歸芍方對鄰苯二甲酸二丁酯誘導(dǎo)的斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的影響*

李夢雨，華永慶，黃天一，鄭云楓，嚴(yán)國俊，程建明，袁曉琳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院，2.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心；3.中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，南京 210023)

視疲勞是指由于各種病因使人眼視物時(shí)超過其視覺功能所能承載的負(fù)荷，導(dǎo)致用眼后出現(xiàn)視覺障礙、眼部不適或伴有全身癥狀等以至不能正常進(jìn)行視作業(yè)的一組癥候群[1]。隨著信息化的發(fā)展以及人們生活方式的變化，視疲勞在各年齡群體中頗為常見，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。過度使用的視覺顯示終端及環(huán)境污染等因素可引起眼部細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，造成眼部細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致眼部疾病的產(chǎn)生[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為視疲勞屬“肝勞”范疇。臨床上根據(jù)本病病機(jī)肝腎兩虛、精血不足的特點(diǎn)，提出補(bǔ)益肝腎、益氣活血、通絡(luò)明目的治療原則，參照既往治療視疲勞經(jīng)驗(yàn)，擬歸芍方防治視疲勞。歸芍方源于元代倪維德之芎歸補(bǔ)血湯及現(xiàn)代陳達(dá)夫駐景丸加減方[4-5]，由當(dāng)歸、白芍、川芎、枸杞和菟絲子等5味中藥組成，具有補(bǔ)益肝腎的功效，主治肝腎兩虛、兩目昏暗。臨床觀察發(fā)現(xiàn)歸芍方具有較好的緩解視疲勞作用，然而其確切的藥理效應(yīng)尚待證實(shí)。

斑馬魚作為研究人類眼科疾病的模型之一[6]，其結(jié)構(gòu)、組織成分和生物信號方面與其他脊椎動(dòng)物相似，鑒于其實(shí)驗(yàn)周期短、胚胎透明、頭部眼球占比較大的特點(diǎn)顯著優(yōu)于兔、鼠、恒河猴等動(dòng)物，已被逐漸應(yīng)用于眼科相關(guān)疾病研究[7]。本研究采用斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡模型對歸芍方在體藥理作用進(jìn)行研究，同時(shí)，對可能引起藥理活性發(fā)生改變的不同提取方法與藥理作用間關(guān)系進(jìn)行了研究，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斑馬魚AB品系，購于凱基生物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2018-0004。飼養(yǎng)條件：晝夜節(jié)律，晝：夜=14 h：10 h；溫度(28.5 ± 0.5) ℃。飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格按照《江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)》實(shí)驗(yàn)用斑馬魚飼養(yǎng)技術(shù)條件。實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南》執(zhí)行。

1.1.2藥品與試劑 藥材飲片：當(dāng)歸(產(chǎn)地甘肅，批號：17071705)，炒白芍(產(chǎn)地安徽，批號：17091605)，川芎(產(chǎn)地四川，批號：17101814)，菟絲子(產(chǎn)地內(nèi)蒙古，批號：17081605)，枸杞子(產(chǎn)地寧夏，批號：17102112)。

提取物：當(dāng)歸提取物(批號：CDG-A-081908)，白芍提取物(批號：CBS-A-091802)，川芎提取物(批號：CCX-A-081109)，菟絲子提取物(批號：CTSZ-A-081118)，枸杞子提取物(批號：CGQ-A-081203)，以上提取物與藥材質(zhì)量比均為1：10，均購于陜西嘉禾生物科技股份有限公司。人參皂苷(ginsenoside，Rg1，含量≥98%，批號：B21057)，鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP；含量> 99.5%，批號：S51140)，鏈酶蛋白酶E(批號：721J041)、吖啶橙染液均購自上海源葉生物科技有限公司；MS-222(Acros Organics，批號：A0288328)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 Leica體式熒光顯微鏡(Leica公司，型號：M205FA)；生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，型號：SPX-150)；酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司，型號：SyneRgy2)；凝膠電泳儀(BIO-RAD公司，型號：1658033)；定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(Applied Biosystems公司，型號：7500)。

1.2方法

1.2.1藥物溶液的配制 歸芍方研究用樣品的制備。 ①歸芍方組成：當(dāng)歸、炒白芍各10 g，川芎、菟絲子、枸杞子各8 g。②歸芍方藥材飲片水提取物(Chinese material medicine extract，ME，批號：20180523)：按歸芍方，加水提取2次(7倍，5倍)，每次提取1.5 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至含生藥量0.1 g·mL-1，即得。③歸芍方藥材水提醇沉提取物(Chinese material medicine extract alcohol precipitation treatment，MEA，批號：20180523)：按歸芍方，加水提取2次(7倍，5倍)，每次提取1.5 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至1 g·mL-1，加乙醇至含醇量60%，放置24 h，濾過，濾液減壓濃縮至含生藥量0.1 g·mL-1，即得。④歸芍方提取物配方(Chinese medicine extract powder solution，PS，批號：20180502)：按歸芍方，按比例取各藥味提取物，加水制備成含生藥量0.1 g·mL-1的溶液，即得。上述歸芍方提取物采用高效液相色譜(HPLC)法，對不同提取方式樣品中的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)芍藥苷、阿魏酸進(jìn)行了含量測定，以保證不同提取方式樣品的質(zhì)量相對均一。

胚胎培養(yǎng)液配制：量取純水1000 mL，加氯化鈉溶液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率至550～580 μS·cm-1，然后加入0.1 mg·mL-1亞甲藍(lán)溶液1 mL，混合均勻，即得。

DBP溶液配制：稱取適量DBP，加入胚胎培養(yǎng)基混勻，得10 mmol·L-1DBP儲備液，使用時(shí)稀釋至所需濃度即可。

1.2.2存活率檢測 將挑選好的正常胚胎置于24孔板中，每孔12枚，分為5組，平行3次，加入胚胎培養(yǎng)基1.5 mL，從受精后30 h開始加入各濃度藥物(0，10，102，103，104μg·mL-1)1.5 mL，于給藥24 和48 h觀察胚胎存活數(shù)目，數(shù)據(jù)匯總后統(tǒng)計(jì)存活率。

1.2.3給藥方法 參照本課題組前述方法進(jìn)行[8]，將正常斑馬魚胚胎置于3塊6孔板中，給予胚胎培養(yǎng)基2 mL，飼養(yǎng)至受精后30 h，吸盡培養(yǎng)基；正常對照組每孔加入胚胎培養(yǎng)基2 mL，模型對照組每孔加入10 μmol·L-1DBP2 mL，給藥組每孔除加入20 μmol·L-1DBP1 mL外分別加入 ME、PS、MEA(200，100和20 μg·mL-1)1 mL，飼養(yǎng)18 h。吖啶橙染色并在體式顯微鏡下觀察眼部凋亡細(xì)胞，采集圖片并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.4圖片采集及數(shù)據(jù)處理 將胚胎放入有0.5 mg·mL-1蛋白酶E溶液的培養(yǎng)皿中，在室溫下放置8 min；當(dāng)胚胎有個(gè)別開始脫膜時(shí)，立即加入胚胎培養(yǎng)液稀釋終止脫膜，迅速將脫膜后的胚胎移入干凈的培養(yǎng)皿中，漂洗2次后，用5 μg·mL-1吖啶橙在暗室中染色1 h，接著用胚胎培養(yǎng)液漂洗3次，每次5 min，然后用0.04 mg·mL-1MS-222 溶液1 mL 麻醉5 min，置載玻片上于熒光顯微鏡下鏡檢攝像，眼部凋亡細(xì)胞呈綠色熒光，采用Image J軟件對斑馬魚眼部凋亡細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5免疫印跡(Western blotting)法檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2蛋白的表達(dá)量 收集給藥結(jié)束后斑馬魚胚胎，提取蛋白，二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA) 法測定蛋白濃度。免疫印跡法測定Bcl-2蛋白的表達(dá)量。Bcl-2一抗(稀釋比例1：1000)，4 ℃孵育過夜。常溫?fù)u床孵育兔二抗1 h，于數(shù)字化凝膠成像工作站曝光，Image Lab灰度值統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)凝膠成像結(jié)果檢測Bcl-2蛋白表達(dá)量。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測線粒體mtDNA 拷貝數(shù)的變化 本實(shí)驗(yàn)選擇線粒體mtDNA上的mt-cytb作為目的基因，單拷貝基因核基因GAPDH作為內(nèi)參。所使用的引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列 Tab.1 Sequences of primers

收集給藥結(jié)束后斑馬魚，漂洗結(jié)束后將幼魚分組吸入無酶EP管中，按照DNA快速抽提試劑盒說明書提取總DNA，稀釋DNA樣本至終濃度20 ng·μL-1。然后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對線粒體mtDNA上的mt-cytb基因以及單拷貝核基因GAPDH進(jìn)行定量，每組各3 個(gè)平行樣本。反應(yīng)結(jié)束后通過溶解曲線分析確定產(chǎn)物的特異性。采用2- ΔΔCt對PCR結(jié)果進(jìn)行相對定量分析。其中線粒體DNA拷貝數(shù)(mitochondrial DNA copy number，mtDNAcn)表示為mt-cytb基因與GAPDH基因表達(dá)的相對比值。

2 結(jié)果

2.1不同制備工藝歸芍方對斑馬魚存活率的影響 歸芍方不同提取物對斑馬魚存活率的影響，結(jié)果見圖1。給藥24 h后，104μg·mL-1MEA、PS顯著降低斑馬魚胚胎存活率(P<0.01)；給藥時(shí)間延長至48 h后，104μg·mL-1ME及103μg·mL-1PS開始表現(xiàn)出明顯的胚胎致死性(P<0.01)。其余濃度藥物給藥24 及48 h對胚胎存活率無顯著影響。

2.2不同制備工藝歸芍方對斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)合存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用無顯著影響的100 μg·mL-1及其以下濃度的歸芍方提取物來探究對斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的影響。在受精后30 h的斑馬魚培養(yǎng)基中加入10 μmol·L-1DBP與不同濃度ME、MEA、PS(10，50，100 μg·mL-1)共培養(yǎng)18 h。結(jié)果見圖2。與正常對照組比較，模型對照組斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加(P<0.01)。與模型對照組比較，1 μmol·L-1人參皂苷Rg1組斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著降低(P<0.01)；10 μg·mL-1MEA和PS組斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著降低(P<0.01)；100 μg·mL-1ME及中、高濃度MEA、PS組斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡數(shù)目均顯著降低(P<0.01)。提示3種歸芍方提取物均能拮抗斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡，且與ME組比較，PS和MEA組抗眼部細(xì)胞凋亡作用更為顯著。

①與48 h對照組比較，t=10.960～42.750，P<0.01；②與104 μg·mL-1ME(24 h)組比較，t=17.330，P<0.01；③與24 h 對照組比較，t=13.860，17.320，P<0.01；④與104 μg·mL-1 MEA(24 h)組比較，t=8.573，P<0.01；⑤與103 μg·mL-1 PS(24 h)組比較，t=8.552，P<0.01；⑥與104 μg·mL-1 PS(24 h)組比較，t=10.960，P<0.01。圖1 不同制備工藝歸芍方對斑馬魚存活率的影響①Compared with control group at 48 h，t=10.960—42.750，P<0.01；②Compared with 104 μg·mL-1 ME(24 h) group，t=17.330，P<0.01；③Compared with control group at 24 h，t=13.860，17.320，P<0.01；④Compared with 104 μg·mL-1 MEA(24 h) group，t=8.573，P<0.01；⑤Compared with 103 μg·mL-1 PS(24 h) group，t=8.552，P<0.01；⑥Compared with 104 μg·mL-1 PS(24 h) group，t=10.960，P<0.01.Fig.1 Effects of Guishao formula with different preparation processes on the survival rate of

2.3歸芍方對斑馬魚胚胎凋亡相關(guān)基因Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見圖3。與正常對照組比較，模型對照組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。與模型對照組比較，人參皂苷Rg1組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著提高(P<0.01)。與模型對照組比較，中、高濃度歸芍方顯著增加Bcl-2蛋白表達(dá)量(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果表明，歸芍方能夠有效提高DBP損傷后模型斑馬魚細(xì)胞凋亡相關(guān)Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而有效抑制細(xì)胞凋亡。

2.4歸芍方對斑馬魚胚胎線粒體mtDNA拷貝數(shù)的影響 結(jié)果見圖4，與正常對照組比較，模型對照組線粒體mtDNA拷貝數(shù)顯著降低(P<0.01)，給予不同濃度歸芍方后，線粒體mtDNA拷貝數(shù)均呈上升趨勢，其中100 μg·mL-1劑量組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明，歸芍方能夠有效升高凋亡細(xì)胞線粒體mtDNA拷貝數(shù)，對線粒體功能具有保護(hù)作用。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.人參皂苷Rg1組；D.10 μg·mL-1ME組；E.50 μg·mL-1ME組；F.100 μg·mL-1ME組；G.10 μg·mL-1MEA組；H.50 μg·mL-1MEA組；I.100 μg·mL-1MEA組；J.10 μg·mL-1 PS組；K.50 μg·mL-1 PS組；L.100 μg·mL-1 PS組；①與正常對照組比較，t=12.910，P<0.01；②與模型對照組比較，t=4.418～17.600，P<0.01；③與模型對照組比較，t=3.615，P<0.05。圖2 不同制備工藝歸芍方對斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的影響A.normal control group；B. model control group；C.ginsenosides Rg1 group；D.10 μg·mL-1 ME group；E.50 μg·mL-1 ME group；F.100 μg·mL-1 ME group；G.10 μg·mL-1 MEA group；H.50 μg·mL-1 MEA group；I.100 μg·mL-1 MEA group；J.10 μg·mL-1 PS group；K.50 μg·mL-1 PS group；L.100 μg·mL-1 PS group.①Compared with normal control group，t=12.910，P<0.01；②Compared with model control group，t=4.418—17.600，P<0.01；③Compared with model control group，t=3.615，P<0.05.

A.正常對照組；B.模型對照組；C.人參皂苷Rg1組；D.10 μg·mL-1歸芍方組；E.50 μg·mL-1歸芍方組；F.100 μg·mL-1歸芍方組；①與正常對照組比較，t=8.28，P<0.01；②與模型對照組比較，t=3.98，4.46，P<0.01；③與模型對照組比較，t=3.67，P<0.05。圖3 不同制備工藝歸芍方對斑馬魚Bcl-2蛋白表達(dá)的影響A.normal control group；B.model control group；C.ginsenosides Rg1 group；D.10 μg·mL-1 Guishao formula group；E.50 μg·mL-1 Guishao formula group；F.100 μg·mL-1 Guishao formula group；①Compared with normal control group，t=8.28，P<0.01；②Compared with model control group，t=3.98，4.46，P<0.01；③Compared with model control group，t=3.67，P<0.05.

3 討論

“肝勞”一詞最早見于唐朝孫思邈之《千金要方》，“讀書、博弈過度而傷目者，謂肝勞”。視疲勞關(guān)鍵之病機(jī)為肝腎兩虛，精血不足[9]。肝在體為目，在臟與肝、脾、腎密切相關(guān)，故提出“補(bǔ)益肝腎、益氣活血、通絡(luò)明目”的治療原則，擬定抗視疲勞歸芍方。方中當(dāng)歸、白芍為君藥，補(bǔ)血活血，養(yǎng)血平肝；川芎活血行氣為臣；枸杞益精明目為佐；菟絲子養(yǎng)肝明目為使。整方配伍重在整體調(diào)節(jié)，補(bǔ)益氣血，明目通絡(luò)，又滋而不膩，補(bǔ)而不滯。本研究對“養(yǎng)血平肝”見長的歸芍方緩解視疲勞的藥效進(jìn)行了考察，結(jié)果表明歸芍方能夠有效改善模型斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡，為歸芍方臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

斑馬魚作為一種便捷高效的體內(nèi)模型[10-11]，其胚胎發(fā)育迅速，易于形態(tài)學(xué)觀察，已逐漸被應(yīng)用于中藥藥效學(xué)研究[12]。斑馬魚與人類基因高度同源，基因相似度高達(dá)87%[13-14]。課題組前期建立DBP誘導(dǎo)斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡模型[8]，具備高效、穩(wěn)定等特點(diǎn)。本研究利用該模型對歸芍方3種不同提取物及不同濃度對斑馬魚眼部細(xì)胞的保護(hù)作用進(jìn)行考察。結(jié)果顯示ME、MEA和PS在較高濃度下均對斑馬魚眼部細(xì)胞具有保護(hù)作用；濃度降低后MEA和PS仍具有顯著抗凋亡作用。上述研究表明，本方標(biāo)準(zhǔn)化藥材飲片配方與藥材水提醇沉提取物具有相似活性，藥材水提物經(jīng)醇沉后，效應(yīng)成分并未丟失，且可能去除一些干擾性成分[15]。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.人參皂苷組；D.10 μg·mL-1歸芍方組；E.50 μg·mL-1歸芍方組；F.100 μg·mL-1歸芍方組；①與正常對照組比較，t=10.98，P<0.01；②與模型對照組比較，t=7.55，P< 0.01圖4 歸芍方對斑馬魚胚胎線粒體mtDNA拷貝數(shù)的影響A.normal control group；B. model control group；C.ginsenosides Rg1 group；D.10 μg·mL-1 Guishao formula group；E.50 μg·mL-1 Guishao formula group；F.100 μg·mL-1 Guishao formula group；①Compared with normal control group，t=10.98，P<0.01；②Compared with model control group，t=7.55，P< 0.01.

視疲勞發(fā)病機(jī)制與過度用眼，活性氧積累引起氧化應(yīng)激水平升高造成眼部細(xì)胞凋亡相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，歸芍方能夠顯著上調(diào)模型斑馬魚抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。線粒體功能對維持細(xì)胞生命活動(dòng)發(fā)揮重要作用，與細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)[17]。mtDNA是線粒體內(nèi)獨(dú)立的一種雙鏈DNA，是決定線粒體功能的重要因素之一[18]。mtDNA拷貝數(shù)的變化能夠影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究表明，歸芍方能夠有效提高線粒體mtDNA拷貝數(shù)，保護(hù)線粒體功能，該途徑可能與其發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用相關(guān)。

綜上所述，歸芍方具有顯著的抗模型斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的作用。采用DBP誘導(dǎo)斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡模型，對于中藥復(fù)方及不同提取物藥效評價(jià)具有靈敏、高效等特點(diǎn)。本研究為歸芍方臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可為其進(jìn)一步研究提供參考。