)源于石油、造紙、印染、化工、制藥、食品加工等生產(chǎn)領(lǐng)域， 其中含有大量有機(jī)污染物和高濃度無(wú)機(jī)鹽[3-5]。 高鹽、高濃度廢水成分復(fù)雜、毒性大、難降解，其治理方法是制約工業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題[6]。

目前， 處理高鹽度廢水方法主要包括電化學(xué)氧化法、離子交換法、膜分離法、加熱蒸發(fā)法和生物處理法[7-9]?；瘜W(xué)法和物理法有一定的局限性，如運(yùn)行成本高，處理效果有限，通常只在特定條件下應(yīng)用，無(wú)法大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用；生物處理法無(wú)需提前除鹽，也無(wú)需稀釋進(jìn)水，可直接用于含鹽廢水的處理。該方法可減少前期的資金投入和后期的運(yùn)營(yíng)成本， 而且無(wú)二次污染、節(jié)約水資源，是處理廢水的首選方法，也是近年來(lái)的環(huán)保熱點(diǎn)[10-11]。但鹽度過(guò)高容易破壞微生物細(xì)胞和胞內(nèi)生物酶，抑制微生物的生長(zhǎng)和代謝，無(wú)法達(dá)到理想的降解效果[12]。 因此，有研究人員將耐鹽菌投加到活性污泥中或者生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行應(yīng)用。李坤等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在MBBR 中接入耐鹽菌劑，不僅提高了COD 去除率， 生物膜處理體系也更加穩(wěn)定，能夠抵抗較高鹽度范圍波動(dòng)。 代鵬飛等[14]將優(yōu)勢(shì)菌投加到SBR 中發(fā)現(xiàn)，COD 平均去除率為72.8%，比未投加微生物組提高了22%。 廖焰焰等[15]從處理醫(yī)藥廢水的活性污泥中馴化、 分離出一株高耐鹽菌株發(fā)現(xiàn)，該菌株可處理高鹽醫(yī)藥廢水，CODcr 去除率可達(dá)73.0%。由上可知，耐鹽菌的加入可改善鹽度對(duì)微生物的抑制作用， 大幅提升高鹽廢水中有機(jī)污染物的降解效率。 高效耐鹽菌在高鹽廢水處理中具有巨大的應(yīng)用潛力[16]。

從某制藥廠二沉池中取出活性污泥，通過(guò)馴化、分離得到3 株耐鹽菌，最終篩選出一株高耐鹽菌。對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、 生理生化特性和16S rDNA 分析進(jìn)行菌株鑒定， 研究不同環(huán)境因素對(duì)菌株降解性能的影響，并在實(shí)際高鹽廢水中進(jìn)行應(yīng)用驗(yàn)證，以期為生物法處理難降解高鹽廢水提供高效菌種資源和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基、全培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基均參照文獻(xiàn)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[17]。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于細(xì)菌培養(yǎng)；全培養(yǎng)基用于細(xì)菌富集；選擇性培養(yǎng)基用于細(xì)菌性能測(cè)定。

1.2 菌株篩選

馴化：實(shí)驗(yàn)搭建反應(yīng)器模擬MBBR 工藝，模擬廢水中（m(C)∶m(N)∶m(P)=100 ∶5 ∶1）底部曝氣好氧運(yùn)行。根據(jù)COD 去除率和馴化情況逐步提高鹽濃度， 培養(yǎng)至填料掛膜情況良好， 鏡檢可見明顯菌膠團(tuán)，即得到定向馴化的耐鹽菌群[18-20]。

篩選：用混勻器處理馴化后的污泥液，取上清液稀釋后涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，在溫度為30 ℃下培養(yǎng)至有明顯菌落。 挑取不同單菌落多次劃線培養(yǎng)至得到純化細(xì)菌。 梯度配制NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 ～15%的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將純化菌株制成菌懸液，稀釋至合適倍數(shù)后涂布。 在30 ℃恒溫下培養(yǎng)72 h，用菌落數(shù)量表示菌株生長(zhǎng)情況[21]。

1.3 菌株鑒定

（1）菌株形態(tài)特征和生理生化特性。將菌株接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其菌落特征和菌體形態(tài)。參照《微生物技術(shù)》進(jìn)行生理生化特性實(shí)驗(yàn)[21]。

（2）菌株16s rDNA 基因序列分析。用DNA 試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。 使用16S rDNA 通用引物進(jìn) 行 PCR 擴(kuò)增。 擴(kuò)增引物為27F （5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3） 和 1492R （5 -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3）， 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL。將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海派森諾基因科技有限公司完成16S rDNA 序列測(cè)定[22]。

1.4 菌株生長(zhǎng)特性研究

為探究環(huán)境因素對(duì)復(fù)篩菌株的影響， 按照將菌懸液稀釋至108 CFU/mL 接入選擇性培養(yǎng)基， 分別設(shè)置好溫度、pH 值、接種量和鹽度梯度，在恒溫培養(yǎng)振蕩器以轉(zhuǎn)速為190 r/min 培養(yǎng)72 h，每24 h 取樣1次，分別測(cè)定OD600值和COD 濃度[23]。并在最適宜單因素條件下，測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)趨勢(shì)[17]。

1.5 菌株降解高鹽廢水的實(shí)際應(yīng)用

從細(xì)菌斜面上挑取一環(huán)菌苔接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，200 r/min 搖床培養(yǎng)過(guò)夜。 將得到的培養(yǎng)液，稀釋至合適的接種濃度（108 CFU/mL）轉(zhuǎn)接到全培養(yǎng)基中。 180 r/min 搖床培養(yǎng)24 h 得到放大培養(yǎng)的菌液。

菌株降解高鹽廢水實(shí)驗(yàn)裝置示意見圖1。由圖1可以看出，該裝置采用有機(jī)玻璃反應(yīng)器，有效容積為3 L。 首先將某制藥廠一車間和二車間的高鹽廢水分別加入1 號(hào)、2 號(hào)反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)pH 值至設(shè)定值，開啟曝氣泵，將DO 質(zhì)量濃度控制在4 ～5 mg/L。 再將體積分?jǐn)?shù)為5%菌液接入1 號(hào)、2 號(hào)反應(yīng)器中， 每隔24 h 測(cè)定1 次COD 值。 同時(shí)，以普通活性污泥處理一車間和二車間的高鹽廢水作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在3 號(hào)、4 號(hào)反應(yīng)器中進(jìn)行。

圖1 降解高鹽廢水實(shí)驗(yàn)裝置示意

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

污泥馴化啟動(dòng)初期， 測(cè)得NaCl 質(zhì)量濃度為4 224 mg/L，COD 質(zhì)量濃度為800 mg/L。 運(yùn)行60 d后，NaCl 質(zhì)量濃度達(dá)到40 000 mg/L，進(jìn)水COD 質(zhì)量濃度為2 000 mg/L，去除率穩(wěn)定在82.5%以上。 填料掛膜情況良好，鏡檢菌膠團(tuán)明顯，得到定向馴化的耐鹽菌群。

經(jīng)過(guò)分離純化得到3 株細(xì)菌，分別命名為M01，M02，M03。耐鹽性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1 可以看出，菌株M02 在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 ～12%的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，說(shuō)明該菌株具有耐高鹽能力，對(duì)鹽度有較寬的耐受范圍。 微生物的耐鹽能力是決定其在高鹽廢水中存活與繁殖的決定性因素，

表1 耐鹽性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果%

2.2 菌株鑒定

（1）菌株形態(tài)特征和生理生化特性。 菌株M02的形態(tài)特征見圖2。 由圖2 可以看出，M02 菌落呈圓形邊緣完整，表面有光澤、光滑、濕潤(rùn)、易挑起，不透明，呈白色，側(cè)面觀察為扁平狀，48 h 內(nèi)菌落直徑為1.67 ～1.90 mm。 在1 000 倍顯微鏡下觀察菌體形態(tài)呈短棒狀，兩端較圓滑，大小約為（2 ～4）μm× （3 ～6）μm。

圖2 菌株M02 的形態(tài)特征

菌株M02 生理生化特性見表2。

表2 菌株M02 的生理生化特性

（2）菌株16S rDNA 測(cè)序。菌株M02 PCR 電泳圖像見圖3。

圖3 PCR 產(chǎn)物電泳圖像

將測(cè)序得到的序列結(jié)果用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。 由圖4 可以看出，M02 核苷酸序列與Stenotrophomonas pavanii 的同源性達(dá)到98%，2種菌株親緣關(guān)系接近。 但本菌株的形態(tài)學(xué)特征和理化性質(zhì)與已經(jīng)報(bào)道的Stenotrophomonas pavanii 存在一定差異[24]，故鑒定為Stenotrophomonas pavanii 屬的一株潛在新菌， 命名為Stenotrophomonas pavanii M02， 于2021年7月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏編號(hào)為CGMCC No.22898。

圖4 菌株M02 的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株生長(zhǎng)特性研究

溫度對(duì)菌株M02 影響情況見圖5。 由圖5 可以看出，當(dāng)培養(yǎng)溫度為10 ℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)緩慢。隨著溫度升高， 菌株生長(zhǎng)繁殖速度迅速提升，COD 去除率隨之升高； 當(dāng)溫度升至30 ℃時(shí)， 細(xì)菌增長(zhǎng)量最大，COD 最終去除率可達(dá)90.9%；當(dāng)溫度繼續(xù)升至40 ℃時(shí)， 細(xì)菌生長(zhǎng)速度明顯減緩，COD 最終去除率也降至63.3%。 說(shuō)明溫度可顯著影響細(xì)菌的合成代謝，當(dāng)溫度低時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)和生化反應(yīng)速率變慢。 溫度每升高10 ℃，生化反應(yīng)速率增加一倍[25]。 但溫度不可能無(wú)限升高， 因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)對(duì)溫度極為敏感，過(guò)高溫度將造成不可逆破壞，致使細(xì)菌死亡。 因此，確定菌株最適宜生長(zhǎng)溫度為30 ℃。

圖5 溫度對(duì)菌株M02 的影響

pH 值對(duì)菌株M02 影響情況見圖6。由圖6 可以看出，在偏酸性環(huán)境內(nèi)細(xì)菌增量較低；在中性偏堿性環(huán)境內(nèi)細(xì)菌增量明顯變大， 當(dāng)pH 值為7 ～8 時(shí)，COD 最終去除率均達(dá)到91%以上；在堿性環(huán)境內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)速度再次減緩， 當(dāng)pH 值分別為9，10 時(shí)，COD 去除率分別降低為85%和78%。 培養(yǎng)環(huán)境的pH 值可引起細(xì)胞膜電荷的變化，細(xì)胞膜電位改變不僅影響細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收還改變了微生物體內(nèi)各種生化酶的活性。細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制，去除率也隨之降低。因此，為保證細(xì)菌生長(zhǎng)且具有較高的降解潛力，確定最適宜培養(yǎng)pH 值為7 ～8。

圖6 pH 值對(duì)菌株M02 的影響

接種量對(duì)菌株M02 影響情況見圖7。 由圖7 可以看出， 在培養(yǎng)初期， 接種量超過(guò)7%以上的OD600值增長(zhǎng)速度明顯高于其他對(duì)照組。 隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，接種量分別為10%和15%的OD600值逐漸減小，COD 去除率持續(xù)降低； 接種量為2%～7%的OD600值和COD 去除率穩(wěn)定增長(zhǎng)，在48 h 時(shí)COD 去除率分別為62.9%，86.2%，92.2%。 由此說(shuō)明接種量過(guò)小停滯期延長(zhǎng)；增大接種量，在前期可提高細(xì)菌生長(zhǎng)速率，但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，單位細(xì)菌可利用的基質(zhì)和溶解氧相應(yīng)減少出現(xiàn)菌體自溶，且菌體破裂后的胞內(nèi)物使COD 濃度持續(xù)升高。 故在特定范圍內(nèi)，接種量越大去除效果越好。 因此，確定最適接種量為7%。

圖7 接種量對(duì)菌株M02 的影響

鹽度對(duì)菌株M02 影響情況見圖8。 由圖8 可以看出， 在不同鹽度環(huán)境下，COD 去除率有著顯著差別。 當(dāng)NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～4%時(shí)，細(xì)菌快速進(jìn)入對(duì)數(shù)期，降解性能強(qiáng)，COD 最終去除率超過(guò)90%。隨著鹽度增加，菌株適應(yīng)期延長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)調(diào)整后繼續(xù)生長(zhǎng)， 但去除率明顯降低。 NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～12%時(shí)，菌株M02 均可生長(zhǎng)且有降解性能，表明細(xì)菌耐鹽范圍廣。在低鹽度時(shí)，降解性能隨著鹽度的增加而增大； 當(dāng)NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增至7%以上時(shí)，高鹽濃度抑制了降解酶活性從而影響細(xì)菌的新陳代謝。 同時(shí)，在高滲透壓的脅迫下細(xì)胞逐漸脫水，細(xì)胞質(zhì)壁分離死亡。 因此，確定最適宜NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～4%。

圖8 NaCl 濃度對(duì)菌株M02 的影響

最適單因素條件下，細(xì)菌生長(zhǎng)趨勢(shì)見圖9。 由圖9 可以看出， 菌株M02 在2 h 內(nèi)迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)期細(xì)菌量快速增長(zhǎng)，在20 ～96 h 內(nèi)為穩(wěn)定期，細(xì)菌量保持在3.16×107～3.37×107CFU/mL。 該細(xì)菌延遲期短、生長(zhǎng)迅速，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期相對(duì)長(zhǎng)，在處理廢水時(shí)可快速發(fā)揮作用， 持續(xù)且穩(wěn)定地消耗有機(jī)污染物[26]。

圖9 菌株M02 生長(zhǎng)曲線

2.4 菌株降解高鹽廢水的實(shí)際應(yīng)用

制藥廠2 種廢水的檢測(cè)結(jié)果見表3。 圖1 實(shí)驗(yàn)裝置中的1 號(hào)、3 號(hào)反應(yīng)器內(nèi)為一車間高鹽廢水，2號(hào)、4 號(hào)反應(yīng)器內(nèi)為二車間高鹽廢水。其中1 號(hào)、2 號(hào)反應(yīng)器按照2.3 生長(zhǎng)特性研究得到培養(yǎng)條件， 將培養(yǎng)溫度控制在30 ℃， 廢水pH 值調(diào)節(jié)至7.5， 菌株M02 按照體積分?jǐn)?shù)為7%的接種量分別接入2 個(gè)反應(yīng)器內(nèi)，曝氣培養(yǎng)運(yùn)行72 h。3 號(hào)、4 號(hào)反應(yīng)器按照活性污泥法曝氣培養(yǎng)運(yùn)行72 h。

表3 高鹽廢水檢測(cè)結(jié)果mg·L-1

2 種廢水用細(xì)菌M02 和活性污泥法處理的效果對(duì)比情況見圖10。 由圖10 可以看出，一車間廢水用菌株M02 處理時(shí)，24 h 的COD 去除率為55.3%，48 h 達(dá)到最大值92.0%， 而活性污泥法對(duì)COD 最大去除率僅為57.8%； 二車間廢水用菌株M02 處理時(shí)，COD 去除率在72 h 內(nèi)達(dá)到最大值93.8%，而活性污泥法對(duì)COD 最大去除率僅為33.9%。 2 種廢水均為高鹽水，活性污泥法對(duì)COD 的去除率均明顯低于菌株M02， 因?yàn)楦啕}抑制了活性污泥中細(xì)菌的新陳代謝，甚至導(dǎo)致菌體死亡從而降低了有機(jī)物的降解率，而菌株M02 可在鹽度為1%～12%之間生長(zhǎng)且具有降解性能，處理藥廠2 種廢水的降解率均為92%以上， 再次印證該菌株在高鹽條件下能夠有效降解COD。 菌株M02 處理高鹽廢水72 h 時(shí)，二車間廢水的去除率比一車間廢水去除率高1.8%，說(shuō)明在細(xì)菌最適耐鹽范圍內(nèi)，有機(jī)物濃度增大，單位微生物可利用的底物增多， 有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)和有機(jī)物的去除。同樣2 種廢水用活性污泥處理時(shí)，鹽度越高，降解性能越差。 以上說(shuō)明菌株M02 在高鹽環(huán)境中能夠維持自身的新陳代謝， 可有效降低廢水中COD濃度，處理效果顯著優(yōu)于活性污泥法，適合高鹽工業(yè)廢水的處理。

圖10 菌株M02 與普通活性污泥對(duì)高鹽廢水降解的比較

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)處理制藥廢水的活性污泥進(jìn)行馴化、篩選得到一株耐高鹽優(yōu)勢(shì)菌株。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA 序列分析， 確定該菌株為寡養(yǎng)單胞菌屬的一株潛在新菌， 將其命名為Stenotrophomonas pavanii M02，并保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏號(hào)為CGMCC No.22898。

菌株M02 可在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 ～12%的環(huán)境中生長(zhǎng)，具有廣譜耐鹽性。采用單因素實(shí)驗(yàn)法研究不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株降解模擬高鹽廢水的影響，確定最適宜培養(yǎng)條件：pH 值為7 ～8, 溫度為30 ℃, 接種量為7%，NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～4%。 該菌株延遲期短，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期長(zhǎng)，在處理廢水時(shí)可快速發(fā)揮作用，持續(xù)且穩(wěn)定地消耗有機(jī)污染物。

將菌株M02 處理某制藥廠2 個(gè)車間的高鹽廢水， 對(duì)COD 最大去除率分別為92.0%和93.8%，比活性污泥法對(duì)COD 去除率提高34.2%和59.9%。 在實(shí)際廢水處理中，該菌株具有高效降解性能，可大幅提高生物法處理難降解高鹽廢水的效果， 對(duì)工業(yè)廢水降解具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。