基于生物信息學(xué)方法構(gòu)建肝細胞癌鐵死亡相關(guān)基因預(yù)后風(fēng)險模型

郝 繼，柳科軍，2，牛一鳴，唐超峰，2，惠永峰，2，陳本棟，2，卜 陽，3

肝細胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性肝的惡性腫瘤，因復(fù)發(fā)和缺乏有效治療而預(yù)后不佳。目前，HCC已成為世界上第五大最常見的癌癥，死亡率位居第二位[1]。對于HCC患者的治療方法主要有手術(shù)切除、移植與靶向藥物治療等，但這些措施僅僅只對30%～40%的病人有效，剩余患者只適用于姑息與對癥治療，且肝細胞癌切除術(shù)后的5年復(fù)發(fā)率可達40%～70%[2-3]。盡管近年來新輔助化療、分子靶向藥物和免疫治療等綜合治療方式的發(fā)展提高了肝細胞癌的療效，但患者的遠期生存預(yù)后仍不樂觀。因此，需要更多較為敏感及可靠的預(yù)后指標(biāo)來監(jiān)測肝細胞癌的進展與評估患者的生存預(yù)后情況，從而為患者制訂個體化臨床診療策略提供可靠的依據(jù)。HCC的發(fā)生、進展及侵襲轉(zhuǎn)移的過程不僅與腫瘤細胞的病理特征有關(guān)，還受到腫瘤微環(huán)境及機體抗腫瘤免疫反應(yīng)的影響，這其中就包括了炎癥反應(yīng)對腫瘤微環(huán)境的影響。炎癥反應(yīng)能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞的激活增殖、逃避免疫抑制、抵抗細胞凋亡、無限復(fù)制、血管新生以及侵襲轉(zhuǎn)移，同時也能產(chǎn)生以活性氧自由基(ROS)為代表的化學(xué)物質(zhì)，從而進一步誘導(dǎo)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[4]。鐵死亡是一種不同于細胞凋亡、細胞壞死等死亡機制的細胞程序性死亡[5-6]。其發(fā)生的主要原因在于細胞內(nèi)Fe2+發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)脂質(zhì)ROS增加，脂質(zhì)過氧化水平的顯著升高，或者通過抑制谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)、胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體(Xc-system)等細胞內(nèi)主要的抗氧化機制，從而使細胞死亡[7-8]。研究表明，p62-Keap1-NRF2通路可以增加鐵或ROS代謝過程中的基因表達來保護HCC細胞免受鐵死亡，而索拉菲尼也被證實在HCC的鐵死亡中起到了重要作用，應(yīng)用索拉菲尼和Erastin共同處理肝細胞的癌細胞時，鐵死亡負調(diào)節(jié)因子Nrf2被抑制，成視網(wǎng)膜細胞瘤基因(RB)蛋白下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)在索拉菲尼導(dǎo)致的鐵死亡中，RB蛋白的水平起到了關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[9-10]。基于上述研究發(fā)現(xiàn)，本研究通過公共數(shù)據(jù)庫獲取鐵死亡相關(guān)基因的表達譜數(shù)據(jù)，探討鐵死亡相關(guān)基因與HCC癌患者生存預(yù)后之間的關(guān)系，并構(gòu)建預(yù)后模型，評估由鐵死亡相關(guān)基因構(gòu)成的預(yù)后模型對HCC患者生存預(yù)后的預(yù)測價值，有望為評估HCC患者的生存預(yù)后提供可靠的臨床參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集：本研究相關(guān)的HCC的基因表達圖譜及相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)均來自于TCGA(https：//portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫，去除臨床資料與生存資料不完整的數(shù)據(jù)，最終收集了360例患者的基因組圖譜、臨床病理及臨床資料。通過與TCGA數(shù)據(jù)庫中的基因表達譜取交集，最終從FerrDb(http：//www.zhounan.org/ferrdb/)數(shù)據(jù)庫納入了25個鐵死亡相關(guān)基因進行研究。TCGA與FerrDb的數(shù)據(jù)都是公開的，因此，我們的研究無須獲得當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)。此外，本研究遵循TCGA與FerrDb的數(shù)據(jù)訪問和使用準(zhǔn)則。

1.2 功能富集分析：采用Metascope在線數(shù)據(jù)庫對鐵死亡相關(guān)基因進行基因本體論(GO)分析和基因組百科全書(KEGG)分析，如無特殊標(biāo)注，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法:采用R軟件(V3.8.3)比較正常組織與腫瘤組織中鐵死亡相關(guān)基因的差異性表達，并繪制基因熱圖；采用PERSON相關(guān)分析以確定基因間的相關(guān)性；采用單因素COX和Lasso回歸分析構(gòu)建HCC的預(yù)后模型并將所有患者分為高風(fēng)險與低風(fēng)險2組，通過Kaplan-Meier曲線比較2組的總體生存率，使用受試者工作特征曲線(ROC)評估該模型的預(yù)測效果；采用多因素COX回歸分析確定影響HCC患者生存預(yù)后的獨立危險因素，并構(gòu)建列線圖模型(Nomogram圖)，繪制Calibration圖對列線圖的擬合情況和預(yù)測能力進行評估。

2 結(jié)果

2.1 HCC中鐵死亡相關(guān)基因的表達:與正常組織相比，其中22個鐵死亡相關(guān)基因(CISD1,ATP5MC3,GPX4,HSPB1,RPL8,ACSL4,HSPA5,EMC2,SLC7A11,CS,FANCD2,TFRC,SLC1A5,CARS1,ATL1,NFE2L2,NCOA4,LPCAT3,FDFT1,DPP4,MT1G,SAT1,CDKN1A,GLS2,ALOX15)在HCC組織中顯著上調(diào)(圖1，封二)。Pearson相關(guān)分析表明，25個基因之間存在相關(guān)性。其中，LPCAT3與NCOA4相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)為0.64；NFE2L2和LPCAT3，NFE2L2和NCOA4也有較強的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別為0.58和0.61(圖2，封二)。

2.2 功能富集分析:GO富集分析和KEGG通路分析差異表達的鐵死亡相關(guān)基因的生物學(xué)功能和機制。在GO基因富集中，可以得出鐵死亡的相關(guān)基因在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡、對伽馬射線的反應(yīng)及谷胱甘肽代謝等生物過程中明顯富集，在線粒體外膜、細胞色素及黑素體等細胞成分中富集；此外，在分子功能水平，主要富集于Hijacked molecular function、Virus receptor activity和Protein binding involved in protein folding等；在KEGG功能富集分析，差異表達基因在與腫瘤代謝等相關(guān)通路中是明顯富集的(圖3，封二)。

2.3 Lasso、COX模型的構(gòu)建:單因素COX回歸分析鐵死亡相關(guān)基因與HCC患者總體生存率的相關(guān)性，得到了6個與OS顯著相關(guān)的差異表達基因(P<0.05)(圖4a，封二)；同時構(gòu)建Lasso、COX模型：0.128*CARS1+0.148*FANCD2+0.173*SLC1A5+0.227*SLC7A11，計算出肝細胞癌患者的風(fēng)險評分，依據(jù)風(fēng)險評分的中位值將所有肝細胞癌患者分為高風(fēng)險組與低風(fēng)險組(圖4b-d，封二)。K-M生存分析結(jié)果表明，低風(fēng)險組總體生存期比高風(fēng)險組長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4e，封二)。ROC曲線結(jié)果顯示，1年、3年和5年生存率的曲線下面積分別為0.765、0.673和0.687(圖4f，封二)。

2.4 鐵死亡基因的預(yù)后價值及列線圖的構(gòu)建:單因素COX回歸分析顯示，T分期(HR=2.598，95%CI:1.826～3.697，P<0.05)、病理分期(HR=2.504，95%CI:1.727～3.631，P<0.05)及風(fēng)險評分(HR=10 806，95%CI:1.272～2.564，P<0.05)與肝細胞癌患者的總體生存率顯著相關(guān)；多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，鐵死亡相關(guān)基因的風(fēng)險評分(HR=1.833，95%CI:1.257～2.673;P<0.05)是影響HCC患者總體生存率的獨立危險因素(P<0.05)。最終，將T分期、病理分期、性別、年齡、BMI、AFP、CHILD分級及血管浸潤等納入Nomogram圖中構(gòu)建出評估預(yù)后的風(fēng)險評分模型。通過Nomogram圖可以對模型中的每個變量進行評分，然后將所有變量的得分相加，得到總分后，根據(jù)總分向下繪制垂直線，就可以得出HCC患者的1年、3年及5年生存率(圖5a，目錄后)。同時，諾莫列線圖及校準(zhǔn)曲線均提示，本預(yù)后模型有較好的預(yù)測能力(C指數(shù)為0.709，P<0.05)，見表1與圖5b(封三)。

表1 影響HCC癌患者術(shù)后生存預(yù)后因素的COX比例風(fēng)險模型評估

3 討論

肝癌是一種高度異質(zhì)性的疾病，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率仍然較高且預(yù)后相對較差，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。長期以來，大量的分子生物標(biāo)志物如miRNA、蛋白編碼基因、長鏈非編碼RNA、甲基化基因啟動子等被證實在HCC患者中異常表達，其中大多數(shù)具有潛在的臨床應(yīng)用價值[11]。然而，由于HCC發(fā)病機制的復(fù)雜性，涉及細胞周期調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多基因在多個階段的相互作用[12]。通過篩選與腫瘤形成、進展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)，建立新的HCC預(yù)后模型來提高肝細胞癌患者的個體化預(yù)后預(yù)測的準(zhǔn)確度，并對肝細胞癌患者的治療提供了一定的指導(dǎo)意義。目前，肝臟鐵超載被人們普遍認為是引起肝臟疾病的主要原因之一，鐵死亡可能在HCC的惡性進展中充當(dāng)著重要角色。與細胞凋亡、壞死和焦亡不同，鐵死亡是一種氧化性、鐵依賴的細胞死亡形式，是一種受調(diào)控的被動細胞死亡形式，在肝癌、肝纖維化、肝衰竭、肝缺血-再灌注損傷、非酒精性脂肪變性等多種肝臟疾病中，鐵死亡引起了廣泛的關(guān)注[13]。在肝細胞特異性Trf基因敲除的小鼠中，喂養(yǎng)高鐵飲食增加了它們對鐵死亡引起的肝纖維化的脆弱性，而鐵抑制劑可使上述癥狀恢復(fù)正常[14]。一項動物實驗表明，鐵死亡是非酒精性脂肪性肝炎的誘導(dǎo)劑，可導(dǎo)致肝損傷、免疫細胞浸潤和炎癥反應(yīng)[15]，同時介導(dǎo)了對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝衰竭[16]。此外，由于癌細胞的代謝比較旺盛，線粒體易出現(xiàn)功能障礙，從而可以導(dǎo)致癌細胞內(nèi)ROS積累較多，對鐵死亡的敏感性增加。癌細胞可以通過超氧化物歧化酶(SOD)、GPX4和過氧化氫酶等應(yīng)激反應(yīng)和激活抗氧化機制來清除細胞內(nèi)積累的ROS，以達到防止ROS對自身造成損傷的效果[17]。因此，鐵死亡相關(guān)基因?qū)τ趷盒阅[瘤的治療與預(yù)后具有重大意義。本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘和分析，篩選出的4個鐵死亡相關(guān)基因(SLC1A5、SLC7A11、FANCD2、CARS1)組成的預(yù)后模型對肝細胞癌預(yù)后有較好的預(yù)測價值，有望對肝細胞癌患者治療及生存預(yù)后的早期評估提供一定的指導(dǎo)意義。

溶質(zhì)載體家族1成員5(SLC1A5)是一種依賴鈉離子的轉(zhuǎn)運蛋白，被證實在HCC組織中顯著增加，可通過增強腫瘤細胞對谷氨酰胺的攝取能力以促進HCC細胞的增殖[18]。在Erastin和Rsl3誘導(dǎo)的鐵死亡中，谷氨酰胺代謝可誘導(dǎo)脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生并促進細胞死亡[19]。MiR137或小分子抑制劑對SLC1A5的抑制能強烈抑制谷氨酰胺分解而導(dǎo)致鐵細胞死亡[20]。SLC1A5介導(dǎo)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運在腫瘤細胞代謝、增殖和鐵死亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，阻斷SLC1A5可以成功阻止黑色素瘤[21]、非小細胞肺癌[22]、前列腺癌[23]和急性髓系白血病[24]中的腫瘤細胞增殖。SLC7A11可以與SLC3A2共同組成胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體(Xc-system)，可將細胞內(nèi)谷氨酸與細胞外的半胱氨酸進行轉(zhuǎn)換并用來合成谷胱甘肽。而GPX4是一種重要的抗氧化酶，可以將脂質(zhì)過氧化物還原為脂醇，當(dāng)GPX4受到影響時可增加細胞的氧化應(yīng)激，所以通過抑制Xc-system或GPX4，可以使細胞內(nèi)過氧化物增加，從而導(dǎo)致鐵死亡，可能為治療癌癥提供新的治療途徑[25-27]。同時，索拉非尼被證實，通過抑制Xc-system而增加氧化應(yīng)激對肝細胞癌細胞的細胞毒性作用，誘導(dǎo)肝細胞癌細胞發(fā)生鐵死亡[28]。此外，SLC7A11的下調(diào)最終導(dǎo)致細胞內(nèi)胱氨酸水平的喪失以及隨后的谷胱甘肽生物合成的耗損，從而間接抑制GPx4的活性并激活鐵死亡[29]。SLC7A11的高表達可抑制細胞內(nèi)ROS水平，而通過抑制SLC7A11在細胞內(nèi)的表達來誘導(dǎo)鐵死亡，被證實可能是抑制突變小鼠腫瘤發(fā)展的機制之一[30]。研究表明[31]，范可尼貧血(FA)通路參與細胞DNA損傷修復(fù),范可尼貧血蛋白(FANCD2)缺陷細胞對乙醛暴露的敏感性較高，在含有FANCD2基因缺陷的小鼠中也可觀察到這種現(xiàn)象。進一步研究發(fā)現(xiàn)，向細胞系中添加乙醛，刺激了移除DNA鏈間交聯(lián)所必需的FANCD2單泛素化作用。FANCD2和FANCI的單泛素化形成FANCD2-FANCI異二聚體，結(jié)合到DNA上可將其他DNA修復(fù)因子引入DNA鏈間交聯(lián)[32]。因此，具有FANCD2突變體的小鼠可以發(fā)展為急性白血病[31]。此外，β2-蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)的轉(zhuǎn)錄輔助因子，通過激活FANCD2在肝細胞中修復(fù)酒精誘導(dǎo)的DNA損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[33]。當(dāng)TGF-β/β2蛋白信號通路受到抑制時，F(xiàn)A-DNA修復(fù)通路可能出現(xiàn)缺陷。當(dāng)FA-DNA修復(fù)通路出現(xiàn)缺陷后，需要非同源端連接(NHEJ)和替代非同源端連(Alt-NHEJ)來確定FA-DNA修復(fù)通路失效后乙醛誘導(dǎo)的小鼠造血系統(tǒng)DNA損傷情況[34]。FA途徑的作用不能被取代，因為NHEJ途徑誘導(dǎo)了隨后的誘變修復(fù)和可選末端連接。ALDH2缺陷的FA患者胚胎發(fā)育不良、造血干細胞功能障礙和癌癥易感性加重[31，34]。KOMATSU[35]等的研究表明，F(xiàn)ANCD2在肝細胞癌組織中的表達上調(diào)，且較高的FANCD2表達預(yù)示著較差的總體生存率；FANCD2被認為是肝細胞癌患者腫瘤侵襲性的標(biāo)志和預(yù)后不良的因素，可能是一個潛在的治療靶點。通過抑制CARS1的表達，可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)硫途徑代償性增加，進而導(dǎo)致半胱氨酸的增加，抑制Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[36]。本研究提示，SLC7A11、FANCD2、CARS1及SLC1A5可能與肝細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤細胞代謝相關(guān)，因此這4個基因呈現(xiàn)高表達的肝細胞癌患者多存在腫瘤易早期侵襲轉(zhuǎn)移、生存預(yù)后差等特點，故在本模型中所預(yù)測的預(yù)后更差。運用Cox比例風(fēng)險模型分析也顯示鐵死亡相關(guān)基因風(fēng)險評分預(yù)后模型是影響肝細胞癌患者術(shù)后總生存時間的獨立預(yù)測因素，諾莫列線圖及校準(zhǔn)曲線圖也證實了我們構(gòu)建的預(yù)后模型具有良好的預(yù)測能力。由此可見，鐵死亡相關(guān)基因可作為肝細胞癌的預(yù)后標(biāo)記物。

此外，為了進一步探索鐵死亡相關(guān)基因在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，對肝細胞癌組織中差異表達基因進行GO分析和KEGG分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達基因就主要富集于谷氨酰胺代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程及線粒體與細胞色素等細胞成分。這些途徑在腫瘤進展中起著重要的作用，氧化應(yīng)激感受蛋白Pirin被證實與上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)移而促進腫瘤轉(zhuǎn)移的機制有關(guān)[37]。GPX4受到影響時可直接增加細胞的氧化應(yīng)激并誘導(dǎo)細胞鐵死亡，比如索拉非尼被證實可以通過抑制GPX4增加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肝細胞癌細胞發(fā)生鐵死亡[28，38],而來源于線粒體的ROS被證實可能參與了半胱氨酸減少所導(dǎo)致的肝細胞癌細胞鐵死亡[39]。此外，JANA[40]等的研究表明與正常組織相比，肝細胞癌組織中的細胞色素p450表達明顯下調(diào)，且肝細胞癌患者更容易收到藥物毒性的影響，對藥物治療如索拉菲尼更加敏感。由此可以得出，鐵死亡可能通過這些途徑參與了肝細胞癌的惡性進展，鐵死亡相關(guān)基因可能是肝細胞癌的預(yù)后預(yù)測因子和治療靶點。

本研究也存在一定的局限性，研究基于TCGA的個體來源，沒有獨立隊列的驗證，缺少外部數(shù)據(jù)集的驗證，還需要更多的實驗室研究來進一步驗證這些發(fā)現(xiàn)。但通過對25個最重要的鐵死亡相關(guān)基因進行了全面的生物學(xué)分析，比以往單個基因?qū)膊∮绊懙难芯扛鼮槿妗?/p>

綜上所述，本研究初步表明，鐵死亡相關(guān)基因的表達水平在HCC的進展中發(fā)揮了重要作用，同時，我們成功構(gòu)建出基于鐵死亡相關(guān)基因的肝細胞癌預(yù)后模型，對肝細胞癌患者的個體化治療提供理論依據(jù)，并提高了肝細胞癌患者的生存預(yù)后預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確度。