CD1d在小鼠皮膚移植排斥反應中的作用及機制研究①

許相范 徐顯輝 葉承祖 林艷麗

（中國人民解放軍陸軍第七十三集團軍醫(yī)院病理科，廈門 361003）

器官移植術后免疫抑制治療是臨床上必不可少的措施，但移植免疫排斥反應復雜多樣，難以達到長期療效。因此，挖掘精準有效的分子免疫調(diào)節(jié)療法是保護移植器官長期存活、維持其功能的現(xiàn)代醫(yī)療模式。同種異體移植免疫排斥反應是由受體T細胞通過自身抗原受體（TCR）直接、間接或半直接識別供體抗原而引起的。在這個過程中參與抗原遞呈細胞（APC）、細胞因子和調(diào)節(jié)性T/B（T/Breg）細胞，并決定受體排斥還是接受移植物的關鍵作用［1-2］。

本研究旨在探討CD1d 在小鼠皮膚移植排斥反應中的免疫調(diào)節(jié)作用及其機制。CD1d 是嚙齒類動物特有的非多態(tài)性脂質抗原遞呈分子，可為NKT 細胞提呈磷酸化和糖肽類脂質抗原。皮膚的皮下組織主要由纖維脂肪組織所組成，因此在皮膚移植模型中自然富于脂類抗原適于CD1d分子功能研究［3］。Ⅰ型NKT（ⅠNKT）是CD1d 限制性T 細胞中研究最深入的亞群，可識別脂類抗原，活化后表現(xiàn)出直接細胞毒作用，且大量分泌多種細胞因子，在Th1 或Th2 為主導的免疫反應中起調(diào)節(jié)作用［4］。因此調(diào)節(jié)以CD1d-ⅠNKT 為軸的免疫反應進而誘導移植物的免疫耐受是有望實現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 材 料 實 驗 用 小 鼠 C57BL/6（B6，H-2b）、BALB. B（BALB/c，H-2b）、BALB/c（H-2d）以及相關背景的CD1d 缺失小鼠（標為CD1d-/-），均購自Jackson實驗室，并在SPF級別動物實驗室喂養(yǎng)并開展實驗。用于實驗的小鼠均為出生第6~8 周以及體質量20~25 g 的雌性小鼠。檢測小鼠細胞因子的抗IL-4（11B11）、抗 IFN-γ（R46-A2）和抗 NK1.1（PK136）抗體；用于流式細胞儀（FACS）染色的抗體，如PE 或Cych-抗 CD4、FITC 或 PE-抗 CD8、PE-抗 NK1.1、FITC-抗CD1d，Cych-TCR；大鼠抗小鼠IL-10 阻斷單抗以及大鼠IgG1單抗，以上抗體均購自PharMingen。α-GalCer 溶解于含有 0.5% 吐溫-20 的 PBS 中，濃度為220 μg/ml，備用。

1.2 方法

1.2.1 小鼠皮膚移植模型的建立 如文獻［5］所述，供體小鼠尾部皮膚移植到受體小鼠左側胸背部。脫頸處死供體小鼠后切取鼠尾并剝離尾部全層皮膚，將其切成一片5 mm×6 mm 的皮片待用。供者小鼠用3-溴乙醇麻醉后在左側胸背部移植區(qū)常規(guī)脫毛、消毒后用皮膚剪切除皮膚做植皮床基；移植后7 d 取下植皮固定綁帶，并每天觀察移植皮片存活狀態(tài)，持續(xù)觀察60 d 以上；當90%以上的移植皮膚組織壞死時，判定為完全排斥。

實驗一般分組：供體雌性BALB.B CD1d-/-小鼠的皮膚移植到受體雌性B6 CD1d-/-小鼠的胸背部，作為基因缺失實驗組；供受體均為雌性BALB. B CD1d-/-小鼠，作為基因缺失對照組；供體雌性BALB. B 小鼠的皮膚移植到受體雌性B6 小鼠的胸背部，作為野生型實驗組；供受體均為雌性B6 或BALB.B小鼠，作為野生型對照組；每組5只小鼠。

在CD1d 對小鼠植皮存活時間的影響實驗中具體分組：第一組，基因缺失實驗組；第二組，基因缺失對照組；第三組，野生型實驗組；第四組，野生型對照組。

在CD1d 與小鼠皮膚移植物壽命相關性實驗中具體分組：第一組，未接受手術的野生型BALB.B小鼠尾部皮膚，作為陰性對照組；第二組，基因缺失實驗組；第三組，基因缺失對照組；第四組，野生型實驗組；第五組，野生型對照組。

在CD1d 對引流淋巴結NKT 細胞活化和增殖的影響實驗中具體分組：第一組，CD1d 基因缺失對照組；第二組，CD1d 基因缺失實驗組；第三組，野生型對照組；第四組，野生型實驗組。

在CD1d 對受體細胞因子水平的影響實驗中具體分組：第一組，基因缺失對照組；第二組，基因缺失實驗組；第三組，野生型對照組；第四組，野生型實驗組。

在分析CD1d 調(diào)節(jié)移植物排斥反應的主要機制實驗中具體分組：第一組，注射對受體小鼠無影響的抗體IgG1（對照組）；第二組，注射抗IL-10 單克隆抗體（IL-10 阻斷組）；第三組，給受體小鼠移植同種野生型脾淋巴細胞；第四組，α-GalCer 治療組（NKT細胞激活組）。

部分實驗小鼠脫頸處死，并采集相關組織或器官用于分析。α-GalCer受試的受體小鼠則在從移植前7 d 開始至移植后7 d 每隔3 d 腹腔注射2-Galter 6 μg/次。IL-10阻斷實驗時給受體小鼠從移植前7 d開始至移植后7 d每隔3 d腹腔注射50 μg抗IL-10抗體懸液。

1.2.2 小鼠皮膚移植后NKT 細胞募集的檢測 移植后第7 天受試小鼠脫頸處死，切取引流淋巴結和/或移植皮片，并立即液氮冷凍。用Trizol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，California）分離總RNA，用Nanodrop分光光度計測定濃度，取2 μg總RNA并按照試劑盒說明書進行cDNA 的合成和PCR 擴增。Vα14 基因相應的引物：正向5′-CTAAGCACAGCACGCTGCACA-3' 和 反 向 5′-AGGTATGACAATCAGCTGAGTCCC-3'；GAPDH 基因相應的引物：正向5′-CCCACTAACATCAAATGGGG-3' 和 反 向 5′-ATCCACAGTCTTCTGGGTGG-3'。PCR反應設計為95 ℃下45 s，62 ℃下45 s，72 ℃下45 s；循環(huán)30次。

1.2.3 流式細胞術檢測小鼠引流淋巴結NKT 細胞受試小鼠脫頸處死，切取引流淋巴結并研磨和尼龍網(wǎng)過濾制備成單細胞懸液，用PBS 洗滌，用0.5%牛血清蛋白PBS 中重新洗滌后，根據(jù)說明對細胞進行熒光標記抗體染色（PE-抗NK1.1 和Cych-TCR），并用流式細胞儀（BD Biosciences）分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR 分析 取實驗小鼠腋下淋巴結并按方法1.2.2 提取總RNA，將1 μg 總RNA反向轉錄成cDNA。再按照試劑盒說明書各取cDNA，正反引物和靶探針制作PCR 反應體系。使用序列檢測系統(tǒng)（Agilent Mx3005P qPCR System，USA）檢測。以 18S 核糖體 RNA 為內(nèi)參基因，并用 2-ΔΔCt×1010方法計算目標細胞因子mRNA表達的相對水平［6］。IFN-γ基因相應的引物及探針：正向5'-AGCAACAGCAAGGCGAAAA-3'，反向 5'-CTGGACCTGTGGGTTGTTGA-3'，探針FAM 5'-CCTCAAACTTGGCAATACTCATGAATGCATCC-3' TAMRA；IL-4：正向5'-CATCGGCATTTTGAA-3'，反 向 5'-CGTTTGGCACATCCATCTCC-3'，探針為 FAM 5'-CACAGGAGAAGGGACGCCATGCA-3' TAMRA；IL-10：正向5'-TTTGAATTCCCTGGGTGAGAA-3'，反向 5'-ACAGGGGAGAAATCGATGACA-3'，探針為 FAM 5'-TGAAGACCCTCAGGATGCGGCTG-3' TAMRA；TGF-β：正向5'-GCAACATGTGGAACTCTACCAGAA-3'，反向 5'-GACGTCAAAAGACAGCCACTCA-3'，探針為FAM 5'-ACCTTGGTAACCGGCTGCTGACCC-3'TAMRA；18S rRNA：正向5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3'，反向5'-GCTGGAATTACCGCG-3'GCT，探針為VIC 5'-TGCTGGCACCAGACTTGCCCTC-3'TAMRA。

1.2.5 脾淋巴細胞的移植實驗 無菌條件下切取野生型B6 小鼠的脾臟，并研磨和過篩獲取細胞懸液，利用Percoll 濃度梯度法提取單核淋巴細胞，并將細胞稀釋備用。小鼠皮膚移植前處理，即首先利用低劑量（600 rad）的輻射方法抑制受體B6 CD1d-/-小鼠體內(nèi)淋巴細胞活性后，第2 天靜脈注射野生型B6 小鼠的1.2×108個脾淋巴細胞用于植皮實驗，在SPF條件下飼養(yǎng)6 d后開展皮膚移植實驗。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計學軟件SPSS23.0處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以表示。當兩組在同一時間點進行比較時均采用Studentt檢驗，在同一時間點多組比較時采用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 觀察CD1d 基因缺失對小鼠植皮存活時間的影響 為探討CD1d 分子在移植免疫排斥反應作用，利用野生型或CD1d 基因缺失的BALB. B 和B6小鼠建立同種異體皮膚移植模型。實驗結果如圖1所示，基因缺失對照組和野生型對照組的移植皮片完全存活，且存活時間均超過60 d。野生型實驗組在移植后第18天開始出現(xiàn)移植皮片皮膚皺褶消失、發(fā)白、失去光澤等免疫排斥反應，其移植皮片平均存活時間為（24.4±1.1）d。而CD1d 基因缺失實驗組的移植皮片平均存活時間為（39.2±4.8）d，與野生型相比顯著延長（P＜0.001）。另外，BALB/c 小鼠雄性Y抗原相關的皮膚移植模型實驗中也得到同樣的結果，如圖2所示CD1d基因缺失時移植皮片的平均存活時間為（48.6±2.2）d，比野生型［（22.0±2.4）d］顯著延長（P＜0.001）。

圖1 同種異體移植物存活曲線Fig.1 Allografts survival curve of skin

圖2 雄性Y抗原相關移植物的存活曲線Fig.2 Y-antigen related grafts survival curve

2.2 探討CD1d延長小鼠皮膚移植物壽命的機制各實驗組小鼠接受皮膚移植手術后第7天切取其移植皮片，采用RT-PCR 方法檢測NKT 細胞所特異的Vα14 基因表達，結果如圖3 所示，陰性對照組正常皮膚中未檢測到NKT 細胞特異性Vα14 基因表達，而在基因缺失實驗組、野生型實驗組和野生型對照組中均能明顯檢測到。基因缺失對照組Vα14 基因表達明顯弱于其他3個移植實驗組。

圖3 移植物中NKT細胞的募集情況Fig.3 Recruitment of NKT cells in grafts

2.3 探討皮膚移植術后CD1d 對引流淋巴結NKT細胞活化和增殖的影響 皮膚移植后第7天切取受體小鼠腋窩淋巴結，應用流式細胞儀定量分析皮膚移植術后受體小鼠腋窩淋巴結NKT 細胞的增殖情況，結果如圖4 所示，CD1d 基因缺失實驗組的引流淋巴結內(nèi)NKT 細胞比例與野生型實驗組相比顯著降低（P＜0.05）；另外，CD1d 基因缺失對照組的NKT細胞比例與野生型對照組相比顯著降低（P＜0.05）。

圖4 引流淋巴結NKT細胞增殖率Fig.4 Proliferation rate of NKT cells in draining lymph nodes

2.4 檢測CD1d 對受體細胞因子水平的影響 移植后第7 天，檢測受體小鼠腋窩引流淋巴結內(nèi)相關細胞因子 mRNA 的表達，結果如圖 5 所示，CD1d 基因缺失實驗組與野生型實驗組相比，細胞因子IL-10和TGF-β 水平均顯著升高（P＜0.05 和P＜0.001）；反而，IFN-γ 和IL-4 水平則顯著降低（均為P＜0.05）。另外兩個對照組對細胞因子無明顯影響。

圖5 受體小鼠腋下淋巴結相關細胞因子mRNA表達Fig.5 Relative mRNA expressions of cytokines in axillary lymph nodes of recipient mice

2.5 證實CD1d調(diào)節(jié)移植物排斥反應的主要機制前面研究結果表明CD1d 基因缺失可抑制NKT 細胞活化，而增加 IL-10 和 TGF-β 表達，推測這些與移植物的延壽相關。為了證實上述觀點，建立小鼠基因缺失實驗組模型：即供體均為BALB.B CD1d-/-小鼠，受體均為B6 CD1d-/-小鼠，每組5 只小鼠。受試的受體小鼠從移植前7 d至移植后7 d，每隔3 d腹腔注射相應試劑或抗體懸液，結果如圖6所示，給受體小鼠移植同種野生型脾淋巴細胞組和NKT 細胞激活組的移植皮片存活時間比對照組顯著縮短（P＜0.01和P＜0.05）。IL-10 阻斷組盡管與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但亦可觀察到移植物生存時間的縮短，這一結果并不排除小樣本相關的誤差。

圖6 治療后移植皮片的存活時間Fig.6 Days of grafts survival after treatment

3 討論

眾所周知，器官移植是一項重要的臨床治療手段，但機體對移植物的排斥反應是極其復雜難以控制的醫(yī)療問題。器官移植后對移植物的排斥反應可分為早期急性排斥反應和晚期適應性免疫反應，前者被認為決定后者，即排斥還是免疫耐受的關鍵一環(huán)。急性排斥反應是由供體器官的獲取、保存以及植入等一系列過程中，組織細胞的損傷所釋放的危險信號觸發(fā)受體的先天性免疫系統(tǒng)而啟動。

本研究旨在觀察CD1d 對小鼠皮膚移植急性排斥反應的影響，并探討其作用機制。CD1d是一種非多態(tài)性MHCⅠ類家族蛋白。CD1d 作為一種抗原遞呈分子為NKT 細胞提供脂類抗原，以此激活和增殖［7］。在嚙齒動物中，CD1d 是唯一的脂類抗原遞呈分子，通常在成熟的T 細胞以外的多種淋巴造血系統(tǒng)細胞中表達。最引人注目的是由APC 表達，此外脂肪細胞也廣泛表達。因此，利用富含脂類抗原的小鼠皮膚移植實驗是研究CD1d分子的最佳選擇。

本研究結果BALB.B（H-2b）小鼠尾部全層皮膚移植到B6（H-2b）小鼠胸背部的動物模型中，當CD1d基因缺失時，移植皮片平均存活時間與野生型相比顯著延長，說明CD1d 基因的缺失導致移植皮片的排斥反應減弱，有利于移植物的延壽。在另一個配對實驗中也可以觀察到同樣的結果，即雌性BALB/c（H-2d）小鼠對雄性Y 抗原相關的移植免疫排斥反應中，當CD1d 基因缺失時移植物平均存活時間明顯長于野生型。本實驗在設計上考慮到組織相容性復合物抗原性的大小，即MHCⅠ和/或MHCⅡ完全不一致時，移植物的抗原性太強，移植物存活時間過短不便于觀察靶基因的功能。因此，選擇了小鼠組織相容性復合物（H-2）一致而次要組織相容性復合物不同的小鼠做皮膚移植實驗。

LI 等［8］在小鼠腎臟缺血再灌注損傷實驗中，發(fā)現(xiàn)用單克隆抗體阻斷CD1d 時明顯減輕腎損傷，其保護機制與阻斷CD1d 介導的NKT 細胞活化和細胞因子 IFN-γ 分泌有密切相關。還認為分泌 IFN-γ 的主要細胞為GR-1+CD11b+中性粒細胞所組成，但也含有 CD1d 限制性 NKT 細胞。LAPPAS 等［9］研究者在肝臟再灌注損傷的實驗結果，也證實了CD1d 介導的糖脂遞呈給NKT 細胞，使其激活并急速產(chǎn)生IFN-γ 是肝損傷的主要原因。本研究的結果同樣證實了類似的現(xiàn)象，在小鼠皮膚移植模型實驗中當CD1d基因缺失時，移植物的生存時間明顯長于野生型，而且其細胞因子IFN-γ 的表達明顯低于野生型對照組。由此，推理阻斷CD1d-NKT細胞為軸的生物學效應時，NKT 細胞的直接細胞毒作用和細胞因子風暴受到阻尼是保護移植物使其延壽的主要機制。

CD1d 是 NKT 細胞的抗原遞呈分子，而 NKT 細胞是一種進化的先天性免疫細胞樣T 淋巴細胞亞型。其具有與NK 細胞相同的表型和直接的細胞毒作用，并表達高度特異的T 細胞受體。根據(jù)其TCR表達可進一步分為Ⅰ型NKT 細胞和Ⅱ型NKT 細胞［10］。然而，最近研究表明存在許多不同功能的NKT 細胞亞群。FARR 等［11］通過分子和功能的比對方法證明了CD1d 非依賴性NKT 細胞群的存在。EBERL 等［12］也發(fā)現(xiàn)了 Vα14 NKT 細胞一樣表達NK1.1 的一類微量淋巴細胞群體，分為CD1d 依賴性和CD1d 非依賴性Vα14 NKT 細胞。本實驗結果在所有接受手術的移植物中都能檢測到NKT 特異性 Vα14 信號 RNA 的表達，包括 CD1d 基因缺失組；并且CD1d 基因缺失導致引流淋巴結內(nèi)NKT 細胞比例顯著減少。早在 1986 年 MOSMANN 等［13］提出了移植免疫相關的免疫偏離學說，即當Th1 偏離Th2時，移植物產(chǎn)生免疫耐受，反之產(chǎn)生免疫排斥反應，這些免疫偏離現(xiàn)象又受相關細胞因子的調(diào)節(jié)。

皮膚移植免疫排斥反應的過程中，普遍認為APC 介導的免疫反應主要在次級淋巴器官中啟動。在此過程中，APC 通過MHC、CD1d 等分子將識別的抗原提呈在細胞表面，使TCR 受體識別引起激活和擴增相應的免疫細胞，并迅速釋放大量細胞因子［14］。本實驗結果表明，當BALB.B 小鼠為供體B6小鼠為受體進行皮膚移植實驗時，手術創(chuàng)傷應激和同種異體抗原誘導下，受體野生型小鼠產(chǎn)生正常的免疫排斥反應，此時NKT 細胞數(shù)量以及細胞因子IFN-γ 和 IL-4 分泌均增加；然而 CD1d 基因缺失時NKT 細胞比例減少，細胞因子 IL-10 和 TGF-β 均明顯增高。因此，CD1d抑制移植物排斥反應的機制是通過阻尼NKT 細胞的活化和增殖，并且通過CD1d-NKT 細胞為軸調(diào)控其他各種免疫細胞分泌細胞因子來實現(xiàn)。這一推理在脾淋巴細胞過繼免疫、α-GalCer治療和單克隆抗體阻斷IL-10中得到證實。眾所周知，IFN-γ 作為一種促炎癥細胞因子，主要由Th1細胞、活化的APC以及NKT等細胞分泌，在同種異體免疫反應中促進排斥反應；而IL-10和TGF-β是有利于移植物免疫耐受的抗炎癥細胞因子［15-16］。杜文靜等［17］也認為 IL-10 和 TGF-β 作為抑制型細胞因子，在RA 疾病過程中重要的細胞因子，它們還可能介導免疫耐受和抑制過度免疫反應。

總之，CD1d 分子通過CD1d-NKT 細胞為軸的免疫反應，抑制NKT 細胞的激活和細胞因子微環(huán)境的改變，在器官移植早期免疫排斥反應中起到舉足輕重的作用。早期免疫排斥反應又決定著晚期的適應性免疫反應，即決定器官移植成敗的結局。因此，本文基于傳統(tǒng)的免疫抑制療法，以CD1d 分子為靶標，開發(fā)新型有效的生物藥物提供一定的理論依據(jù)。