多階段采樣分析顛茄草特征成分變化規(guī)律及最佳采收期

馮言顏，熊維政，李磊，郭立，郭軍霞

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046；2.河南羚銳制藥股份有限公司工程技術(shù)中心，信陽 465550)

顛茄草為茄科植物顛茄(AtropabelladonnaL.)的干燥全草，20世紀(jì)30年代從歐洲引入我國(guó)，目前全國(guó)多個(gè)地區(qū)均有種植，主要分布在山東、湖南、河南及浙江等地[1-3]。市場(chǎng)上流通的顛茄草藥材大多為一年生的栽培品，各產(chǎn)地由于氣候條件不同其生長(zhǎng)規(guī)律與有效成分積累存在一定的差異，采收時(shí)間不一致，如陜西屬北亞熱帶濕潤(rùn)氣候，年平均溫度15.1 ℃，降水量較多，該產(chǎn)地顛茄藥材在4月初移栽，9月中旬采收[4-5]；湖南屬亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，年平均氣溫一般為16～19 ℃，春夏多雨，秋冬干旱，該產(chǎn)地顛茄藥材一年種植兩茬，春種顛茄3月初移栽，當(dāng)年6月中下旬采收，秋種顛茄9月下旬移栽，次年6月中下旬采收[2]。河南屬暖溫帶至亞熱帶、濕潤(rùn)至半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，年平均氣溫一般為12～16 ℃，雨水多集中在夏季，該產(chǎn)地在駐馬店、信陽及周口等多個(gè)地區(qū)均有種植顛茄草，分為春種和秋種兩種模式，其中以秋季種植為主，但由于顛茄草引種時(shí)間不長(zhǎng)，在種植采收方面缺乏系統(tǒng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的模式，部分地區(qū)種植方式及采收時(shí)間不一致，存在混批次藥材質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，因此，研究影響該地區(qū)顛茄草質(zhì)量的相關(guān)因素很有必要[6]。

顛茄草中的有效成分主要為生物堿類化合物，具有鎮(zhèn)痛、解痙的藥理作用，主要用于制備其中間體顛茄浸膏和顛茄流浸膏[7]。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部規(guī)定其常用中間體含量控制指標(biāo)均為硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯，而顛茄草藥材仍是通過酸堿滴定法測(cè)定總生物堿含量，該方法不僅操作繁瑣，誤差較大，且與其中間體含量測(cè)定指標(biāo)不同，不利于產(chǎn)品質(zhì)量控制[7-8]。因此本實(shí)驗(yàn)針對(duì)河南秋季種植的顛茄草進(jìn)行研究，采用高效液相色譜(HPLC)法，以硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯為含量測(cè)定指標(biāo)，測(cè)定不同采收時(shí)間、不同部位顛茄草中2種特征成分的含量，并與全國(guó)20個(gè)產(chǎn)地顛茄草藥材作對(duì)比，為河南秋種顛茄草合理采收及顛茄草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供科研資料，同時(shí)也為顛茄草優(yōu)良種質(zhì)篩選奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津公司)；DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；114B搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)；MS304S電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg)；KQ-600 VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2樣品與試劑 課題組于2020年6—10月進(jìn)行顛茄草產(chǎn)地調(diào)研，收集河南羅山、河南新縣、河南光山、河南西華、河南固始、河南正陽、山東萊州、山東沂南、山東蓬萊、山東牟平、湖南新田、湖南株洲、江西贛州、江西彭澤、江西上高、新疆庫(kù)爾勒、黑龍江穆棱、湖北孝昌、陜西旬陽和陜西漢陰共20個(gè)產(chǎn)地顛茄草樣品。其中不同采收時(shí)間及不同部位顛茄草樣品采自河南羚銳制藥中藥材種植基地，自2020年5月21日—7月14日每隔約10 d采樣1次，共采樣6次，同時(shí)將2020年6月21日采集的顛茄草樣品分為全草、根、莖、葉和果實(shí)。經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)王裕銘教授鑒定，均為茄科植物顛茄(AtropabelladonnaL.)。

硫酸天仙子胺(批號(hào)：620-61-1，含量≥98%)購(gòu)于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；東莨菪內(nèi)酯(批號(hào)：110768-200504，含量≥98%)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；色譜級(jí)甲醇(賽默飛世爾科技有限公司)；色譜級(jí)乙腈(賽默飛世爾科技有限公司)；超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1顛茄草中硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯的含量測(cè)定

2.1.1溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備：精密稱定硫酸天仙子胺，用50%甲醇作溶劑配成0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液；精密稱定東莨菪內(nèi)酯，50%甲醇作溶劑配成18.764，37.528，75.055，150.11，300.22，600.44 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。供試品溶液制備：精密稱定顛茄草中粉2 g(粉末過篩孔內(nèi)徑0.25 mm)，50%甲醇50 mL置于100 mL錐形瓶中，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率400 W，頻率58 kHz)，放冷后再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2色譜條件 硫酸天仙子胺色譜條件：Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.25%十二烷基磺酸鈉的0.004%磷酸溶液(40：60)，等度洗脫；體積流量：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

東莨菪內(nèi)酯色譜條件：Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.05%磷酸溶液，梯度洗脫(0～5 min，3%～15%A；5～60 min，15%～60%A)；體積流量0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)344 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.3方法學(xué)驗(yàn)證

①專屬性實(shí)驗(yàn)：按照“2.1.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，得到對(duì)照品和顛茄草樣品的HPLC色譜圖，見圖1。結(jié)果表明硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯色譜峰分離度高、專屬性強(qiáng)。

②精密度實(shí)驗(yàn)：分別精密吸取硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯峰面積RSD值為0.35%，0.31%，表明儀器精密度良好。

③線性關(guān)系考察：分別精密吸取硫酸天仙子胺、東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品溶液在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得回歸方程，見表1。硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯在表1測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯線性關(guān)系考察結(jié)果 Tab.1 Linear relationship results of hyoscyamine sulfate and scopoletin

④重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一批次樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，得到硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯含量RSD值分別為0.91%，1.24%，表明該方法重復(fù)性良好。

⑤穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：對(duì)“2.1.3 ④”項(xiàng)中制備的同一份供試品溶液，分別在0，0.5，1，2，4，8，16，24 h取樣，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)得硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯峰面積RSD分別為1.20%，1.03%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

A.硫酸天仙子胺對(duì)照品；B.顛茄草樣品+硫酸天仙子胺；C.東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品；D.顛茄草樣品+東莨菪內(nèi)酯；1.硫酸天仙子胺；2.東莨菪內(nèi)酯。圖1 對(duì)照品及顛茄草樣品HPLC色譜圖 A.hyoscyamine sulfate reference substance；B.belladonna sample+hyoscyamine sulfate；C.scopoletin reference substance；D.belladonna sample+scopoletin；1.hyoscyamine sulfate；2.scopoletin.Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance and belladonna sample

⑥加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取含量已知的樣品6份，每份1 g，精密加入相當(dāng)于1 g藥材含量的對(duì)照品，按照“2.1.1”項(xiàng)中的方法制備供試品溶液，在“2.1.2”項(xiàng)條件下測(cè)定硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 硫酸天仙子胺、東莨菪內(nèi)酯加樣回收率測(cè)定結(jié)果 Tab.2 Test results of sample recovery rate of hyoscyamine sulfate and scopoletin

2.1.4數(shù)據(jù)處理與分析 實(shí)驗(yàn)采用IBM SPSS Statistics 20版、Origin85版、Excel2010版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并通過系統(tǒng)聚類法對(duì)不同產(chǎn)地藥材進(jìn)行聚類分析。

2.2河南秋種顛茄草不同采收時(shí)間兩種特征成分變化規(guī)律 從2020年5月21日顛茄草開花開始在河南羚銳制藥中藥材種植基地采樣，每批次采集3份，每份隨機(jī)采集5株，烘干，每份5株，分別稱質(zhì)量后取平均值，用SPSS軟件處理3份藥材干質(zhì)量平均值得到單株干質(zhì)量及標(biāo)準(zhǔn)差；將3份藥材分別粉碎成中粉，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定含量，用SPSS軟件處理得到含量均值及標(biāo)準(zhǔn)差；每份藥材單株干質(zhì)量與含量的乘積即單株總量。

根據(jù)表3中結(jié)果，河南秋季種植顛茄草從2020年5月21日—7月14日單株干質(zhì)量逐漸增加，2020年6月21日干質(zhì)量達(dá)到最大值373.62 g，之后略有降低；硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯含量呈現(xiàn)“先增后減再增”的趨勢(shì)，硫酸天仙子胺在2020年6月11日含量最高，為2.606 mg·g-1，2020年6月21日略有降低；東莨菪內(nèi)酯含量在2020年6月21日含量最高，為0.333 mg·g-1；2020年6月21日后2種成分含量急劇下降，而2020年7月14日2種特征成分再次升高，這可能與果實(shí)成熟有關(guān)。單株藥材硫酸天仙子胺總量在2020年6月11日最高，單株藥材東莨菪內(nèi)酯總量在2020年6月21日最高，綜合考慮不同采收時(shí)間樣品干質(zhì)量及2種特征成分含量積累規(guī)律確定河南秋種顛茄在6月中旬采收為宜。

表3 不同采收時(shí)間河南秋種顛茄草2種特征成分含量測(cè)定結(jié)果 Tab.3 Determination results of two characteristic components in Henan autumn belladonna at different harvest times

2.3河南秋種顛茄草不同部位中2種特征成分含量 于2020年6月21日在河南羚銳制藥股份有限公司中藥材種植基地隨機(jī)采集顛茄草樣品3份，每份15株，烘干后稱質(zhì)量，將各部位分開后粉碎并稱質(zhì)量，測(cè)定含量，按各部位質(zhì)量率(%)取樣100 g，混勻后測(cè)定全草含量。各部位對(duì)全草貢獻(xiàn)率(%)=(單個(gè)部位含量×單個(gè)部位質(zhì)量)/(全草含量×全草質(zhì)量)×100%。

根據(jù)表4、圖2結(jié)果可知，河南秋種顛茄草不同部位中，顛茄果實(shí)中硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯含量最高，分別為4.590，0.626 mg·g-1，但由于全草中不同部位生物量分配不同，硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯整體貢獻(xiàn)值為：葉>莖>果>根，因此在采收時(shí)應(yīng)盡量保持葉片的完整性，這也與不同生長(zhǎng)期兩種成分積累規(guī)律相一致，預(yù)示顛茄在6月中旬成熟后應(yīng)盡快采收，避免葉子脫落而降低藥材質(zhì)量。

圖2 河南秋種顛茄草各部位含有的硫酸天仙子胺(左)及東莨菪內(nèi)酯(右)對(duì)全草的貢獻(xiàn)率 Fig.2 Contribution percentage of hyoscyamine sulfate(left) and scopoletin(right) contained in each part to the whole plant of Henan autumn belladonna

表4 河南秋種顛茄草不同部位含量測(cè)定結(jié)果 Tab.4 Content determination results in different parts of Henan autumn belladonna

2.4不同產(chǎn)地顛茄草特征成分比較 測(cè)定全國(guó)20個(gè)產(chǎn)地顛茄草平均單株干質(zhì)量、硫酸天仙子胺及東莨菪內(nèi)酯含量，并對(duì)單株顛茄草藥材中兩種特征成分總量進(jìn)行比較分析，根據(jù)單株藥材總量對(duì)不同產(chǎn)地顛茄草進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見表5、圖3、圖4。

圖3 不同產(chǎn)地顛茄草單株藥材硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯總量比較 Fig.3 Comparison of the total amount of hyoscyamine sulfate and scopoletin in a single plant of belladonna from different origins

圖4 不同產(chǎn)地顛茄草系統(tǒng)聚類圖 Fig.4 System clustering diagram of belladonna from different origins

表5 不同產(chǎn)地顛茄草的特征 Tab.5 Characteristics of belladonna from different origins

由結(jié)果可知全國(guó)不同產(chǎn)地顛茄草單株干質(zhì)量、硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯含量及單株總量均存在差異。單株干質(zhì)量平均值為370.35 g，山東沂南單株干質(zhì)量最大為501.97 g，黑龍江穆棱單株干質(zhì)量最小為295.67 g；硫酸天仙子胺含量平均值為1.914 mg·g-1，單株藥材硫酸天仙子胺總量平均值為715.99 mg，河南新縣總量最高(1049.74 mg)，江西彭澤總量最低(333.67 mg)；東莨菪內(nèi)酯含量平均值0.238 mg·g-1，單株藥材東莨菪內(nèi)酯總量平均值為86.44 mg，江西上高總量最高，為158.34 mg，江西彭澤總量最低，為39.49 mg。根據(jù)聚類分析樹狀圖，可將全國(guó)20個(gè)產(chǎn)地顛茄草分為4類，第①類包括山東蓬萊、湖南新田、河南正陽、湖南株洲及山東萊州5個(gè)種質(zhì)，該類群硫酸天仙子胺含量較高，東莨菪內(nèi)酯含量較低；第②類包括河南羅山、山東牟平、河南固始、河南新縣、河南光山及山東沂南6個(gè)種質(zhì)，該類群硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯含量均較高；第③類包括黑龍江穆棱、湖北孝昌、陜西旬陽、陜西漢陰、河南西華及江西彭澤共6個(gè)種質(zhì)，該類群硫酸天仙子胺和東莨菪內(nèi)酯含量均較低；第④類包括江西贛州、江西上高及新疆庫(kù)爾勒共3個(gè)種質(zhì)，該類群硫酸天仙子胺含量較低，東莨菪內(nèi)酯含量較高。

由分類結(jié)果可知，河南秋種顛茄草多集中在第②類，藥材質(zhì)量較好。

3 討論

顛茄草非傳統(tǒng)中藥材，其飲片在中醫(yī)臨床處方上使用較少?，F(xiàn)主要用作生產(chǎn)其中間體顛茄浸膏和顛茄流浸膏。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)含顛茄浸膏和顛茄流浸膏的制劑有20多個(gè)品種，200多家制藥企業(yè)，240多個(gè)注冊(cè)批準(zhǔn)文號(hào)。目前顛茄浸膏和顛茄流浸膏出口量呈上升趨勢(shì)，國(guó)內(nèi)需求也在不斷增加，然而顛茄草在種植時(shí)具有不能重茬的特性，不同產(chǎn)地環(huán)境下采收時(shí)間也不一致，其產(chǎn)量和質(zhì)量較難穩(wěn)定[9]。因此，顛茄草在良種選育、種植采收及質(zhì)量研究等方面都亟需研究。

對(duì)河南秋種顛茄草進(jìn)行多階段采樣分析并將其與其他產(chǎn)地顛茄藥材進(jìn)行對(duì)比，可為顛茄相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展與資源合理開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。在研究過程中，實(shí)驗(yàn)考察了滲漉、超聲及回流提取對(duì)顛茄草中硫酸天仙子胺及東莨菪內(nèi)酯含量的影響，發(fā)現(xiàn)超聲和滲漉提取率相當(dāng)，回流提取率較低，由于滲漉實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，故本實(shí)驗(yàn)采用的是超聲法。實(shí)驗(yàn)還考察了不同粒度(最粗粉、粗粉、中粉、細(xì)粉)顛茄粉末超聲處理對(duì)2種特征成分含量的影響，發(fā)現(xiàn)中粉超聲30 min 后提取率較高。

根據(jù)研究結(jié)果及顛茄草生長(zhǎng)狀態(tài)觀察，河南秋種顛茄草從5月下旬至6月上旬為快速生長(zhǎng)期，植株干質(zhì)量倍增，有效成分快速積累；6月中旬進(jìn)入成熟期，植株干質(zhì)量及有效成分積累均達(dá)到峰值；6月下旬開始進(jìn)入完熟及枯黃期，植株干質(zhì)量減少，有效成分含量呈現(xiàn)“先減后增”的趨勢(shì)，但增加之后仍低于峰值，原因可能是此階段種子逐漸成熟，成熟的種子極易掉落，同時(shí)植株下部葉子逐漸枯黃脫落，至7月初時(shí)葉子僅剩頂部少許，根據(jù)顛茄草不同部位對(duì)全草有效成分貢獻(xiàn)量(葉>莖>果>根)可知，葉子脫落對(duì)顛茄草藥材質(zhì)量影響較大。綜合研究結(jié)果來看，河南秋種顛茄草6月中旬采收為宜，采收時(shí)應(yīng)注意保持葉片完整性，避免其脫落影響藥材質(zhì)量。

不同產(chǎn)地顛茄草有效成分含量差異較大，原因可能與產(chǎn)地環(huán)境、田間管理方式、采收時(shí)間及引種品種四個(gè)方面有關(guān)。不同產(chǎn)地土壤、海拔及氣候環(huán)境等不同會(huì)影響藥材有效成分積累規(guī)律。不同產(chǎn)地種植戶在田間施肥、病蟲害防治等管理方式上的差異會(huì)影響藥材生長(zhǎng)方式及代謝產(chǎn)物。合理的采收時(shí)間也是影響顛茄藥材質(zhì)量的重要因素，采收過早，顛茄草植株小且有效成分含量低，質(zhì)量較差，采收過晚，顛茄草種子已全部成熟，會(huì)出現(xiàn)種子、葉子大量掉落，根部萎縮腐爛等情況，這些都直接影響顛茄草的產(chǎn)量和質(zhì)量。此外，由于顛茄草是從歐洲引種藥材，有些地區(qū)引種的品種可能發(fā)生了退化，從而影響藥材質(zhì)量。為促進(jìn)顛茄草相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈健康發(fā)展，在顛茄草種植過程中應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)田間管理，規(guī)范采收、加工、運(yùn)輸及儲(chǔ)存方式，保證藥材質(zhì)量。