肺鱗狀細胞癌預后標志物ACE2和免疫相關

郭 強 李 丹 季艷梅 郭家龍

（十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院）胸心大血管外科，十堰 442000）

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要類型，占肺癌的85%。肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）是NSCLC 的主要類型之一，占肺癌的 20%~30%［1-3］。由于癌癥轉移性質和缺乏診療生物標志物，LUSC患者的五年生存率不超過15%［4］。因此，提高LUSC患者的生存期是許多研究人員關注的焦點。目前迫切需要尋找LUSC 患者預后相關的新型標志物，以增加LUSC 患者的早期診斷和識別，進而提高LUSC患者的預后和生存期。

血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）在小腸、睪丸、腎臟、心臟、甲狀腺和脂肪等中處于高表達水平，在血液、脾臟、骨髓、腦、血管和肌肉中處于低表達水平，在肺、結腸、肝、膀胱和腎上腺中的表達水平居于兩者之間［5-7］。ACE2 在乳腺癌組織中的表達水平顯著下調。與低表達ACE2 的乳腺癌患者相比，ACE2 高表達的患者無復發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）更長。ACE2可通過VEGFa/VEGFR2/ERK 信號途徑抑制乳腺癌細胞增殖、血管形成和遷移［8］。ACE2高表達與透明細胞腎細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）患者的總生存期密切相關，其可抑制ccRCC患者體內外的腫瘤生長。血管內皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（vascular endothelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，VEGFR-TKI）能 降低ccRCC 細胞中ACE2 表達水平，進而影響腫瘤生長和患者生存期［9］。目前，ACE2 在 NSCLC 組織中低表達。ACE2 過表達可能通過促進VEGFa 表達而抑制體外細胞生長［10］。此外，ACE2 過表達可能通過調節(jié)MMP-2和MMP-9表達削弱A549細胞體外侵襲能力。ACE2 過表達可抑制人肺癌裸鼠成瘤生長，并降低 VEGFa、ACE 和 ACE2 受體 AT1R 的表達水平［11］。以上結果表明，ACE2 在 NSCLC 進展中具有重要作用。然而，ACE2在NSCLC 亞型LUSC 患者預后和免疫中的作用尚未見報道。本研究通過多個數據庫分析ACE2 在LUSC 患者預后和免疫中的潛在價值。

1 資料與方法

1.1 UALCAN 數據庫 首先，通過UALCAN（http：//ualcan. path. uab. edu）數據庫分析 ACE2 mRNA 在LUSC和正常組織中的表達。其次分析ACE2 mRNA表達水平與LUSC 患者臨床病理學特征（癌癥分期、腫瘤分級、種族、亞型等）之間的相關性。

1.2 PrognoScan 和 Kaplan-Meier Plotter 數 據 庫PrognoScan數據庫（http：//www.abren.net/Progno-Scan/）數據來源于GEO 數據庫中的RNA 數據。Kaplan-Meier Plotter 數據庫（http：//kmplot. com/analysis/）數據來源于TCGA 和GEO 數據庫的RNA 數據。本研究通過PrognoScan（篩選標準：CoxP＜0.05）和Kaplan-Meier Plotter 數據庫（分組標準：最佳截斷值）分析ACE2表達水平與LUSC患者預后之間的相關性。

1.3 基因富集分析 在TCGA 網站（https：//portal.gdc. cancer. gov/）下載類型為 LUSC HTSeq-FPKM 的基因表達數據。剔除49例正常肺組織基因表達數據?；蚋患治觯╣ene set enrichment analysis，GSEA）是一種通過基礎知識揭示基因組表達數據的方法。根據ACE2 表達中位值將TCGA 數據庫中LUSC患者的基因表達數據進行高低表達分組，以探究ACE2 可能參與LUSC 進展的機制。每次分析將基因組排列1 000次，ACE2表達水平用作表型標記。

1.4 TISIDB 數據庫 TISIDB（http：//cis. hku. hk/TISIDB/）數據庫是腫瘤免疫相關數據庫。腫瘤與免疫系統(tǒng)的相互作用在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮至關重要的作用。闡明腫瘤與免疫細胞的相互作用不僅有助于預測免疫治療反應，還有助于開發(fā)新的免疫治療靶點。通過該數據庫搜索基因名ACE2，分析ACE2 表達水平與LUSC 患者預后和免疫浸潤標志物間的關系。

2 結果

2.1 ACE2 低表達與LUSC 患者臨床病理學特征和預后不良相關 在UALCAN 數據庫中，ACE2 在LUSC 組織中的表達水平降低（圖1A）。ACE2 低表達水平與 LUSC 患者種族（CaucasianvsAsian；African-AmericanvsAsian）、癌癥分期（Stage 1vsStage 4；Stage 2vsStage 4；Stage 3vsStage 4）、吸煙史［NonsmokervsReformed smoker（＞15 years）；SmokervsReformed smoker（＞15 years）；Reformed smoker（＜15 years）vsReformed smoker（＞15 years）］和組織學亞型（NOSvsPapillary）相關（圖1B~E）。此外，在TISIDB 數據庫中，ACE2 低表達水平與LUSC 患者組織學亞型和免疫學亞型相關（圖2）。此外，在預后相關的Prog-no-Scan、Kaplan-Meier Plotter 和 TISIDB 數據庫中發(fā)現ACE2高表達的LUSC患者預后較好（圖3）。

圖1 ACE2低表達水平與LUSC患者臨床病理學特征相關Fig.1 Low expression level of ACE2 was related to clinicopathological characteristics of LUSC patients

圖2 TISIDB 數據庫中ACE2 低表達水平與LUSC 患者組織學亞型和免疫學亞型相關Fig.2 Low expression level of ACE2 was related to histological and immunological subtypes of LUSC patients in TISIDB database

圖3 ACE2低表達的LUSC患者預后不良Fig.3 LUSC patients with low ACE2 expression have a poor prognosis

2.2 ACE2 可能參與調節(jié)LUSC 進展的信號機制GSEA 結果顯示，ACE2 可能通過藥物代謝細胞色素P450、磷酸戊糖途徑、抗壞血酸和醛糖酸代謝、藥物代謝酶、TGF-β 信號通路、ECM 受體相互作用等信號通路參與LUSC進展（表1、圖4）。

圖4 ACE2涉及LUSC進展的機制Fig.4 Mechanisms by which ACE2 was involved in LUSC progression

表1 GSEA顯示ACE2參與調節(jié)LUSC進展的信號機制Tab.1 GSEA showed that ACE2 was involved in signaling mechanism that regulates progression of LUSC

2.3 ACE2 表達水平與LUSC 免疫浸潤細胞水平相關 在TISIDB 數據庫中，ACE2 低表達水平與LUSC患者免疫學亞型相關（圖2）。進一步分析ACE2 表達水平與LUSC 免疫浸潤細胞水平間的關系，結果表明，ACE2 表達水平與 LUSCTcm_CD8、CD56bright、iDC和TIL_Neutrophil細胞呈正相關，與Mem_B細胞呈負相關（圖5）。

圖5 ACE2表達水平與LUSC免疫細胞浸潤水平相關Fig.5 ACE2 expression level was correlated with level of LUSC immune cell infiltration

2.4 ACE2 表達水平與LUSC 免疫調節(jié)分子水平相關 在TISIDB 數據庫中，ACE2表達水平與LUSC免疫調節(jié)分子水平相關（圖6~8、表2）。免疫調節(jié)分子包括免疫激活分子、免疫抑制分子、MHC 分子、趨化因子及其受體分子。ACE2 表達水平與LUSC 免疫激活分子C10orf54、HHLA2、IL6R、RAET1E、KLRC1、TNFSF18、TNFSF15、TNFRSF18和TNFSF9表達水平呈正相關，與 CD70、CXCR4、ENTPD1、TNFRSF8、TNFRSF4、TNFSF4 表達水平呈負相關（圖6、表2）。ACE2 表達水平與LUSC 免疫抑制分子LGALS9、CD274、IL10RB、IDO1 和 VTCN1 表達水平呈正相關，與ADORA2A 表達水平呈負相關（表2）。ACE2表達水平與 LUSCMHC 分子 TAP2、TAP1、HLA-E 和B2M 表達水平呈正相關，與HLA-DQA2 表達水平呈負相關（表2）。ACE2 表達水平與LUSC 趨化因子CCL20、CCL26、CX3CL1、CXCL1、CXCL6、CXCL8、CXCL16 和 CXCL17 表達水平呈正相關，與 CCL2 和CCL7 表達水平呈負相關（圖7）。ACE2 表達水平與LUSC 趨化因子受體分子 CCR3、CXCR1 和 CXCR2表達水平呈正相關，與CCR4、CXCR4和CCR10表達水平呈負相關（圖8）。

圖6 ACE2表達水平與LUSC免疫激活分子水平顯著相關Fig.6 Expression level of ACE2 was significantly correlated with level of LUSC immunostimulators

圖7 ACE2表達水平與LUSC趨化因子水平顯著相關Fig.7 ACE2 expression level was significantly correlated with LUSC chemokine level

圖8 ACE2表達水平與趨化因子受體水平顯著相關Fig.8 ACE2 expression level was significantly correlated with chemokine receptor level

表2 ACE2表達水平與LUSC免疫激活分子、免疫抑制分子和MHC分子水平相關Tab.2 Expression level of ACE2 was related to levels of LUSC immunostimulators，immunoinhibitors and MHC molecules

3 討論

研究表明，ACE2 在癌癥組織中異常表達，且參與癌癥進展［8-15］。例如，ACE2 在乳腺癌組織中表達下調。ACE2 高表達與乳腺癌患者長RFS 相關。ACE2 可抑制乳腺癌的生長和遷移［8，13］。血管緊張素轉換酶ACE 和ACE2在濾泡性腺瘤組織中的表達水平較低，而在濾泡性甲狀腺癌和乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達水平較高。隨著甲狀腺癌分化程度增加，ACE/ACE2 顯著降低，而 ACE2/ACE 顯著升高。在轉移患者組織中，ACE 和ACE2 的表達水平均顯著降低。且腫瘤腫塊越大，ACE2 的表達水平越低［14］。ACE2 高表達的子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）和腎乳頭狀細胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）患者預后更好［15］。此外，ACE2 在 NSCLC 組織中表達下調，且與NSCLC 細胞生長有關［10-12］。本研究發(fā)現ACE2在LUSC 患者組織中處于低表達水平。ACE2 低表達水平與LUSC 患者種族、癌癥分期、吸煙史、組織學亞型、免疫學亞型和預后不良有關。該研究結果與既往研究趨于一致［10-12］，提示ACE2 表達水平在LUSC進展中發(fā)揮極為重要的作用。

研究發(fā)現，干擾TGF-β1 表達可通過促進BRCA1 表達和Smad3 磷酸化來增加卵巢癌對藥物的敏感性。體內研究表明，敲低TGF-β1 表達能通過上調BRCA1 表達和Smad3 磷酸化水平來抑制腫瘤生長［16］。Twist2 在人腎癌組織中高表達。Twist2能促進腎癌細胞增殖，抑制細胞凋亡，增強腎癌衍生細胞的遷移和侵襲，并促進體內腫瘤生長。敲低Twist2 表達可降低 ITGA6 和 CD44 表達水平，抑制細胞增殖、遷移和侵襲。該結果表明Twist2 通過調節(jié)ECM 受體相互作用機制中ITGA6 和CD44 表達促進腎癌細胞進展［17］。此外，大多數腫瘤會出現多種代謝途徑的致癌基因驅動，這對維持其生長和增殖至關重要［18-19］。GSEA結果顯示，ACE2可能參與調節(jié)藥物代謝酶、TGF-β 信號通路、ECM 受體相互作用等信號機制參與LUSC 進展。這與文獻報道結果相一致，提示ACE2可能通過這些機制參與LUSC進展。

腫瘤免疫細胞浸潤和免疫因子標志物與腫瘤患者預后有關［20-21］。例如，MATSUMOTO 等［22］報道CD4和CD8陽性T 細胞浸潤水平與三陰性乳腺癌患者預后相關。INAGUMA 等［23］報道 CD70 陽性表達與惡性胸膜間皮瘤患者預后不良相關。ZHANG等［24］報道 CCL2 表達與 Snail 表達相關，且影響胃癌患者的預后。LI 等［25］研究表明 COVID-19 感染能使上皮細胞中細胞因子 IL-1、IL-10、IL-6 和 ACE2 表達水平增加，并激活B 細胞。在SARS-CoV 感染細胞中，ACE2 表達水平與中性粒細胞、自然殺傷細胞、Th17、Th2、Th1 和樹突狀細胞水平顯著相關，提示T細胞被激活，進而發(fā)揮其生物學作用。SODHI等［26］報道ACE2 缺乏可導致細菌感染小鼠肺嗜中性粒細胞增多，致使過度炎癥反應和肺損傷。相反，ACE2過表達會減少中性粒細胞浸潤，損害宿主防御能力。ACE2 通過降低STAT3 活性來限制IL-17 信號傳導，從而抑制嗜中性粒細胞浸潤和肺部炎癥。此外，研究報道免疫因子 HHLA2、IL6R、RAET1E2 在癌癥免疫過程中具有重要作用［27-33］。例如，CHENG等［27-28］報道 HHLA2 是 B7/CD28 家族中新發(fā)現的免疫檢查點成員。HHLA2 在NSCLC 組織中過表達。且在 EGFR 突變患者組織中表達更高。YIN 等［29］發(fā)現腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）與癌癥患者預后不良有關。miR-204-5p 是介導TAM 誘導結直腸癌化學耐藥性的功能靶標。而巨噬細胞分泌的IL-6 能激活結直腸癌細胞中IL6R/STAT3信號途徑和STAT3轉錄，抑制腫瘤抑制因子miR-204-5p 表達，并誘導其化學抗性。CCL2/CCL12 抗體可明顯減少腫瘤體積。聯(lián)合治療可增加腫瘤內CD8+T 細胞含量，以參與腫瘤的免疫應答［31］。課題組發(fā)現 ACE2 低表達與 LUSC 免疫學亞型相關。ACE2 表達水平與LUSC Tcm_CD8、CD56bright、iDC 和 TIL_Neutrophil 細胞水平呈正相關，與Mem_B 細胞水平呈負相關。ACE2 表達水平與HHLA2、IL6R、RAET1E 等表達水平呈正相關，與CD70、CCL2、CCL7 等表達水平呈負相關。本研究結果補充了LI等［25］和SODHI等［26］的研究結果，表明ACE2 表達水平與LUSC 免疫密切相關，但仍需進一步研究證實。